Identifizierung und Charakterisierung von neuen Genen für die ...

Histologie
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Anfertigung von Cryo-Schnitten
Für Cryo-Schnitte wurden embryonale Gehirne, ganze Embryonen oder einzelne Organe adulter Tiere 2 h
oder ÜN in kaltem PFA (4 % in PBS) fixiert, zweimal 30 min in kaltem PBS gewaschen und ÜN bei 4 °C
in 25 % Sucrose in PBS so lange inkubiert, bis die Proben in der Sucrose-Lösung auf den Boden
absanken, was zum Schutz gegen Gefrierartefakte diente. Das Einfrieren erfolgte in Einbettmedium (Leica
Instruments) auf Trockeneis in entsprechenden Plastik-Passformen. Gefrierschnitte wurden am Cryostaten
(S3000, Leica Instruments) angefertigt und auf beschichtete Objektträger (SuperFrost Plus, Menzel-
Gläser) aufgeschmolzen. Je nach Gewebe wurden Schnittdicken von 12-35 μm angefertigt.
Anfertigung von Paraffinschnitten
Embryonale oder adulte Gehirne, ganze Embryonen oder einzelne Organe adulter Tiere wurden isoliert,
ÜN in kaltem PFA (4 % in PBS) fixiert und jeweils 3 h bei 4 °C in PBS und 0,86 % NaCl gewaschen,
wobei die Lösungen jeweils 3 Mal gewechselt wurden. Das Gewebe wurde in aufsteigender Ethanol- und
Lösungsmittel-Reihe entwässert, dreimal über Nacht mit flüssigem Paraffin (Tycon health care) infiltriert
und in Paraffin mit entsprechenden Förmchen eingebettet. Paraffinschnitte wurden am Mikrotom (Leica
Instruments) angefertigt und auf beschichtete Objektträger (SuperFrost Plus, Menzel-Gläser)
aufgenommen. Je nach Gewebe wurden Schnittdicken von 10-20 μm angefertigt.
Aufsteigende Ethanol- und Lösungsmittel-Reihe zur Gewebeentwässerung:
Ethanol 50% 2 x 15 min, Ethanol 70%, 2 x 15 min, Ethanol 80% 3 x 20 min, Ethanol 90% 3 x 30 min,
Ethanol 96% 4 x 30 min, Ethanol 100% 5 x 20 min, Isopropanol ÜN bei 4 °C, Toluol : Isopropanol (25% :
75%) 30 min, Toluol : Isopropanol (50 % : 50 %) 30 min, Toluol : Isopropanol (75 % : 25 %) 30 min,
Toluol 3 x 60 min, 3 x ÜN in flüssigem Paraffin (Paraplast).
Hämatoxylin-Eosin-Färbung
Die H.E. - Färbung ist die gebräuchlichste Übersichtsfärbung, die Zellkerne und zytoplasmatische
Bestandteile darstellt. Dabei werden Zellkerne blau und das Zytoplasma rot angefärbt, je nach Gewebetyp
in unterschiedlicher Intensität.
Hämatoxylin ist ein farbloser
Pflanzenfarbstoff, welcher durch Alkoholextraktion
aus Blauholz gewonnen wird.
Durch Oxidation (Dehydrierung) an Raumluft
wird Hämatoxylin in den Farbstoff
Hämatein überführt. Über Zugabe von
Alaunen (KAl(SO4)2 · 12 H2O, Hämatoxylinlösung
nach Harris) entstehen bei pH