Identifizierung und Charakterisierung von neuen Genen für die ...

tischen Retikulums, aber auch die sauren
Glykosaminoglykane des hyalinen Knorpels
anlagern. Die eigentliche tiefblaue Färbung
der Kerne wird durch Einstellen des pH>3
mittels Leitungswasser erreicht, was zu
einem Indikatorumschlag führt.
Eosin ist ein negativ geladener Farbstoff, der
zur Gegenfärbung dient. Er färbt alle übrigen
Strukturen in verschiedenen Rot-Tönen,
indem es sich an die positiven Gruppen von
z.B. Eiweißen mittels elektrostatischer
Adsorption bindet.
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HO O
Protokoll für Paraffinschnitte
Objektträger mit den Gewebeschnitten wurden aus Lagerung bei RT genommen.
Entparaffinierung: 3 x 5 min in Histoclear.
Rehydrierung: Absteigende Ethanolreihe von je 4 min 100%, 90%, 70%, 50% Ethanol,
100% Millipore-H2O.
Färbung: 8 – 15 min filtrierter Hämatoxylinlösung nach Harris.
Waschen: 3 x 3 min mit Millipore-H2O.
Entfärbung: 15 s in HCl-Alkohol-Lösung (500 ml 70% Ethanol + 5 ml konzentrierte HCl
(37%)).
Neutralisierung: 1 min mit Millipore-H2O, dann 7 min Millipore-H2O.
Gegenfärbung: 2 – 5 min in 0,1% Eosin-Lösung (0,1 g Eosin + 500 ml Millipore-H2O +
150 μl Eisessig).
Entfärbung und
Dehydrierung: Aufsteigende Ethanolreihe von je 2
min 50%, 70%, 90%, 100%, 100%
Ethanol. Anschließend 3 x 3 min in
Histoclear.
Die Objektträger wurden abgetrocknet, mit einigen Tropfen
Eukitt versehen und mit Deckgläschen bedeckt. Das
Eindeckungsmedium sollte nicht wasserlöslich sein, um
Ausfärbungen des Eosins zu vermeiden.
β-Galactosidase-Enzymhistochemie (lacZ-
Färbung)
Die Färbung diente zum Nachweis der Enzymaktivität von β-
Galactosidase (lacZ) aus E. coli, die in Geweben von
Säugetieren nicht vorkommt, aber als Reporter-Transgen für
einen Maus-Knock-out eingesetzt werden kann. Die
physiologische Funktion des Enzyms ist die hydrolytische
Spaltung von Lactose in Galactose und Glucose.
Statt Lactose wird zur Färbung 5-Bromo-4-Chloro-3-Indolylβ-D-Galaktopyranosid
(X-Gal) eingesetzt. Durch die
Hydrolyse wird das zunächst farblose Indoxylmonomer
freigesetzt, das sich zu einem Dimer zusammenlagert,
welches schließlich nicht-enzymatisch zu einem blauen
O
O
OH
5
6
COOH
7'
2'
6'
3'
HO
5'
O
4'
O
Abbildung 153: Fluorescein in seiner Lacton-Form (links) bzw.
offenen Form (rechts). Eosin ist das Natriumsalz des 2',4',5',7'-
Tetrabromfluoresceins.
Br
Br
CH2OH
OH O
OH
β-Galactosidase
Cl
Cl
H
N
OH
H
N
O
OH
O
NH
HO
N
H
O
N
H
Cl
Cl
5,5'-dibromo-4,4'-dichloro-Indigo
Br
4
Galactose
Br
5-bromo-4-chloro-3-
Indolyl-β-D-Galactose
(X-Gal)
Cl
Br
5-bromo-4-chloro-indoxyl
nicht-enzymatische
Dimerisierung und
Oxidation
3