Identifizierung und Charakterisierung von neuen Genen für die ...

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Uterustransfer der Blastocysten in pseudoschwangere Empfängermäuse
Jeweils 10 der aus den Morulae hervorgehenden Blastocysten werden in einen Maus-Uterus transferiert.
Dazu wird das Muttertier mit einer 2,5%igen Avertin-Lösung (19 μl pro Gramm Körpergewicht intraperitoneal
gespritzt) anästhesiert. Bei diesen Mäusen handelt es sich um pseudoschwangere Foster-Mäuse, die
2,5 Tage nach Kopulation zwar Schwangerschaftshormone produzieren, aber selber keine fertilen Eizellen
produzieren, jedoch die transferierten Blastozysten aufnehmen und versorgen können. Die Blastozysten
werden mit einer Kanüle in M16-Medium in den Uterus injiziert.
Chimären und Keimbahntransfer
Etwa 17 Tage nach dem Uterus-Transfer sollten die Empfängerweibchen werfen. Wurden die ES-Zelllinie
und die Blastozysten von Mausstämmen mit unterschiedlicher Fellfarbe gewählt (wie üblich), so erhält
man als Nachkommen Chimären mit geflecktem und gestreiftem Fell. Kreuzt man chimäre männliche
Tiere mit Wildtypweibchen des Genotyps der Blastozyste, so erhält man in der nächsten Generation
entweder Tiere, die die Fellfarbe der Mutter tragen (keine Transmission des ES-Genotyps), oder Tiere, die
die Fellfarbe des Mausstammes der ES-Zellen tragen (sofern diese Fellfarben-Allele dominant vererbt
werden). In letzterem Fall ist die Keimbahntransmission geglückt. Die Verwendung männlicher Chimären
hat den Vorteil, innerhalb kurzer Zeit viele Nachkommen erzeugen zu können. Hat man diejenigen Tiere
identifiziert (Schwanzbiopsie, Genotypisierung), die die gewünschte Mutation tragen, so werden diese
Heterozygoten gemeinsam (Bruder x Schwester) verpaart zur Erzeugung homozygoter Mutanten.
Zellkultur-Techniken
Splitten von Zellen durch Trypsinisieren
Das Medium wurde abgesaugt und die Zellen einmal mit 10 ml PBS gewaschen und anschließend mit 2,5
ml Trypsin versetzt, darin für 5 min bei 37°C inkubiert. Es folgte Zusatz von 7,5 ml Medium und
Überführung der Zellsuspension in 50 ml Falcon Röhrchen. Dann Zentrifugation für 5 min bei 1000
Umdrehungen. Der Überstand wurde abgesaugt, die Zellen in 10 ml Medium resuspendiert und je 2,5 ml
auf 10 cm Platten mit Zugabe von 7,5 ml weiterem Medium ausplattiert, dabei die Zellen durch
Schwenken möglichst gleichmäßig verteilt.
Transfektion mit Lipofektamin2000
Es wurde nach den Herstellerangaben für Lipofectamine 2000 von Invitrogen verfahren.