Identifizierung und Charakterisierung von neuen Genen für die ...

GST-Pulldown-Essay
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1. 50 μl Glutathion Sepharose 4B Beads (Amersham) wurden mit 500 μl GST-Bindepuffer (siehe
Seite 150) gewaschen, bei 4.000 rpm in einer Tischzentrifuge kurz herunterzentrifugiert und der
Überstand verworfen.
2. Die vorgewaschenen Beads wurden mit 50 μg rekombinantem GST-Fusionsprotein bzw. reinem
GST als Kontrolle in 500 μl GST-Bindepuffer bei 4°C unter Rotation ÜN inkubiert.
3. Die Beads wurden kurz herunterzentrifugiert und mit 500 μl GST-Bindepuffer bei 4°C unter
Rotation für 3 min gewaschen, um ungebundenes Protein zu entfernen.
4. Die Beads wurden herunterzentrifugiert und der Überstand verworfen.
5. 45 μl des in-vitro-Transkriptions- und Translations-Produktes wurden zu den mit GST-Fusionsprotein
bzw. nur mit GST gekoppelten Beads gegeben und in 500 μl GST-Bindepuffer bei 4°C
unter Rotation für 1 - 2 h inkubiert. 5 μl des in-vitro-Transkriptions- und Translations-Produktes
wurden als Kontrolle mit 2x SDS Ladepuffer (siehe SDS-PAGE) bei 95°C für 5 min erhitzt.
6. Die Beads wurden herunterzentrifugiert, der Überstand verworfen und die Beads 2 Mal mit GST-
Bindepuffer bei 4°C unter Rotation für jeweils 3 – 5 min gewaschen.
7. Die Beads wurden herunterzentrifugiert, der Überstand verworfen und die Beads 2 Mal mit GST-
Reinigungspuffer (siehe Seite 150) bei 4°C unter Rotation für jeweils 3 – 5 min gewaschen.
8. Die Beads wurden herunterzentrifugiert und der Überstand verworfen.
9. Das Protein wurde von den Beads eluiert mit 40 μl 2x SDS Ladepuffer (siehe SDS-PAGE) unter
Erhitzung auf 95°C für 5 min.
10. Die Beads wurden abzentrifugiert und der Überstand mit dem Eluat entnommen, davon 20 μl auf
ein SDS-Gel aufgetragen zusammen mit den zuvor entnommenen Kontrollen.
11. Das Gel wurde auf ein Whatman-Papier gelegt und mit einem Vakuumgeltrockner von Biometra
bei 60°C für 3 h getrocknet.
12. Das trockene Gel wurde in einer lichtdichten Kassette auf einem Whatman-Papier fixiert und
damit Röntgenfilm (BioMax, Kodak) bei -70°C ÜN oder mehrere Tage belichtet.
13. Der Autoradiographie-Film wurde mit einer Curix 60 Entwicklermaschine der Firma Agfa
entwickelt.
Affinitätsaufreinigung eines rekombinant exprimierten GST-Fusionsproteins
1. Die cDNA mit der zu exprimierenden Sequenz wurde in pGEX-KG-Vektor so einkloniert, dass
sie im fortlaufenden Leseraster mit GST stand.
2. Das pGEX-KG-cDNA-Konstrukt wurde per Hitzeschock-Transformation in kompetente E. coli
Bakterien des Stammes BL21 DE3 C41 gebracht und zur Selektion ausplattiert (Ampicillin). Eine
einzelne Kolonie wurde in 100 ml LB-Medium zu 50 μg/ml Ampicillin bei 37°C ÜN geschüttelt.
3. Das Gefäß wurde mit vorgewärmtem LB-Medium zu 50 μg/ml Ampicillin auf 1 l Volumen aufgefüllt.
Inkubation erfolgte so lange weiter, bis die OD600 bei 37°C unter Schütteln einen Wert von
0,7 bis 0,8 erreichte (ca. 1 h).
4. Die Proteinexpression auf dem pGEX-KG-Vektor wurde durch Zugabe von IPTG zu einer
Endkonzentration von 1 mM induziert. Inkubation wurde jetzt bei 25°C unter Schütteln fortgesetzt
für ca. 6 h (alternativ bei 37°C für 2 h).
5. Zentrifugation bei 5000 rpm und 4°C für 25 min zur Ernte der Zellen.
6. Der Überstand wurde verworfen und das Pellet in dem restlichen Medium resuspendiert, alsdann
in 50 ml Falcon-Röhrchen überführt.
7. Die Falcon-Röhrchen wurden bei 4000 rpm und 4°C für 30 min zentrifugiert, der Überstand
verworfen und das Pellet bei -20°C eingefroren zur späteren Weiterarbeit.