Identifizierung und Charakterisierung von neuen Genen für die ...

- 176 -
T7: CTAATACGACTCACTATAGGGC
Sp6: ATTTAGGTGACACTATAG
Southern-Blot
Die mit Restriktionsenzymen geschnittene DNA wurde im Agarosegel aufgetrennt, wobei die Gelkonzentration
den zu bestimmenden Fragmentgrößen angepasst wurde. Nach Ethidiumbromidfärbung wurde mit
einem Lineal fotografiert. Das Gel wurde dann für 15 min in 0,25 M HCl gewaschen, kurz mit Millipore-
Wasser gespült und anschließend für 40 min in 1,5 M NaCl / 0,5 M NaOH denaturiert. Nach kurzem
Spülen folgte die Neutralisierung für 40 min in 1 M Tris-HCl / 1,5 M NaCl. Zum Blotten wurde der
Aufbau nach Southern verwendet. Als Transferpuffer diente 20x SSC, transferiert wurde für zwei Tage.
Anschließend wurde die DNA durch Bestrahlung mit langwelligem UV-Licht (312 nm bei 0,3 J/ cm 2 ) und
zweistündigem Backen bei 80°C auf der Membran ("Qiabrane", Qiagen) kovalent fixiert.
Bezüglich der radioaktiven Markierung siehe unter „Radioaktives Labeln von Hybridisierungssonden“
(Seite 176).
Die wie oben beschrieben präparierte Membran wurde mit der radioaktiven Sonde in Hybridisierungsflaschen
unter kontinuierlichem Drehen bei 65°C inkubiert. Zunächst wurden die Membranen für 1 h in 2x
SSC / 0,5% SDS, dann für 1-2 h in Hybridisierungslösung prähybridisiert (siehe Seite 150). Die markierte
Sonde und 100 µg/ml Heringsspermium-DNA wurden für 5 min bei 95°C denaturiert , 5 min auf Eis inkubiert
und mit der Hybridisierungslösung auf die Membran gegeben. Es wurde ÜN hybridisiert. Am
nächsten Tag wurde zweimal für 30 min mit 2x SSC / 0,5% SDS und einmal 30 min mit 0,2x SSC / 0,5%
SDS gewaschen. Die Exposition der abgetrockneten Membran erfolgte für ein bis drei Tage, unter
Umständen auch länger, mit einem Biomax-Film (Kodak) bei -70°C.
Radioaktives Labeln von Hybridisierungssonden
Die radioaktive Markierung von DNA-Fragmenten (gereinigte PCR-Produkte oder Restriktionsfragmente)
erfolgte nach dem "RediPrime II - random prime labelling system" (Amersham Pharmacia Biotech) nach
Herstellerangaben. Dazu wurden 50 - 100 ng DNA in 45 µl TE-Puffer für 5 min bei 95 °C denaturiert, auf
4°C abgekühlt und unter Zuhilfenahme des Kits "RediPrime II" (Amersham) mit 50 µCi 32 P-dCTP
(Amersham) 15 min bei 37°C radioaktiv markiert. Die Reaktion wurde mit 5 µl EDTA (0,2 M) beendet,
nichtinkorporierte Nukleotide durch Gelfiltration an G-50-Mikrosäulen (Sephadex G-50 Probe Quant,
Pharmacia) nach Herstelleranleitung entfernt. Zur Überprüfung der Qualität der radioaktiven Markierung
wurde die spezifische Aktivität der Sonde im Szintillationszähler (Beckmann) gemessen. Die DNA-Sonde
sollte eine spezifische Aktivität von mindestens 5×10 8 Zerfällen/min/µg aufweisen. Dazu wurde 1 µl vom
Säulendurchfluss für die Szintillationszählung eingesetzt. 1 µl sollte ein Signal von 400000-700000 cpm
(„counts per minute“) liefern.