Identifizierung und Charakterisierung von neuen Genen für die ...

DNA-Techniken
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Herstellung elektrokompetenter Bakterien
Zur Herstellung elektrokompetenter Bakterien wurde eine Einzelkolonie des Bakterienstammes E. coli
DH5α in 50 ml STI-Medium inokuliert und über Nacht bei 37°C schüttelnd inkubiert. 2,5 ml dieser
Starterkultur wurden in 250 ml STI-Medium überimpft und weiter kultiviert bis die Kultur bei 600 nm
eine optischen Dichte von 0,5-0,6 aufwies. Die Kultur wurde auf Eis abgekühlt (15 min) und die Bakterien
pelletiert. Nacheinander wurden die Bakterien durch Resuspension und Zentrifugation dreimal in sterilem
Wasser und dreimal in 10% Glycerol gewaschen. Alle Waschschritte erfolgten bei 4 °C. Schließlich
wurden die Bakterien in einem dem Volumen des Pellets äquivalenten Volumen 10% Glycerol resuspendiert,
aliquotiert und auf Trockeneis eingefroren. Die Lagerung erfolgte bei -70 °C.
DNA-Präparation
Die Plasmid enthaltenden Bakterien wurden auf STI-Bakterienagarplatten ausgestrichen und über Nacht
bei 37°C inkubiert. Zur Vorkultur wurden Einzelkolonien in 5 ml STI-Medium inokuliert und 6-8 h bei
37°C schüttelnd inkubiert. Es folgten das Animpfen von 100 ml STI-Medium mit 1 ml Vorkultur und
Inkubation unter Schütteln über Nacht bei 37°C. Zur Präparation von Plasmid-DNA kam das "QIAfilter
Plasmid Maxi Kit" (Qiagen) zur Verwendung. Dabei wurde nach den Angaben des Herstellers verfahren.
Gewonnene Plasmid-DNA wurde in 200 µl TE-Puffer (pH 7,5) gelöst. Zur analytischen DNA-Präparation
wurde das "QIAfilter Plasmid Mini Kit" (Qiagen) verwendet.
Transformation von E. coli durch Elektroporation
40 μl kompetente Zellen wurden auf Eis aufgetaut und in eine vorgekühlte 0,1 cm Elektroporations-
Küvette (Gene Pulser von Bio-Rad) überführt. 1 bis 3 μl DNA-Lösung (1 bis 10 ng/μl) wurde zu den
kompetenten Zellen gegeben und gemischt. Die Elektroden der Küvetten wurden sorgfältig abgetrocknet
und die Elektroporation durchgeführt mittels eines Gene Pulser Gerätes von Bio-Rad unter den
Einstellungen mit einer Spannung von 1,8 kV, einem Widerstand von 200 Ω und einer Kapazität von 25
μF. Nach der Elektroporation wurden die Zellen mit 960 μl vorgewärmten LB-Medium gemischt, in
Eppendorf-Gefäße überführt und bei 37°C unter Rotation für 1 h inkubiert, anschließend in Chargen zu
10, 50 und 400 μl auf den Plasmiden entsprechenden selektiven Agar-Platten ausplattiert.
Transformation von E. coli durch Hitzeschock
50 – 100 μl kompetente Zellen wurden auf Eis aufgetaut und in ein Falcon 2059 Polypropylen-Röhrchen
(BD Falcon) überführt. 10 ng DNA bzw. 10 μl DNA-Lösung wurden mit den kompetenten Zellen
vermischt und auf Eis für 30 min inkubiert. Anschließend erfolgte Hitzeschock bei 42°C für 45 s mit
folgender Inkubation auf Eis für 2 min. Die Zellen wurden mit 960 μl vorgewärmten LB-Medium
gemischt, in Eppendorf-Gefäße überführt und bei 37°C unter Rotation für 1 h inkubiert. Die Zellen
wurden in einer Tischzentrifuge bei 3000 rpm und 2 min abzentrifugiert und in 200 μl LB-Medium
aufgenommen und ausplattiert.