Identifizierung und Charakterisierung von neuen Genen für die ...

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RNA-Techniken
Bei allen Arbeiten mit RNA wurden Handschuhe getragen, das Wasser für alle Lösungen wurde mit 0,1%
DEPC versetzt und alle Lösungen wurden zusätzlich autoklaviert. Die Arbeitsfläche sowie Pipetten
wurden mit Ethanol und RNAZap gereinigt, Elektrophoresezubehör wurde in 0,5% SDS eingeweicht und
anschließend mit DEPC-Wasser gespült. Frisch präpariertes Gewebe wurde in flüssigem Stickstoff eingefroren
und bei -70°C aufbewahrt.
Isolierung von Gesamt-RNA mit TRIzol
Das Gewebe wurde in TRIzol (Life Technologies) mit Hilfe eines Homogenisators (Polytron PT1200,
Kinematica) homogenisiert, wobei für 50-100 mg Gewebe 1 ml TRIzol eingesetzt wurde. Das Homogenat
wurde zentrifugiert (10 min, 12000 rpm, 4°C), der Überstand abgenommen und für 5 min bei RT
inkubiert. Nach Zugabe von 0,2 ml Chloroform pro ml TRIzol wurde das Röhrchen kurz geschüttelt, 2-3
min bei RT inkubiert und zur Phasentrennung zentrifugiert (15 min, 12000 rpm, 4°C). Der Überstand
wurde abgenommen und die RNA mit Isopropanol gefällt. Die RNA wurde mit 70% Ethanol gewaschen,
anschließend das Pellet an der Luft getrocknet und in DEPC-Wasser für 10 min bei 60°C gelöst.
Isolierung von Gesamt-RNA mit RNeasy Total RNA Isolation Kit
Hierfür wurde das Protokoll für Tiergewebe nach den Angaben des Herstellers Qiagen durchgeführt.
Aufreinigung von poly-A + RNA aus Gesamt-RNA
Hierfür wurde das Protokoll für das Oligotex-Kit des Herstellers Qiagen durchgeführt.
Northern-Blot-Analyse
Die Integrität der zuvor präparierten RNA wurde anhand der Banden ribosomaler RNA im nativen
Agarosegel (1 %) überprüft. Die Konzentration der RNA-Proben wurde im Spektrophotometer bestimmt.
Die RNA (etwa 5 µg poly A + oder 10 µg total RNA / Geltasche) wurde in einem 1,2%igen
denaturierenden Agarose-Formaldehydgel (1,2% Agarose, 37% Formaldehyd, 1x MOPS-Puffer) aufgetrennt.
Als Laufpuffer wurde 1x MOPS-Puffer verwendet. Für die Probendenaturierung wurden pro Probe
5µl 10x MOPS-Puffer, 8,75 µl 37% Formaldehyd, 25 µl Formamid und 11,25 µl RNA (+ evtl. DEPC-
Wasser) gemischt und für 5 min bei 60°C inkubiert. Nach Zugabe von 10 µl Ladepuffer wurde das Gel
beladen und mit 75 V für 3-4 h laufen gelassen bis die Bromphenolblau-Bande 2/3 des Gels durchlaufen
hatte. Danach wurde der Bereich des Gels, der den Längenstandard enthielt, abgetrennt, mit
Ethidiumbromid gefärbt und mit einem Lineal fotografiert.
Der Aufbau des Northern Blots entsprach dem des Southern Blots. Die RNA wurde ebenfalls über zwei
Tage auf eine Membran transferiert. Zunächst wurde das RNA-Gel 40 min in zehnfach konzentriertem
SSC (pH 7,5) äquilibriert. Zum Blotten wurde der Aufbau nach (F. Sambroock 1989) verwendet. Das
Blotten erfolgte für 48 h mit zehnfach konzentriertem SSC. Es wurden Nitrozellulosemembranen von
Qiagen verwendet.
Es folgte der Blotabbau, das Markieren der Geltaschen auf der Membran und zweistündiges Backen bei
80°C, um die RNA auf der Membran kovalent zu fixieren.