Identifizierung und Charakterisierung von neuen Genen für die ...
Teilen Einbetten Melden
ePaper herunterladen

Identifizierung und Charakterisierung von neuen Genen für die ...

Identifizierung und Charakterisierung von neuen Genen für die ... Identifizierung und Charakterisierung von neuen Genen für die ...

w210.ub.uni.tuebingen.de
von w210.ub.uni.tuebingen.de Mehr von diesem Publisher
07.10.2013 Aufrufe

- 170 - Konzentrationsbestimmung von Nukleinsäuren in Lösung Die Konzentration von DNA bzw. RNA wurde in einem Spektrophotometer (Bio Photometer von Eppendorf, UV-Küvetten von Brand) bestimmt. Dazu wurde die DNA/RNA-Lösung 1:100 in Wasser verdünnt und die optische Dichte bei 260 nm (OD260) ermittelt. Eine OD260 von 1 entspricht einer Konzentration von 50 µg doppelsträngiger DNA bzw. 40 µg RNA pro ml Lösung. Geringe DNA- Konzentrationen wurden im Agarosegel durch den Vergleich der Fluoreszenzintensitäten der unbekannten mit einer bekannten DNA-Probe abgeschätzt. Phenol/Chloroform- und Chloroform-Extraktion Extraktionen mit Phenol/Chloroform/Isoamylalkohol (TE-gesättigt, pH 7,5 von Roth) und Chloroform/Isoamylalkohol wurden zur Entfernung von Proteinrückständen aus DNA-haltigen Lösungen durchgeführt. Die DNA-Lösung wurde mit einem äquivalenten Volumen des Phe/Chl/Isoam.-Gemisches (vol:vol:vol=24:24:1) bzw. der Chl/Isoam.-Mischung (vol:vol=24:1) versetzt, 30 s kräftig geschüttelt und die Phasen durch Zentrifugation (5 min Maximum) getrennt. Die wässrige Phase wurde abgenommen und die DNA durch Ethanolfällung gewonnen. Ethanolfällung Ein Volumenanteil DNA-haltiger Lösung wurde mit 0,1 Volumenanteilen 3 M Natriumazetat und 2,5 Volumenanteilen absolutem Ethanol versetzt und mindestens 30 min bei -20°C inkubiert. Das DNA- Präzipitat wurde durch Zentrifugation bei höchster Umdrehungszahl abgeschieden und in 75% Ethanol gewaschen. Nach Trocknung des DNA-Pellets wurde es in einem geeigneten Volumen Wasser oder TE- Puffer gelöst. λ-Phagen-PCR-Screen Vorbehandlung der Wirtsbakterien Von dem Bakterienstamm XL1-Blue MRA wurde mit einer Einzelkolonie eine 50 ml STI + 1% Maltose- Kultur angeimpft. Am nächsten Tag wurden die Bakterien pelletiert (3000 rpm, 10 min, 4°C) und anschließend in 25 ml 10 mM MgSO4 resuspendiert. Die Bakterien wurden bei 4°C gelagert und blieben etwa 1 Woche für die Infektion mit λ-Phagen kompetent. Durchführung des λ-Phagen-PCR-Screens Es wurde die Lambda ® Fix II Library der Firma Stratagene verwendet. Die 6,9x10 7 Klone waren auf 5 Röhrchen zu je 1 ml aliquotiert. Aus jedem dieser Röhrchen wurde je 1 µl für PCR entnommen. Die PCR wurde mit den Primern für die 5’- bzw. 3’-Flanke des Genlocus für den Maus-Knock-out durchgeführt (siehe ab Seite 153) unter Standard-PCR-Bedingungen (30 s bei 94°C Denaturierung, 30 s Anlagerung

