Identifizierung und Charakterisierung von neuen Genen für die ...

Agarose-Gelelektrophorese
Der aufzutrennenden Fragmentgröße
entsprechend (siehe Tabelle)
wurde Agarose in 0,5x
TBE unter Erhitzen in der
Mikrowelle gelöst und danach
mit 0,25 µg/ml Ethidiumbromid
versetzt. Als Laufpuffer wurde
0,5x TBE benutzt. Vor dem
Auftragen wurde die DNA mit
Ladepuffer (siehe 150) versetzt.
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Nach der Elektrophorese wurden die Gele bei kurzwelligem UV-Licht (285 nm) fotografiert. Präparative
Gele wurden zur Vermeidung von Strangbrüchen nur energieärmerem, langwelligem UV-Licht (366 nm)
ausgesetzt.
Isolation von DNA aus dem Agarosegel
DNA-Fragmente wurden im präparativen Agarosegel nach ihrer Größe aufgetrennt, die gewünschte DNA-
Bande unter langwelligem UV-Licht lokalisiert und das Gelstück ausgeschnitten. Mit Hilfe der Option
Gelextraktion des "QIAquick Kit" (Qiagen) wurde die DNA aus dem Gelstück isoliert und in 30 µl TE-
Puffer eluiert.
Alternativ wurden Dialyseschläuche verwendet, in denen die DNA elektrophoretisch aus der Agarose
gelöst wurde. Hierzu wurden ca. 700 µl Puffer zusammen mit dem ausgeschnittenen Agarosestück in den
Schlauch gebracht, welcher mit Klemmen an beiden Enden abgedichtet wurde. Je nach Fragmentgröße
wurde dann für 30-60 min eine Spannung von 80-120 V angelegt, die Trennung unter langwelligem UV-
Licht kontrolliert. Zum Schluss wurde für 30 s umgepolt, um die DNA von den Schlauchwänden zu lösen
und die Lösung abpipettiert, alsdann Phe/Chl extrahiert und die DNA gefällt. Hiermit ließen sich
insbesondere größere DNA-Fragmente, z.B. für die Klonierung des Knock-out-Konstruktes, deutlich
effektiver, also mit höheren Ausbeuten, extrahieren als mit oben beschriebenem Kit, das für kleinere
DNA-Fragmente wie PCR-Produkte und dicke Banden allerdings ausreichte und schneller durchzuarbeiten
war.
Sequenzierung
Zur Sequenzierung wurde das Verfahren der kontrollierten Unterbrechung der DNA-Synthese (Sanger,
Nicklen et al. 1977) eingesetzt. Die Bestimmung der Nukleotidsequenzen wurde auf einem ABI PRISM-
377 DNA-Sequencer durchgeführt. Im Reaktionsansatz wurden 300-400 ng DNA, 10 pmol Primer und 4,5
μl Big Dye Terminator Cycle Sequencing Kit-Lösung zugegeben. Die Reaktion fand in einem
Gesamtvolumen von 11,5-13,5 μl statt. Das Cycle-Sequencing-Programm (30 s / 95°C, 10 s / 50°C, 4 min
/ 60°C, 25 Zyklen) wurde in einem Biometra Trio-Thermoblock durchgeführt. Nach der Reaktion wurde
der Ansatz mit Ethanol gefällt und in Big Dye-Auftragspuffer gelöst. Die Analyse erfolgte auf dem
Sequenziergel und wurde mit der Computersoftware "Sequencher" ausgewertet.
Als Sequenzierprimer wurden verwendet:
lacZ-spezifischer Primer: AGCGGCTGATGTTGAACTG
T3: AATTAACCCTCACTAAAGG
Anteil der Agarose im Gel Erwarteter Trennbereich der Fragmente
(% [w/v])
(kb)
0,3 5-60
0,6 1-20
0,7 0,8-10
0,9 0,5-7
1,2 0,4-6
1,5 0,2-3
2,0 0,1-2