Identifizierung und Charakterisierung von neuen Genen für die ...

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Prähybridisierung, Hybridisierung und Waschschritte wurden in rotierenden Hybridisierungsflaschen in
Wärmeschränken entsprechend der Hybridisierung von Southern-Blots durchgeführt. Dazu wurde die
geblottete Nitrozellulosemembran 60 min bei 60°C in zweifach SSC / 0,5 % SDS gewaschen. Anschließend
wurde 2 h bei 42 °C mit Hybridisierungspuffer (siehe Seite 151) vorhybridisiert, die Hybridisierungslösung
erneuert und radioaktiv markierte, denaturierte DNA-Sonde zugegeben. Bezüglich der
radioaktiven Markierung siehe unter „Radioaktives Labeln von Hybridisierungssonden“ (Seite 176). Die
Hybridisierung erfolgte unter Rotation in Glasflaschen, über Nacht bei 42 °C. Es wurden > 50 ng
radioaktiv markierte Sonde in 6 ml Hybridisierungslösung eingesetzt. Zur Entfernung ungebundener
Sonde wurden folgende Waschschritte durchgeführt: Zweimal 30 min bei 60°C mit zweifach SSC / 0,5 %
SDS und zweimal 30 min bei 60 °C mit 0,1fach SSC / 0,5 % SDS. Die hybridisierten Nitrozellulosemembranen
wurden in Folie gepackt und in Kassetten mit Röntgenfilmen (Biomax, Kodak) exponiert (3-6
d bei -70 °C). Die Entwicklung der Filme erfolgte in einem Entwicklerautomaten (Curix 60, Agfa).
Protein-Techniken
Yeast-Two-Hybrid-Screen
Es wurde das Grow’n’Glow GFP Two-Hybrid System der Firma Mobitec (siehe Materialien) zusammen
mit cDNA-Bibliotheken (Gehirn und kompletter Embryo) der Firma OriGene verwendet und den
Angaben in den Kit-Anleitungen gefolgt.
Dieses System verwendet GFP als Reporter anstelle β-Galactosidase, so dass die zeitaufwändigeren β-
Gal-Assays wegfallen, zudem man sich eine bessere Empfindlichkeit und Resistenz gegen Falschpositive
verspricht. Tatsächlich konnten wir in zwei durchgeführten Screens mit unterschiedlichen Splice-
Varianten des TRIM46-Gens
(cDNA4, cDNA12) eine sehr hohe
Spezifität feststellen, so dass überhaupt
bei nur einer der beiden Varianten
(cDNA12) Signale gefunden
wurden. Unter der Annahme,
dass die andere Variante nicht an
andere Proteine bindet und keine
Falschpositiven angezeigt wurden,
wäre die Spezifität im Fall der
anderen Splice-Variante, die an
Proteine zu binden scheint, tatsächlich
maximal.
Zur Durchführung wurde die kodierende Region des TRIM46-Gens (cDNA4 und cDNA12 jeweils) in die
Multiple-Klonierungsstelle (MCS) des Bait-Vektors pEG202 kloniert, so dass sie ins Leseraster mit dem
LexA-Fusionsprotein kommt. Das LexA-Protein vermittelt die DNA-Bindung an den LexA-Operator im
Hefegenom sowie auf dem GFP-Reporter-Plasmid pGNG1. Im Genom des verwendeten Hefestammes
EGY48 befindet sich das Gen Leu2 unter der Kontrolle des LexA-Operators. Mit Hilfe des Leu2-Gens
vermögen diese Hefezellen die essentielle Aminosäure Leucin selber zu synthetisieren, so dass sie in