Identifizierung und Charakterisierung von neuen Genen für die ...

Methoden
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Herstellung einer transgenen Maus
Präparation und mitotische Inaktivierung von Neomycin-resistenten
Fibroblasten
Die späteren embryonalen Stammzellen (ES-Zellen) zur Aufnahme des Knock-out-Vektors benötigen zur
Kultivierung so genannte Feeder-Zellen, was Fibroblastenzellen sind, die aus Mausembryonen präpariert
werden. Zur Präparation Neomycin-resistenter Fibroblasten als Feeder für ES-Zellen werden Mäuse des
Stammes CD-1.MTKneo2 (BRL, Basel) verwendet.
Eine trächtige Maus (Tag E13,5) wird getötet und die Embryonen werden entnommen. Diesen wird der
Kopf abgetrennt sowie Herz und Leber entfernt. Der restliche Embryokörper wird zerschnitten und in PBS
gespült. Das Embryogewebe wird in einem sterilen Erlenmeyerkolben mit 25 ml 0,25%igem Trypsin und
sterilen Glasperlen (∅ 4-5 mm) 15 min bei 37°C gerührt, die Trypsinisierung dann durch Zugabe von 25
ml DMEM gestoppt und der Ansatz durch ein Sieb in ein 50-ml-Plastikröhrchen filtriert. Nach
Pelletierung (5 min, 1200 rpm) werden die Zellen in DMEM resuspendiert und auf 10-cm-
Zellkulturschalen ausgesät.
Konfluente Maus-Fibroblasten werden unmittelbar vor Benutzung als Feederzellen durch Behandlung mit
Mitomycin-C mitotisch inaktiviert. Dazu wird dem Fibroblastenmedium Mitomycin-C zugesetzt (1:100
Verdünnung der Stammlösung von 2 mg auf 1,9 ml PBS und 0,1 ml DMSO) und für 2-3 h bei 37°C
inkubiert. Das Medium wird abgesaugt, die Zellen 3 Mal mit PBS gewaschen und trypsinisiert.
Anschließend werden die Zellen in einer Dichte von 5x10 6 Zellen pro 10 cm Platte ausgesät. Nach
Absetzen der Fibroblasten werden ES-Zellen auf dem Feederrasen ausgesät.
Kultivierung embryonaler Stammzellen
Medium zur Kultivierung embryonaler Stammzellen:
DMEM, hoher Glukosegehalt (4500 mg/ml, GibcoBRL) + 15% FKS (Boehringer) + 1x nicht-essentielle
Aminosäuren (GibcoBRL, 100x), 1 mM Na-Pyruvat (100 mM, GibcoBRL) + 2 mM L-Glutamin (200
mM, GibcoBRL) + 100 U/ml Penicillin/Streptomycin (GibcoBRL) + 0,1 mM β-Mercaptoethanol + LIF
(Leukemia Inhibitory Factor).
Die embryonalen Stammzellen werden auf Feeder-Rasen aus mitotisch inaktivierten Mausfibroblasten
kultiviert. Das Medium (siehe oben) wird täglich gewechselt. LIF verhindert eine Differenzierung der ES-
Zellen.
DNA-Transfer in embryonale Stammzellen durch Elektroporation
Elektroporationspuffer:
20 mM Hepes pH 7,0 + 137 mM NaCl + 5 mM KCl + 0,7 mM Na2HPO4 + 6 mM Glukose + 0,1 mM β-
Mercaptoethanol, sterilfiltriert.