Identifizierung und Charakterisierung von neuen Genen für die ...

30 µl Zweitstrang-cDNA-Puffer (fünffach).
3 µl dNTP-Mix (10 mM).
1 µl DNA-Ligase aus E. coli (10 Units/ µl).
4 µl DNA-Polymerase I aus E. coli (10 Units/ µl).
2 µl RNase H aus E. coli (2 Units/ µl).
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Ansatz zum "Blunt"-machen der cDNA (152 µl):
Zugabe von:
2 µl T4-DNA-Polymerase (5 Units/ µl).
Die Reaktion wurde unter Zugabe von 10 µl EDTA (0,5 M) abgestoppt und die doppelsträngige cDNA
mit Hilfe von "Phase Lock Gels" (Eppendorf) über Phe/Chl-Extraktion aufgereinigt und schließlich mit
Ethanol präzipitiert. Nach zweimaligem Waschen mit 80%-igem Ethanol wurde das Pellet getrocknet und
in 12 µl DEPC-Wasser aufgenommen.
Synthese biotinylierter RNA und Ausbeuteberechnung
Die in-vitro-Transkription der cDNA zur Herstellung biotinylierter RNA-Sonden wurde für 5 h bei 37°C
durchgeführt. Dazu wurde das "RNA Transcript Labeling Kit" der Firma Enzo verwendet.
Ansatz zur in-vitro-Transkription (40 µl):
12 µl cDNA (ca. 100 ng/ µl).
10 µl DEPC-Wasser.
4 µl HY-Reaktionspuffer (zehnfach).
4 µl Biotin-markierte Ribonukleotide (zehnfach).
4 µl DTT (100 mM).
4 µl RNase-Inhibitor (20 Units/ µl).
2µl T7-RNA-Polymerase (50 Units/ µl).
Zur Extraktion der RNA aus dem Reaktionsansatz wurde die Option "RNA Clean-up" des "RNeasy Mini
Kit" (Qiagen) genutzt. Die Elution erfolgte mit 30 µl DEPC-Wasser. Die Konzentration der erhaltenen
RNA (c0) wurde im Spektrophotometer bestimmt. Zur Berechnung der Konzentration an biotinylierter
RNA (c1) wurde von einem vollständigen Übertrag der ursprünglich eingesetzten Gesamt-RNA (9 µg)
ausgegangen und eine entsprechende Korrektur vorgenommen (c1 = c0 - 9 µg / 30 µl, c1 = c0 - 0,3 µg / µl).
Es wurde also zur Berechnung der tatsächlichen cRNA-Ausbeute die eingesetzte Menge totaler RNA von
der Menge cRNA nach in-vitro-Transkription abgezogen.
Fragmentierung der biotinylierten RNA
Die Fragmentierung der biotinylierten RNA wurde für 35 min bei 94°C durchgeführt, danach bis zur
Hybridisierung bei -20°C gelagert. Die Qualität fragmentierter RNA wurde mit 1 µl RNA in einem
nativen Agarosegel (1%) überprüft. Es sollten RNA-Fragmente von 35 bis 200 Basen vorliegen.
Ansatz zur Fragmentierung biotinylierter RNA (40 µl):
0,625 µg/µl Biotinylierte RNA in Fragmentierungspuffer mit 40 mM Tris-Acetat, pH 8,1 + 100 mM
Kaliumacetat + 30 mM Magnesiumacetat.