Identifizierung und Charakterisierung von neuen Genen für die ...

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Herstellung der Hybridisierungskontrollen
Auf den Microarrays vom Typ MGU74v2 sind Proben der prokaryotischen Gene bioB, bioC, bioD und
Cre repräsentiert. Entsprechende antisense-RNAs wurden als Hybridisierungskontrollen dem Hybridisierungscocktail
zugefügt. Plasmide mit den cDNAs bioB, bioC, bioD und Cre wurden von American
Type Culture Collection bezogen. Plasmid-DNA wurde mit dem "QIAfilter Plasmid Maxi Kit" (Qiagen)
präpariert, mit Xho I linearisiert und Phe/Chl-extrahiert. Die in vitro-Transkription wurde mit 0,75 µg
Plasmid-DNA durchgeführt (RNA Transcript Labeling Kit, Enzo). Es wurde T7-RNA-Polymerase
verwendet.
Hybridisierung der Microarrays
Zur Prähybridisierung wurde der Microarray 10 min bei 45 °C mit MES-Puffer (74 mM [Na + ], 100 mM
MES) inkubiert. Die Inkubation erfolgte unter Rotation (60 U/ min) im Hybridisierungsofen (Affymetrix).
Zur Hybridisierung wurden 300 µl Hybridisierungscocktail mit 15 µg fragmentierter RNA vorbereitet, 5
min bei 99 °C denaturiert und auf 45 °C temperiert. Die Hybridisierung erfolgte über 16 h bei 45°C und
60 U/min im Hybridisierungsofen.
Hybridisierungscocktail (300 µl):
0,05 µg/µl Fragmentierte, biotinylierte RNA.
50 pM Kontroll-Oligonukleotide B2 (Affymetrix).
1,5 pM Hybridisierungskontrolle bioB.
5 pM Hybridisierungskontrolle bioC.
25 pM Hybridisierungskontrolle bioD.
100 pM Hybridisierungskontrolle cre.
0,1 mg/ml Heringsspermien-DNA (Promega).
0,5 mg/ml acetyliertes BSA (Gibco).
100 mM MES.
1 M [Na + ].
20 mM EDTA.
0,01% Tween-20.
Waschen und Färben der Microchips
Die Posthybridisierung der Microarrays wurde in der "GeneChip Fluidics Station 400" (Affymetrix)
durchgeführt und durch die Software "Microarray suite 4.0" (Affymetrix) gesteuert. Dazu wurde zunächst
der Hybridisierungscocktail entfernt und durch Puffer A ersetzt. Anschließend wurde zehnmal mit Puffer
A bei 25°C und viermal mit Puffer B bei 50°C gewaschen. Es folgten Inkubation mit Streptavidin-
Phycoerythrin-Lösung (10 min, 25°C), zehnmal Waschen mit Puffer A bei 25°C, Inkubation mit Biotinanti-Streptavidin-Antikörper
(10 min, 25°C), Inkubation mit Streptavidin-Phycoerythrin-Lösung (10 min,
25°C) und 15 Waschschritte mit Puffer A bei 30°C.
Puffer A: 0,9 M NaH2PO4 + 60 mM NaCl + 6 mM EDTA + 0,01% Tween-20 + 0,005% Antifoam 0-30
(Sigma).
Puffer B: 100 mM MES + 0,1 M [Na + ] + 0,01% Tween-20.