Identifizierung und Charakterisierung von neuen Genen für die ...

- 172 -
Aufbereitung der KO-Konstrukt-DNA für ES-Zell-Elektroporation.
Das aus den λ-Phagen klonierte Knock-out-Konstrukt musste für die Elektroporation in ES-Zellen
linearisiert werden, da es im zyklischen Zustand nicht ordnungsgemäß homolog rekombinieren könnte.
Für den Restriktionsverdau wurden angesetzt: 100 μg Plasmid-DNA + 10 μl 10x Enzympuffer + 1 μl BSA
(abhängig vom Enzym) + 5 μl Enzym (hier Not I, 10000 U/ml) + H2O auf 100 μl Gesamtvolumen.
Die Reaktion erfolgte ÜN bei 37°C (enzymabhängig). Dann wurde der Verdau durch Zusatz von 2 μl 0,5
M EDTA gestoppt. Zur Entfernung des Enzyms erfolgte Phe/Chl-Extraktion, Chl/Isoamylalkohol-
Extraktion, Zusatz von 2 μl 5 M NaCl und Fällung mit dem 2,5fachen Volumen absoluten Ethanols oder
dem 0,7fachen Volumen Isopropanols. Die Fällung erfolgte sogleich nach dem Mischen durch
Zentrifugation bei RT und unter maximaler Drehzahl einer Tischzentrifuge für 5 min. Es wurde mit 70%
Ethanol gewaschen und das Pellet vorsichtig getrocknet, wobei die Gefäße mit Folie abgedeckt wurden.
Insgesamt sollte möglichst steril gearbeitet werden, damit bei der Elektroporation in ES-Zellkultur keine
Kontamination eingeschleppt werden konnte, da die Kultivierung ohne Antibiotika erfolgte. Das
getrocknete Pellet wurde in 100 μl sterilem TE gelöst und zu 30 μl für die Elektroporation aliquotiert.
Unter einem Agarosegel erfolgte Kontrolle von 1 μl auf vollständigen Verdau.
RT-PCR
Es wurde im Wesentlichen das der Reverse Transkriptase Superscript II von Gibco BRL (200 U/μl)
beiliegende Protokoll verwendet.
1. DNase-Verdau: Bis 5 μg RNA in 45 μl DEPC-H2O aufgenommen. Mastermix für n Proben: 49,4 μl
DEPC-H2O, 3,3 μl 3 M NaAc pH 5,5, 0,5 μl 1 M MgCl2, 1,8 μl DNase I (RNase frei, Boehringer
Mannheim Cat. No. 776785, 10 units/μl). Σ 55 μl. Zugabe der 45 μl RNA-Lösung (Σ 100 μl).
Inkubation 15-20 min bei RT. Zugabe von 10 μl 3 M NaAc und 250 μl Ethanol, gemischt und 15 min
bei 13000 rpm zentrifugiert. Der Überstand wurde dekantiert und das Pellet mit 70% Ethanol
gewaschen, zentrifugiert und an Luft getrocknet.
2. cDNA-Synthese: Die RNA wurde in 11 μl DEPC-H2O gelöst. Zusatz von 1 μl oligo(dT30) (500
μg/ml), alternativ 50-250 ng random primer. Erhitzt bei 70°C für 10 min, danach auf Eis gekühlt.
Zugabe von 4 μl 5x First Strand Puffer, 2 μl 0,1 M DTT, 1 μl 10 mM dNTP-Mix. Gemischt und 2 min
bei 42°C inkubiert. Zusatz von 1 μl Superscript II (200 U/μl). Inkubation für 50 min bei 42°C, dann
für 15 min bei 70°C und abkühlen gelassen.
3. RNase H-Verdau: Zusatz von 0,5 μl RNase H (1 U/μl). Inkubation für 30 min bei 37°C. Wenn mehr
als 2 μg RNA anfänglich eingesetzt wurden, mit DEPC-H2O aufgefüllt auf 30 μl (bei 3 μg RNA),
bzw. 40 μg (bei 4 μg) oder 50 μl (bei 5 μg).
4. PCR: Man sollte eine Kontrolle ohne Template mitlaufen lassen. Mastermix je Ansatz: 2,5 μl Primer
1 (10 pmol/μl), 2,5 μl Primer 2 (10 pmol/μl), 5,0 μl 10x PCR-Puffer (enthielt MgCl2), 1,0 μl 10 mM
dNTP-Mix, 0,25 μl Taq-Polymerase (5 U/μl), 38 μl H2O. Je PCR-Tube 49 μl des Master-Mix + 1 μl
der cDNA. PCR: 94°C 5 min, 35 Zyklen zu 45 s 94°C, 45 s Annealing-Temperatur (primerspezifisch),
1 min 72°C. Endelongation 5 min bei 72°C. Analyse auf Agarosegel (5 μl Auftrag).