- 171 - gemäß den Primern, siehe dort, 1 min Elongation bei 72°C, 30 Zyklen). Eine positive Bande in der Agarose-Gelelektrophorese spezifizierte das Ausgangsröhrchen für den weiteren λ-Phagen-PCR-Screen. Die PCR wurde mit einer Verdünnungsreihe aus dem positiven Röhrchen der Library wiederholt, so lange, bis keine Bande mehr sichtbar wurde. Von der letzten Verdünnung mit eindeutig positiver Bande wurde die dreifache Menge in 1 ml λ-Verdünnungspuffer eingesetzt, diesem 1 ml einer ÜN-Kultur des Bakterienstammes XL1 Blue MRA zugegeben. Der Bakterienstamm hatte dabei eine OD600 von 2,0 und war in STI-Medium + 0,2% Maltose gewachsen. Das Gemisch aus Phagen, λ-Verdünnungspuffer und Bakteriensuspension wurde für 15 min bei 37°C inkubiert, anschließend mit 18 ml STI + 0,2% Maltose + 10 mM MgSO4 weiter verdünnt und gemischt. Hiervon wurden je 100 µl in das Well einer 8x8 Mikrotiter- Platte überführt, insgesamt also 6,4 ml auf 64 Wells. Die Mikrotiter-Platte wurde mit Klebefolie versiegelt und bei 37°C für 5-6 h oder ÜN unter Schütteln inkubiert. Danach wurden je 20 µl von den Wells einer Spalte sowie entsprechend von denen eine Zeile gepoolt, gemischt und davon mit je 1 µl eine PCR durchgeführt. Von den positiven Proben wurde noch mal eine PCR von dem vermuteten einzelnen Well durchgeführt. Von dem eindeutig identifizierten individuellen positiven Well wurde eine Verdünnungsreihe wie zuvor durchgeführt und die kleinste Verdünnung mit noch positivem Resultat bestimmt, davon wieder die 3 fache Menge für die nächste Runde des PCR-Screens eingesetzt. Insgesamt wurde diese Prozedur etwa 3 bis 5 Mal wiederholt. Am Ende sollten die λ-Phagen mit dem durch PCR bestimmten gewünschten Insert gegenüber unspezifischen Phagen soweit angereichert worden sein, dass sie im weiteren isoliert und für die Klonierung eines Knock-out-Konstruktes eingesetzt werden konnten. Ausplattieren der Phagenbibliothek Die Phagen wurden auf 90 mm Platten (STI mit 1,5% Bactoagar) gegebenenfalls in mehreren Verdünnungen ausplattiert. Dazu wurden die Phagen mit der berechneten Verdünnung für 15 min bei 37°C mit je 200 μl Bakterien inkubiert, mit Topagarose gemischt und auf die vorgewärmten Agarplatten plattiert. Nach Erstarren der Topagarose wurden die Platten umgekehrt für ca. 10-12 h bei 37°C inkubiert. Anschließend wurden die Platten bei 4°C gelagert. Topagarose: STI mit 0,7% Agarose. Aufreinigen positiver Phagen und Anlegen eines Phagenstocks Positive Phagen-Plaques wurden mit einer Pasteur-Pipette gepickt und in 1 ml λ-Verdünnungspuffer sowie einem Tropfen Chloroform für mehrere Stunden bei RT unter Schütteln zur Elution der Phagen inkubiert. Zur Vereinzelung der Phagen wurde erneut in verschiedenen Verdünnungen auf kleine Platten ausplattiert und gepickt. Auf diese Weise entstand eine hochkonzentrierte Lösung („high titer stock“) der isolierten Phagen. Die Phagenüberstände wurden bei 4°C gelagert und waren durch das Chloroform konserviert. DNA-Isolierung aus λ -Phagen Der entsprechende Phagenklon wurde auf einer 14 cm Petrischale (STI mit 1,5% Agarose) ausplattiert. Anschließend wurden die Phagen mit 10 ml λ-Verdünnungspuffer und einigen Tropfen Chloroform für 1- 2 h bei 37°C von der Platte gewaschen. Nach Transfer dieses Lysats in 50 ml Röhrchen und Zentrifugation (10 min, 7000 rpm, 4°C) wurde der Überstand für 30 min bei 37°C mit RNase A und DNase (Endkonzentrationen jeweils 1 μg/ ml) unter Schütteln inkubiert, um die bakteriellen Nukleinsäuren zu entfernen. Danach wurde der Überstand mit einem Volumen 20% Polyethylenglycol- 6000 + 2 M NaCl für 1 h auf Eis präzipitiert. Die Phagen wurden pelletiert (20 min, 7000 rpm, 4°C) in 0,5 ml λ-Verdünnungspuffer gelöst und einmal nachgewaschen. Nach 15 minütiger Inkubation bei 68°C in 10% SDS und 0,5 M EDTA folgte eine Phe-Extraktion, eine Phe/Chl-Extraktion und eine Chl-Extraktion. Die Phagen-DNA wurde gefällt, gewaschen und schließlich für eine Stunde bei 60°C in 0,1xTE gelöst.

