Identifizierung und Charakterisierung von neuen Genen für die ...

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8. Das Pellet wurde in 40 ml GST-Resuspensionspuffer (siehe Seite 150) gelöst und das Gefäß dabei
auf Eis gekühlt.
9. Die Bakterienzellen wurden durch Ultraschall aufgebrochen (Branson Sonifier Disruptor B15,
Einstellung Output 7 und 50% Arbeitszyklus), dabei in ihrem Gefäß zur Kühlung auf Eis
gehalten. Die Prozedur wurde 5 Mal für jeweils 1 Minute durchgeführt.
10. Ultrazentrifugation der Suspension bei 25000 rpm und 4°C für 25 min in einer Beckmann L7
Ultrazentrifuge.
11. Der Überstand wurde zu 500 μl vorgewaschenen (siehe Kapitel GST-Pulldown-Essay) Glutathion-
Sepharose Beads 4B (Amersham) gegeben und unter Rotation bei 4°C für 1 h inkubiert.
12. Die Suspension wurde bei 800 rpm und 4°C für 1 min zentrifugiert und der Überstand verworfen.
13. Das Pellet wurde 2 Mal mit 15 ml vorgekühltem GST-Waschpuffer (siehe Seite 150) gewaschen
und dazu jeweils bei 800 rpm und 4°C für 1 min zentrifugiert, der Überstand verworfen.
14. Die Beads wurden in 5 ml GST-Wasch-Puffer resuspendiert und in eine 5 ml Säule (Pierce)
überführt, deren Fritte die Beads einfach bei den folgenden Waschungen zurückhalten sollte. In
der Säule wurden die Beads mit weiteren 4 ml GST-Wasch-Puffer gewaschen.
15. Das GST-Fusionsprotein wurde von den Beads eluiert durch Zugabe von 1,2 ml 20 mM
Glutathion (Sigma) und Inkubation bei 4°C unter Rotation für 1 h. Das Eluat wurde aufgefangen.
16. Nochmalige Elution mit 2 ml 20 mM Glutathion und Inkubation bei 4°C unter Rotation für 1 h.
17. Die Proteinkonzentration wurde mittels Bradford-Assay bestimmt und Aliquots des gereinigten
Proteins in flüssigem Stickstoff schockgefroren und bei -80°C aufbewahrt.
Bradford-Assay zur Proteinkonzentrationsbestimmung
Die Proteinkonzentration wurde mittels des Bradford-Assays der Firma Bio-Rad bestimmt. Hierzu wurden
1 μl Proteinlösung mit 800 μl H2O und 200 μl Bradford-Reagenz gemischt. Nach Inkubation von 10 min
wurde die OD595 bestimmt und die Konzentration anhand einer Eichkurve mit bekannten Proteinkonzentrationen
(abgewogene oder abpipettierte Mengen von BSA-Protein) bestimmt.
In-vitro-Transkription und Translation
Es wurde nach den Angaben des Herstellers Promega in seinem „TnT ® Coupled Reticulocyte Lysate
System“ verfahren.
SDS-PAGE
Es wurde eine Mini-Protean II Gelapparatur der Firma Bio-Rad verwendet und den beiliegenden Instruktionen
gefolgt. Die Proben wurden in einem denaturierenden Proteingel nach Laemmli aufgetrennt
(Laemmli 1970). Dazu wurde in der BIORAD-Gießapparatur ein 12,5%-iges Trenngel gegossen und mit
Wasser überschichtet. Nach dem Polymerisieren des Gels wurde das Wasser abgegossen und ein 5%iges
Sammelgel zusammen mit einem Kamm zum Formen der Taschen überschichtet. Nach dem Polymerisieren
des Sammelgels wurde der Kamm herausgezogen und das Gel in die Gelkammer gesetzt. Als
Laufpuffer wurde Laemmli-Puffer (siehe Seite 150) verwendet. Die Proben wurden mit 2x Ladepuffer
(siehe Seite 150) versetzt und für 5 min bei 95°C denaturiert. Nach kurzer Abkühlung auf Eis wurden die
Proben und ein Proteinmarker (Precision Plus Protein Standard von BIORAD) geladen und für 3-4 h bei
60 V aufgetrennt bis die Lauffront den unteren Rand des Gels erreicht hatte. Puffer und Gelzusammensetzungen
siehe ab Seite 150).