Identifizierung und Charakterisierung von neuen Genen für die ...
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- 172 - Aufbereitung der KO-Konstrukt-DNA für ES-Zell-Elektroporation. Das aus den λ-Phagen klonierte Knock-out-Konstrukt musste für die Elektroporation in ES-Zellen linearisiert werden, da es im zyklischen Zustand nicht ordnungsgemäß homolog rekombinieren könnte. Für den Restriktionsverdau wurden angesetzt: 100 μg Plasmid-DNA + 10 μl 10x Enzympuffer + 1 μl BSA (abhängig vom Enzym) + 5 μl Enzym (hier Not I, 10000 U/ml) + H2O auf 100 μl Gesamtvolumen. Die Reaktion erfolgte ÜN bei 37°C (enzymabhängig). Dann wurde der Verdau durch Zusatz von 2 μl 0,5 M EDTA gestoppt. Zur Entfernung des Enzyms erfolgte Phe/Chl-Extraktion, Chl/Isoamylalkohol- Extraktion, Zusatz von 2 μl 5 M NaCl und Fällung mit dem 2,5fachen Volumen absoluten Ethanols oder dem 0,7fachen Volumen Isopropanols. Die Fällung erfolgte sogleich nach dem Mischen durch Zentrifugation bei RT und unter maximaler Drehzahl einer Tischzentrifuge für 5 min. Es wurde mit 70% Ethanol gewaschen und das Pellet vorsichtig getrocknet, wobei die Gefäße mit Folie abgedeckt wurden. Insgesamt sollte möglichst steril gearbeitet werden, damit bei der Elektroporation in ES-Zellkultur keine Kontamination eingeschleppt werden konnte, da die Kultivierung ohne Antibiotika erfolgte. Das getrocknete Pellet wurde in 100 μl sterilem TE gelöst und zu 30 μl für die Elektroporation aliquotiert. Unter einem Agarosegel erfolgte Kontrolle von 1 μl auf vollständigen Verdau. RT-PCR Es wurde im Wesentlichen das der Reverse Transkriptase Superscript II von Gibco BRL (200 U/μl) beiliegende Protokoll verwendet. 1. DNase-Verdau: Bis 5 μg RNA in 45 μl DEPC-H2O aufgenommen. Mastermix für n Proben: 49,4 μl DEPC-H2O, 3,3 μl 3 M NaAc pH 5,5, 0,5 μl 1 M MgCl2, 1,8 μl DNase I (RNase frei, Boehringer Mannheim Cat. No. 776785, 10 units/μl). Σ 55 μl. Zugabe der 45 μl RNA-Lösung (Σ 100 μl). Inkubation 15-20 min bei RT. Zugabe von 10 μl 3 M NaAc und 250 μl Ethanol, gemischt und 15 min bei 13000 rpm zentrifugiert. Der Überstand wurde dekantiert und das Pellet mit 70% Ethanol gewaschen, zentrifugiert und an Luft getrocknet. 2. cDNA-Synthese: Die RNA wurde in 11 μl DEPC-H2O gelöst. Zusatz von 1 μl oligo(dT30) (500 μg/ml), alternativ 50-250 ng random primer. Erhitzt bei 70°C für 10 min, danach auf Eis gekühlt. Zugabe von 4 μl 5x First Strand Puffer, 2 μl 0,1 M DTT, 1 μl 10 mM dNTP-Mix. Gemischt und 2 min bei 42°C inkubiert. Zusatz von 1 μl Superscript II (200 U/μl). Inkubation für 50 min bei 42°C, dann für 15 min bei 70°C und abkühlen gelassen. 3. RNase H-Verdau: Zusatz von 0,5 μl RNase H (1 U/μl). Inkubation für 30 min bei 37°C. Wenn mehr als 2 μg RNA anfänglich eingesetzt wurden, mit DEPC-H2O aufgefüllt auf 30 μl (bei 3 μg RNA), bzw. 40 μg (bei 4 μg) oder 50 μl (bei 5 μg). 4. PCR: Man sollte eine Kontrolle ohne Template mitlaufen lassen. Mastermix je Ansatz: 2,5 μl Primer 1 (10 pmol/μl), 2,5 μl Primer 2 (10 pmol/μl), 5,0 μl 10x PCR-Puffer (enthielt MgCl2), 1,0 μl 10 mM dNTP-Mix, 0,25 μl Taq-Polymerase (5 U/μl), 38 μl H2O. Je PCR-Tube 49 μl des Master-Mix + 1 μl der cDNA. PCR: 94°C 5 min, 35 Zyklen zu 45 s 94°C, 45 s Annealing-Temperatur (primerspezifisch), 1 min 72°C. Endelongation 5 min bei 72°C. Analyse auf Agarosegel (5 μl Auftrag).
