Identifizierung und Charakterisierung von neuen Genen für die ...

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Streptavidin-Phycoerythrin-Lösung: 100 mM MES + 1 M [Na + ] + 0,05% Tween-20 + 0,005% Antifoam
0-30 + 2 mg/ml acetyliertes BSA + 10 µg/ml Streptavidin-Phycoerythrin (Molecular Probes).
Lösung mit Biotin-anti-Streptavidin-Antikörper: 100 mM MES + 1 M [Na + ] + 0,05% Tween-20 +
0,005% Antifoam 0-30 + 0,1 mg/ml IgG der Ziege (Sigma) + 3 µg/ml Biotin-anti-Streptavidin-Antikörper
aus der Ziege (Vector Laboratories).
Scannen der Microarrays und Auswertung der Daten
Die Microarrays wurden mit dem "Agilent GeneArray Scanner" (Affymetrix) mit einer Laserwellenlänge
von 570 nm gescannt. Die Datenanalyse wurde mit der Software "MicroArray Suite 4" (Affymetrix)
vorgenommen. Die Qualität jeder RNA-Probe wurde zunächst mit einem Testchip (Test3 Array, Affymetrix)
beurteilt. Der Testchip enthält Sets von Proben für murine Haushaltsgene, wie β-Aktin und GAPDH.
Für gute Hybridisierungsproben sollte das Verhältnis der Hybridisierungssignale von Probensets aus dem
5'- und 3'-Ende der Gene β-Aktin und GAPDH den Wert 3 nicht überschreiten. Anderenfalls müsste von
einer Degradierung der RNA im Hybridisierungscocktail ausgegangen werden. Für gut befundene
Hybridisierungscocktails wurden zur Hybridisierung der Microarrays vom Typ MGU74v2 weiter
verwendet. Um die Vergleichbarkeit zweier Microarrays zu gewährleisten, wurde der Algorithmus
"Scaling" (Skalierung) ausgeführt. Die gewählte Targetintensität betrug 500. Computerdateien vom Typ
".chp" wurden erstellt und paarweise miteinander verglichen. Mit Hilfe der erhaltenen Daten für "Fold
Change" (Expressionsverhältnis) und "Difference Call" (Prädikat des Expressionsunterschiedes) wurden
Listen von Genen erstellt, deren Expression in einem der fünf Cortexgebiete erhöht war. Zusätzlich
wurden weitere Prioritätslisten erstellt für Gene, die in mehreren Cortexregionen insbesondere in Form
eines Gradienten exprimiert waren. Die hierfür ausgewählten Gene mussten einen "Difference Call" von
"marginal increased" (geringfügig erhöht) oder "increased" (erhöht) vorweisen. Hinzu kam ein
Schwellenwert für den "Fold Change" von mindestens 2 in der betrachteten Hirnregion in Bezug zu den
anderen Regionen bzw. bei Gradienten von den betrachteten Hirnregionen zu den anderen Regionen.
Abbildung 151: Aus dem Scannen der Microarrays wurden Rohdaten in „.dat“-Dateien gewonnen, aus denen auf statistisch
festgelegte Weise Ausreißer eliminiert und Mittelwerte für die „Probe Cells“ gebildet wurden, die in „.cel“-
Dateien abgelegt wurden. Diese wurden weiter verarbeitet zu den „.chp“-Dateien, die die eigentliche Grundlage für
die Auswertung bildeten und jedem Gen nur noch einen Wert für die Signalstärke zuwiesen, so dass zwischen verschiedenen
Chips nach Normierung auf den Hintergrund und auf die mithybridisierten Kontrollgene verglichen
werden konnte.