- 170 -<br />

Konzentrationsbestimmung <strong>von</strong> Nukleinsäuren in Lösung<br />

Die Konzentration <strong>von</strong> DNA bzw. RNA wurde in einem Spektrophotometer (Bio Photometer <strong>von</strong><br />

Eppendorf, UV-Küvetten <strong>von</strong> Brand) bestimmt. Dazu wurde <strong>die</strong> DNA/RNA-Lösung 1:100 in Wasser<br />

verdünnt <strong>und</strong> <strong>die</strong> optische Dichte bei 260 nm (OD260) ermittelt. Eine OD260 <strong>von</strong> 1 entspricht einer<br />

Konzentration <strong>von</strong> 50 µg doppelsträngiger DNA bzw. 40 µg RNA pro ml Lösung. Geringe DNA-<br />

Konzentrationen wurden im Agarosegel durch den Vergleich der Fluoreszenzintensitäten der unbekannten<br />

mit einer bekannten DNA-Probe abgeschätzt.<br />

Phenol/Chloroform- <strong>und</strong> Chloroform-Extraktion<br />

Extraktionen mit Phenol/Chloroform/Isoamylalkohol (TE-gesättigt, pH 7,5 <strong>von</strong> Roth) <strong>und</strong><br />

Chloroform/Isoamylalkohol wurden zur Entfernung <strong>von</strong> Proteinrückständen aus DNA-haltigen Lösungen<br />

durchgeführt. Die DNA-Lösung wurde mit einem äquivalenten Volumen des Phe/Chl/Isoam.-Gemisches<br />

(vol:vol:vol=24:24:1) bzw. der Chl/Isoam.-Mischung (vol:vol=24:1) versetzt, 30 s kräftig geschüttelt <strong>und</strong><br />

<strong>die</strong> Phasen durch Zentrifugation (5 min Maximum) getrennt. Die wässrige Phase wurde abgenommen <strong>und</strong><br />

<strong>die</strong> DNA durch Ethanolfällung gewonnen.<br />

Ethanolfällung<br />

Ein Volumenanteil DNA-haltiger Lösung wurde mit 0,1 Volumenanteilen 3 M Natriumazetat <strong>und</strong> 2,5<br />

Volumenanteilen absolutem Ethanol versetzt <strong>und</strong> mindestens 30 min bei -20°C inkubiert. Das DNA-<br />

Präzipitat wurde durch Zentrifugation bei höchster Umdrehungszahl abgeschieden <strong>und</strong> in 75% Ethanol<br />

gewaschen. Nach Trocknung des DNA-Pellets wurde es in einem geeigneten Volumen Wasser oder TE-<br />

Puffer gelöst.<br />

λ-Phagen-PCR-Screen<br />

Vorbehandlung der Wirtsbakterien<br />

Von dem Bakterienstamm XL1-Blue MRA wurde mit einer Einzelkolonie eine 50 ml STI + 1% Maltose-<br />

Kultur angeimpft. Am nächsten Tag wurden <strong>die</strong> Bakterien pelletiert (3000 rpm, 10 min, 4°C) <strong>und</strong><br />

anschließend in 25 ml 10 mM MgSO4 resuspen<strong>die</strong>rt. Die Bakterien wurden bei 4°C gelagert <strong>und</strong> blieben<br />

etwa 1 Woche <strong>für</strong> <strong>die</strong> Infektion mit λ-Phagen kompetent.<br />

Durchführung des λ-Phagen-PCR-Screens<br />

Es wurde <strong>die</strong> Lambda ® Fix II Library der Firma Stratagene verwendet. Die 6,9x10 7 Klone waren auf 5<br />

Röhrchen zu je 1 ml aliquotiert. Aus jedem <strong>die</strong>ser Röhrchen wurde je 1 µl <strong>für</strong> PCR entnommen. Die PCR<br />

wurde mit den Primern <strong>für</strong> <strong>die</strong> 5’- bzw. 3’-Flanke des Genlocus <strong>für</strong> den Maus-Knock-out durchgeführt<br />

(siehe ab Seite 153) unter Standard-PCR-Bedingungen (30 s bei 94°C Denaturierung, 30 s Anlagerung

logo

Produkte

Ressourcen

Unternehmen

AGB
Datenschutzerklärung
Cookie-Richtlinien
Cookie-Einstellungen
Impressum
Change language
Made with love in Switzerland
© 2024 Yumpu.com all rights reserved

Hurra! Ihre Datei wurde hochgeladen und ist bereit für die Veröffentlichung.

Erfolgreich gespeichert!

Leider ist etwas schief gelaufen!