Identifizierung und Charakterisierung von neuen Genen für die ...

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(Dazu wurde die DNA in 8 µl TE gelöst und mit je 1 µl der Phosphatase und des 10x CIP-Puffers versetzt
und für 15 min reagieren gelassen). Die DNA wurde Phe/Chl-extrahiert, mit Ethanol gefällt und in 10 µl
TE resuspendiert. Vektoren, die mit zwei verschiedenen Restriktions-Enzymen geschnitten wurden,
brauchten nicht mit CIP behandelt zu werden.
Präparation von Restriktionsfragmenten
Zu klonierende DNA-Fragmente (Inserts) wurden durch Restriktionsverdau aus bereits vorhandenen
Plasmiden ausgeschnitten. Das DNA-Fragment wurde durch Gel-Elektrophorese und Elution aus dem Gel
("QIAquick Gel Extraction Kit", Qiagen) aufgereinigt. Es folgten Fällung mit Ethanol und Resuspension
in 10 µl TE.
Präparation von PCR-Fragmenten
Einige klonierte Fragmente wurden durch Polymerase-Kettenreaktion aus genomischer DNA amplifiziert.
Die PCR-Produkte wurden aufgereinigt ("QIAquick PCR Purification Kit", Qiagen), mit Ethanol gefällt
und in geeignetem Volumen TE aufgenommen. Um in den Vektor "pGEM-Teasy" (Promega) zu
klonieren, konnte aufgrund des A-Überhangs der PCR-Produkte direkt zur Ligation übergegangen werden.
Sollten PCR-Produkte als Restriktionsfragmente kloniert werden, so wurden in der PCR Primer
verwendet, welche Überhänge mit entsprechenden Restriktions-Schnittstellen enthielten.
Die präparierten DNA-Fragmente wurden für die Klonierung weiter behandelt:
Blunt end-Klonierung
Zur Klonierung in "blunt end"-Vektoren wurden 5'-Überhänge von Restriktionsfragmenten mittels
Klenow-Fragment aufgefüllt (15 min bei RT, 50 µM dNTP + 10 mM MgCl2 + 5 Units/µl Klenow). 3'-
Überhänge wurden durch T4-DNA-Polymerase entfernt (15 min bei RT, 100 µM dNTP + T4-DNA-
Polymerase-Puffer). Beide Reaktionen wurden für 10 min bei 65°C hitzeinaktiviert, das Enzym durch
Phe/Chl-Extraktion abgetrennt.
Ligation
Die Konzentrationen von Insert und Vektor wurden im Agarosegel abgeschätzt. Zur Ligation wurde
angestrebt, Insert und Vektor im Stoffmengenverhältnis von 3 : 1 einzusetzen. Die Ligation erfolgte bei
Raumtemperatur über Nacht.
Ligationsansatz (10 µl): Insert 3 Stoffmengenanteile + Vektor (>50 ng) 1 Stoffmengenanteile +
Ligationspuffer (GeneCraft) einfach konzentriert + T4-DNA-Ligase (GeneCraft) 10 Units/Ansatz (1 µl).