Identifizierung und Charakterisierung von neuen Genen für die ...

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Farbstoff oxidiert werden kann, einem halogenierten Indigo-Derivat, das unlöslich ist und präzipitiert.
Dimerisierung und Oxidation erfordern den Transfer eines Elektrons durch einen Elektronenakzeptor mit
passendem Redoxpotential. Die der Färbelösung zugesetzten Kationen Fe 3+ (Eisen(III)/„Ferri“) und Fe 2+
(Eisen(II)/„Ferro“) erfüllen diese Funktion.
Die Fixierdauer sollte nicht übertrieben werden, da Überfixierung die Enzymaktivität vermindert.
Zur Vermeidung von Hintergrundfärbung durch endogene β-Galactosidase-Aktivität aus Lysosomen der
Säugerzellen sollte der pH bei 7,2 (PBS) und die Reaktionstemperatur von 30°C eingehalten werden, da
das lysosomale Enzym nur bei geringem pH aktiv ist.
Protokoll für Cryo-Schnitte
Objektträger mit den Gewebeschnitten wurden aus -70°C Lagerung genommen und 20 min bei 37°C
trocknen gelassen. Es wurde wie im Protokoll für Whole-Mounts beschrieben verfahren, jedoch ohne die
dortige Fixierungsprozedur. Es genügte die zur Präparation von Cryo-Schnitten übliche Fixierung in 4%
PFA ÜN mit anschließender Behandlung in 25% Sucrose bis zum Absinken vor dem Einbetten in Tissue
Freezing Medium ® . Die aufgetauten Cryo-Schnitte wurden nicht nachfixiert, optional wäre eine Fixierung
von 5-15 min in Fix A oder Fix B. Die weiteren Schritte waren analog zum Protokoll für Whole-Mounts,
allerdings ohne abschließenden Aufklärungsschritt in Glycerol. Die Objektträger wurden stattdessen
getrocknet, mit einigen Tropfen Vectashield H-1300 versehen und mit Deckgläschen bedeckt.
Protokoll für Doppelfärbung lacZ + Immunhistochemie
Zuerst erfolgte die lacZ-Färbung nach dem Protokoll für Cryo-Schnitte – von entweder heterozygotem
oder homozygotem lacZ-transgenem Gewebematerial – für 1 bis 3 Tage bei 30°C. (Optional wurde die
lacZ-Färbelösung aus der Küvette gegossen bis nur noch ca. 1/5 der ursprünglichen Menge als Rest übrig
blieb, und die teilweise jetzt an der Luft freiliegenden Cryo-Schnitte wurden für 1 Tag bei 30°C weiter
inkubiert.) Anschließend Immunfärbung nach dem dortigen Protokoll für Cryo-Schnitte, Beginn mit
Waschen in PBS. Die Objektträger wurden getrocknet, mit einigen Tropfen Vectashield H-1000 versehen
und mit Deckgläschen bedeckt.
Protokoll für Whole-Mount-Embryonen oder Gehirne
Embryonen oder Gehirne wurden unmittelbar nach der Präparation aus den lebenden Tieren verwendet.
Fixierung: Fixierdauer und Fixativ je nach Alter.
Gewebe Alter Fixierdauer [min] Fixativ
Embryo E9,5 30 Fix A
Embryo E10,5 30 Fix A
Embryo E11,5 50 Fix A
Embryo E12,5 50 Fix A
Embryo E13,5 30, Embryo halbieren, 30 Fix A, Fix A
Embryo E15,5 30, Embryo halbieren, 30 Fix A, Fix B
Gehirn P0-7 30, zu 100 μm schneiden, 30 Fix B
Gehirn P7-10 30, zu 100 μm schneiden, 60 Fix B
Gehirn P10+ 45, zu 100 μm schneiden, 60 Fix B
Fixierung erfolgte auf Eis oder 4°C unter Schwenken.
Schneiden mittels Rasierklinge unter Arretierung der Gewebe in einer Schale.
Waschen: 2 x 20 min PBS bei RT.
Färben: In x-Gal-Färbelösung unter Lichtausschluss bei 30°C ÜN oder mehrere Tage
bis Färbung sichtbar wurde.
Waschen: 2 x 15 min PBS.
Aufklären: Aufsteigende Glycerolreihe, alle 6 bis 24 h pro Schritt (20%, 40%, 60%, 80%
Glycerol in PBS).