Identifizierung und Charakterisierung von neuen Genen für die ...

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einem entsprechenden Mangelmedium überleben können, allerdings nur, wenn das Leu2-Gen aktiviert
wird, was nur dann geschieht, wenn das Fusionskonstrukt des Bait-Vektors an den Operator bindet und
des Weiteren durch überbrückende Protein-Protein-Interaktion die vom Prey-Vektor gelieferte RNA-
Polymerase-Transkriptionsaktivierungs-Domäne B42 bindet. Hierzu wurden cDNA-Libraries in dem
Vektor pJG4-5 eingesetzt, bei dem die einzelnen cDNAs im Leseraster mit der B42-Domäne fusioniert
transkribiert und translatiert werden. Bindet eines dieser Prey-Proteine von einer der cDNAs aus der
Library an das Bait-Protein (TRIM46-Isoform), so kann durch diese Überbrückung das Leu2-Gen
transkribiert und die Resistenz gegenüber Leu-Mangelmedium von den Zellen ausgelebt werden.
Zusätzlich zum Mangel an Leucin werden die Zellen nach Transformation mit den Vektoren pEG202,
pJG4-5 und pGNG1 auf Histidin-, Tryptophan- und Uracil-Mangelmedium gehalten, da auf diesen
Vektoren entsprechende Gene zur Kompensation vorliegen und somit auf erfolgreiche Transformation
selektiert werden kann, damit sichergestellt ist, dass die Zellen alle diese Vektoren enthalten.
Die Transformationen erfolgten unter Verwendung des Grow’N’Glow High Efficiency Yeast
Transformation Kit von Mobitec in zwei Schritten, wobei die Vektoren pEG202 mit dem Bait und pGNG1
in einem Schritt als small scale Ansatz transformiert wurden, dieses auf entsprechendem Mangelmedium
getestet wurde und diese Zellen anschließend für large scale Ansätze mit der DNA der Prey-Library im
Vektor pJG4-5 eingesetzt wurden. Dabei wurden für einen vollständigen Library-Screen 100 μg DNA eingesetzt,
um möglichst mehr als 10 6 unabhängige Klone zu erhalten. Hierzu wurde die Transformationseffizienz
durch Ausplattieren auf Mangelmedium DOBA (glu) –His –Ura –TRP, das also lediglich auf
Vorhandensein aller drei Plasmide selektiert, bestimmt.
Abweichend von dem Transformationsprotokoll aus dem Kit wurden die Ansätze in 2 ml Eppendorf-Cups
pipettiert und 3 μg statt 1 μg Plasmid-DNA eingesetzt, so dass mit 34 Ansätzen die 100 μg abgedeckt
werden konnten. Die Plasmidmenge darf nicht zu groß werden, um zu verhindern, dass mehr als ein
Plasmid der Library in eine Zelle kommt, wodurch der spätere Screen nicht mehr eindeutig wäre und die
spätere Identifizierung der Klone erschwert würde.
Zur Selektion wurden 3 der 2 ml Ansätze der transformierten Hefezellen auf 12 großen 15 cm Platten mit
dem Selektionsmedium DOBA (gal/raf) –His –Leu –Ura –TRP ausplattiert. Innerhalb einer Woche
wurden die Kolonien sichtbar, die aufgrund der zahlreichen Selektionskriterien langsam wuchsen.
Zur Reduzierung Falschpositiver wurden die auf Agarplatten mit Mangelmedium DOBA (gal/raf) –His –
Leu –Ura –TRP überlebenden Kolonien mit UV-Licht für GFP (395 nm, am besten unter Binokular mit
GFP-Fluoreszenzfilter) bestrahlt, um diejenigen sichtbar zu machen, die zusätzlich den GFP-Reporter
aktivieren. Diese Kolonien wurden zur weiteren Kontrolle auf das gleiche Mangelmedium mit Glucose
anstelle von Galactose (glu statt gal/raf) als Energie- und C-Quelle ausplattiert, wo sie nicht wachsen
können sollten, da das Prey-Protein auf dem Vektor pJG4-5 nur durch Induktion mittels Galactose
transkribiert werden können sollte. Kolonien, die auf diesem Medium mit Glu trotzdem wachsen, wären
Falschpositive.
Positive Hefe-Klone wurden mit dem Grow’N’Glow Yeast Plasmid Isolation Kit der Firma Mobitec
isoliert und die DNA weiter in E. coli Bakterienzellen des Stammes DH5α elektroporiert. Dieser Schritt
diente zur Trennung der Plasmide, da bei der Elektroporation zumeist nur ein einziges Plasmid in die
Bakterien gelangt, so dass die verschiedenen Plasmide aus den Hefezellen in den Bakterien vereinzelt
werden konnten. Nach Ausplattieren der Bakterien waren zwischen 6 bis 12 vereinzelte Bakterienkolonien
zu picken und für Mini-Prep. zu kultivieren, um in einer davon das gewünschte Plasmid mit dem isolierten
Prey-Vektor zu erhalten. Dieser konnte dann mit den für ihn spezifischen Primern sequenziert werden, um
die cDNA-Sequenz zu identifizieren und für weitere Annotationen zu verwenden.
Praktisch gelang diese Sequenzierung bereits vor der Separierung der Plasmide, da auch in einem
Plasmidgemisch die Primer für den Prey-Vektor spezifisch blieben und die andere Plasmid-DNA nicht
störte, was die Sequenzierung von mehr als 50 Hefe-Klonen nach dem Screen beschleunigte.