- 173 - PCR Alle PCR-Reaktionen folgten einem allgemeinen Reaktionsschema, die Annealing-Temperatur (Tm) wurde je nach Primer variiert. Die Schmelztemperatur betrug standardmäßig 94°C. War genomische DNA das Ausgangsmaterial, dann 95°C und es wurden 50-100 ng genomische DNA als Template eingesetzt. PCR-Reaktionen wurden auf dem PCR-Gerät "TRIO-Thermoblock" von Biometra durchgeführt. PCR-Reaktionsschema: 95 °C 2 min Tm 30 s ⎫ 72 °C 60 s ⎬ 25-30 Zyklen 95 °C 30 s ⎭ 72 °C 5 min PCR-Reaktionsansatz (25μl): Genomische DNA 2-4 ng/μl + Vorwärts-Primer 10 μM + Rückwärts-Primer 10 μM + PCR-Puffer (GeneCraft) einfach konzentriert + dNTP-Mix (GeneCraft) 0,2 mM + DNA- Polymerase (BioTherm, GeneCraft) 1 Unit/Ansatz. Isolation genomischer DNA Gewebe aus Schwanzspitzen von Mäusen wurde über Nacht bei 56 °C in 500 µl Proteinase K-Lysepuffer verdaut. Gewebereste wurden durch Zentrifugation abgetrennt und der Überstand mit Phenol/Chloroform extrahiert. Die genomische DNA wurde mit 400 µl Isopropanol gefällt, einmal in 70 % Ethanol gewaschen, getrocknet und 1 h bei 60 °C in 1 ml TE-Puffer gelöst. Verdau von DNA mit Restriktionsendonukleasen Das enzymatische Schneiden von DNA wurde nach den Angaben des Enzymherstellers durchgeführt. DNA (je nach Anwendung 0,2-25 µg) in 0,1xTE mit Restriktionsendonuklease-Puffer (verdünnt aus 10x) gelöst in einem Volumen von 10-100 µl. Es erfolgte Zusatz von Restriktionsendonuklease (1-2 Units) und Inkubation ÜN oder mindestens 3 h bei 37°C oder je nach Enzymbedingungen, entsprechend auch Zusatz von BSA je nach Anforderung. Klonierung von DNA-Fragmenten Die zu klonierende DNA wurde aus folgenden verschiedenen Quellen gewonnen: Vektorpräparation Vektor-DNA wurde für 3 h mit einem Überschuss des entsprechenden Restriktionsenzyms (3-5 Units/µg Plasmid-DNA) bei 37°C in geeignetem Puffer inkubiert. Das linearisierte Plasmid wurde durch Gel- Elektrophorese und Elution aus dem Gel aufgereinigt. Erfolgte der Restriktionsverdau mit nur einem Enzym, so musste die mögliche Rückligation unterbunden werden, was durch Inkubation für 30 min bei 37°C in CIP-Puffer mit der Behandlung durch alkalische Phosphatase aus dem Kälberdarm (CIP) geschah
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PCR<br />
Alle PCR-Reaktionen folgten einem allgemeinen Reaktionsschema, <strong>die</strong> Annealing-Temperatur (Tm)<br />
wurde je nach Primer variiert. Die Schmelztemperatur betrug standardmäßig 94°C. War genomische DNA<br />
das Ausgangsmaterial, dann 95°C <strong>und</strong> es wurden 50-100 ng genomische DNA als Template eingesetzt.<br />
PCR-Reaktionen wurden auf dem PCR-Gerät "TRIO-Thermoblock" <strong>von</strong> Biometra durchgeführt.<br />
PCR-Reaktionsschema: 95 °C 2 min<br />
Tm 30 s ⎫<br />
72 °C 60 s ⎬ 25-30 Zyklen<br />
95 °C 30 s ⎭<br />
72 °C 5 min<br />
PCR-Reaktionsansatz (25μl): Genomische DNA 2-4 ng/μl + Vorwärts-Primer 10 μM + Rückwärts-Primer<br />
10 μM + PCR-Puffer (GeneCraft) einfach konzentriert + dNTP-Mix (GeneCraft) 0,2 mM + DNA-<br />
Polymerase (BioTherm, GeneCraft) 1 Unit/Ansatz.<br />
Isolation genomischer DNA<br />
Gewebe aus Schwanzspitzen <strong>von</strong> Mäusen wurde über Nacht bei 56 °C in 500 µl Proteinase K-Lysepuffer<br />
verdaut. Gewebereste wurden durch Zentrifugation abgetrennt <strong>und</strong> der Überstand mit Phenol/Chloroform<br />
extrahiert. Die genomische DNA wurde mit 400 µl Isopropanol gefällt, einmal in 70 % Ethanol<br />
gewaschen, getrocknet <strong>und</strong> 1 h bei 60 °C in 1 ml TE-Puffer gelöst.<br />
Verdau <strong>von</strong> DNA mit Restriktionsendonukleasen<br />
Das enzymatische Schneiden <strong>von</strong> DNA wurde nach den Angaben des Enzymherstellers durchgeführt.<br />
DNA (je nach Anwendung 0,2-25 µg) in 0,1xTE mit Restriktionsendonuklease-Puffer (verdünnt aus 10x)<br />
gelöst in einem Volumen <strong>von</strong> 10-100 µl. Es erfolgte Zusatz <strong>von</strong> Restriktionsendonuklease (1-2 Units) <strong>und</strong><br />
Inkubation ÜN oder mindestens 3 h bei 37°C oder je nach Enzymbedingungen, entsprechend auch Zusatz<br />
<strong>von</strong> BSA je nach Anforderung.<br />
Klonierung <strong>von</strong> DNA-Fragmenten<br />
Die zu klonierende DNA wurde aus folgenden verschiedenen Quellen gewonnen:<br />
Vektorpräparation<br />
Vektor-DNA wurde <strong>für</strong> 3 h mit einem Überschuss des entsprechenden Restriktionsenzyms (3-5 Units/µg<br />
Plasmid-DNA) bei 37°C in geeignetem Puffer inkubiert. Das linearisierte Plasmid wurde durch Gel-<br />
Elektrophorese <strong>und</strong> Elution aus dem Gel aufgereinigt. Erfolgte der Restriktionsverdau mit nur einem<br />
Enzym, so musste <strong>die</strong> mögliche Rückligation unterb<strong>und</strong>en werden, was durch Inkubation <strong>für</strong> 30 min bei<br />
37°C in CIP-Puffer mit der Behandlung durch alkalische Phosphatase aus dem Kälberdarm (CIP) geschah
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