Identifizierung und Charakterisierung von neuen Genen für die ...

Affymetrix-Microarray-Screen
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Zur Expressionsanalyse wurde die GeneChip-Technologie der Firma Affymetrix eingesetzt. Es wurden
die Microarrays Test3 Array, MGU74Av2, MGU74Bv2 und MGU74Cv2 verwendet, die ca. 36.000 Gene
bzw. EST-Sequenzen des Mausgenoms abdeckten.
Gewebe-Präparation und RNA-Isolation
Tris-freie Lösungen wurden mit DEPC (0,1%; Sigma) bei 37°C über Nacht behandelt und autoklaviert.
Tris enthaltende Puffer wurden autoklaviert. Alle Arbeitsschritte erfolgten unter RNase-freien
Bedingungen. Gewebe aus fünf Regionen des cerebralen Cortex 18,5 Tage alter Embryonen wurde isoliert
(Hippocampus, Motorcortex, visueller Cortex, somatosensorischer Cortex, cingularer Cortex). Als
zusätzliche Probe wurde der Körper nach Entfernung von Rückenmark und Genitalanlage verwendet. Die
Präparation erfolgte in eiskaltem PBS-DEPC. Isoliertes Gewebe wurde bis zur weiteren Verwendung in
RNAlater (Ambion) bei 4°C aufbewahrt. Das Gewebe wurde mit Hilfe eines Homogenisators (Polytron
PT1200, Kinematica) homogenisiert und die Gesamt-RNA mit Hilfe des "RNeasy Mini Kit" (Qiagen)
isoliert. Die Integrität der RNA wurde im nativen Agarosegel (1%) überprüft, deren Konzentration in
einem Spektrophotometer bestimmt.
cDNA-Synthese
Zur Synthese von doppelsträngiger cDNA aus Gesamt-RNA wurde das "SuperScript Choice System"
der Firma Invitrogen Life Technologies verwendet. Dabei wurden 9 µg Gesamt-RNA pro Gewebeprobe
eingesetzt. Das Protokoll begann mit der Primerhybridisierung (10 min, 70°C), es folgten Temperatureinstellung
(2 min, 42°C), Synthese der einzelsträngigen cDNA (1 h, 42°C), Synthese der doppelsträngigen
cDNA (2 h, 16°C) und "blunt"-machen der cDNA-Enden (5 min, 16°C). Alle Teilschritte
erfolgten in einem Reaktionsansatz unter sukzessiver Zugabe der Komponenten:
Ansatz zur Primerhybridisierung (12 µl):
2 µl T7-(dT)24-Primer (50 µM, Affymetrix).
9 µl RNA (1 µg/µl).
1 µl RNasin (40 Units/µl, Promega).
Ansatz zur Temperatureinstellung (19 µl):
Zugabe von:
4 µl Erststrang-cDNA-Puffer (fünffach).
2 µl DTT (0,1 M).
1 µl dNTP-Mix (10 mM).
Ansatz zur Synthese der einzelsträngigen cDNA (20 µl):
Zugabe von:
1 µl SuperScript II reverse Transkriptase (200 Units/ µl).
Ansatz zur Synthese der doppelsträngigen cDNA (150 µl):
Zugabe von:
90 µl DEPC-Wasser.