Identifizierung und Charakterisierung von neuen Genen für die ...

- 162 -
Embryonale Stammzellen einer 6 cm – Gewebekulturplatte werden nach Trypsinisieren in
Elektroporationspuffer aufgenommen (1 x 10 7 Zellen/ml ). 900 μl der Zellsuspension werden in eine
Elektroporationsküvette (Bio-Rad, 4 mm Elektrodenabstand) gegeben.
20 μg linearisierte DNA (Rekombinationskonstrukt) werden in Elektroporationspuffer aufgenommen, der
Zellsuspension zugesetzt und der Ansatz gemischt.
Eine Kapazität von 500 μF wird bei einer Spannung von 240 V über die Elektroporationsküvette durch die
Zell/DNA-Suspension entladen. Hierdurch werden die Zellmembranen kurzfristig durchlässig, so dass die
DNA eindringen kann. Die Zellen werden nach dem Strompuls 10 min lang nicht bewegt, anschließend in
DMEM aufgenommen und auf einen Feeder-Zellrasen ausplattiert. Die Zellen eines
Elektroporationsansatzes (9 x 10 6 ) werden auf zwei 10 cm Gewebekulturschalen verteilt.
Selektion von ES-Zellen zur Gewinnung von Einzelklonen
Geneticin ® G418-Stammlösung: 5 g G418 in 200 ml DMEM lösen (25 mg/ml) und zweimal sterilfiltrieren.
Gancyclovir (Cymoven)-Stammlösung: Gancyclovir zu 5 mg / ml in PBS lösen und zu 1 ml Aliquots bei
-20°C einfrieren. Auf 100 ml Medium kommen davon 10,5 μl.
Transfizierte ES-Zellen werden 48 h nach der Elektroporation auf G418-Resistenz selektiert. Dem ES-
Zell-Medium wird 335 μg G418 / ml zugesetzt.
Die Gancyclovir-Selektion startet 24-48 h nach der G418-Selektion.
Etwa am 10. Tag nach Beginn der Selektionen werden überlebende Einzelklone gepickt.
Für diese werden Gewebekulturplatten vorbereitet:
In 6-Loch-Gewebekulturplatten wird 2 ml ES-Zellmedium (10% FKS) vorgelegt.
In 24-Loch-Gewebekulturplatten werden 1,5 x 10 5 mitotisch inaktivierte Mausfibroblasten pro Loch
ausgesät und für 3 h inkubiert.
Das Medium der Selektionsschalen wird abgesaugt, die Zellen einmal mit 1x PBS gewaschen und mit 10
ml 1x PBS bedeckt. Unter dem Mikroskop werden die Klone mit einer kurzen Pasteur-Pipette (steril)
durch leichtes Umkratzen gelöst und aufgesaugt. Die Zellen eines ES-Zellklons werden in 50 μl PBS in
ein Loch einer Mikrotiterplatte überführt, mit 2 Tropfen Trypsin/EDTA 5 min bei 37°C inkubiert und
durch mehrmaliges Aufziehen mit einer Pipette vereinzelt. Ein Drittel der Zellsuspension wird in ein Loch
einer 25-Loch-Gewebekulturplatte, der Rest in ein Loch einer 6-Loch-Platte gegeben.
Die ES-Zellen in den 6-Loch-Platten werden bis zur Konfluenz kultiviert, durch Trypsinisieren getrennt
und pelletiert. Aus dem Pellet wird genomische DNA gewonnen zur Analyse mittels Southern-Blot oder
PCR auf korrekte homologe Rekombinationsereignisse.
Die ES-Zellen in den 24-Loch-Gewebekulturplatten werden in DMSO-haltigem Medium eingefroren
(siehe unten).
Einfrieren und Auftauen von ES-Zellen
Das Einfriermedium entspricht bei Fibroblasten dem jeweiligen Kulturmedium zuzüglich 10% DMSO, bei
ES-Zellen 60% DMEM, 20% FKS, 20% DMSO. Die Zellen werden trypsinisiert, pelletiert und in kaltem
Einfriermedium resuspendiert, alsdann in vorgekühlte (0°C) Cryoröhrchen überführt und langsam auf -
70°C abgekühlt. Die Lagerung erfolgt in flüssigem Stickstoff.