Identifizierung und Charakterisierung von neuen Genen für die ...

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Bei der Annotierung der Gene (siehe ab Seite 32) stellten unter den bereits bekannten Genen die Transkriptionsfaktoren
(19 Gene) die größte Einzelfraktion. Bei den unbekannten ESTs waren diese hingegen
nur noch die drittgrößte Fraktion (17 Gene). Dies mag daran liegen, dass sich die bisherige
Entwicklungsforschung im Gehirn auf vornehmlich Transkriptionsfaktoren konzentrierte und nach
solchen gesucht hat.
Auffallend bei den ESTs war der hohe Anteil von Genen, die der Signaltransduktion annotierten (24
Gene) in Relation zu den bereits bekannten (7 Gene). Da die Hauptfunktion des Gehirnes und Cortex die
Signalverarbeitung ist, wundert es nicht, dass diese Proteinklasse zahlreich vertreten ist. Es könnte sein,
dass dieser auch während der Entwicklung eine größere Bedeutung als bisher angenommen im Vergleich
mit Transkriptionsfaktoren beizumessen wäre. Andererseits könnte sich darin für das Stadium E18,5 auch
eine bereits sich etablierende funktionelle Identität der Cortexregionen niederschlagen als Folge
vorhergegangener Determinierungsschritte. Das Stadium E18,5 befindet sich schließlich am Ende der
embryonalen Cortexentwicklung, so dass weniger initiierende Gene als von Determinanten abgeleitete
Gene (downstream targets) erwartet werden können, die corticale Identitäten nicht mehr wesentlich
bestimmen, sondern bestehende weiter zu manifestieren helfen, folglich weniger neue Transkriptionsfaktoren
als mehr Effektorproteine wie Signaltransduktoren.
Die hohe Anzahl an nicht annotierbaren Sequenzen unbekannter Funktion (26 Gene) bei den ESTs
überrascht nicht und stellt für zukünftige Forschungen das größte Potential.
Verifizierung der Chip-Daten mittels ISH gibt eine erste Charakterisierung
für neu gefundene Gene
Die Vorhersagen der Microarray-Experimente wurden durch in-situ-Hybridisierungen verifiziert und
weiter spezifiziert. Insgesamt wurden für das Stadium E18,5 ca. 80 ISH gemacht, wobei sich eine
Übereinstimmung mit den Chip-Daten zu 70% ergab. Nicht übereinstimmende Gene zeigten entweder gar
kein Signal oder nur Hintergrund, d.h. die ISH-Sonde funktionierte nicht, oder ein widersprüchliches
Ergebnis, d.h. Expression woanders im Körper nur nicht im Gehirn. Die Ursache hierfür ist einmal in der
Konzeption der Microarray-Experimente zu sehen, die ohne statistische Repetitionen angelegt wurden,
weil man stattdessen mit ISH im nächsten Schritt filterte. Des Weiteren müssen die für ISH ausgesuchten
Sequenzen nicht immer identisch mit den Genabschnitten auf den Chips gewesen sein und z.B.
Splicevarianten von Genen können dann gewebsspezifisch unterschiedliche Expressionen zeigen. Oftmals
funktionieren bestimmte Sondern auch nicht und man müsste diese optimieren und benachbarte
Genabschnitte alternativ wählen. Solche Optimierungen waren aber für jedes einzelne Gen eines Screens
zu aufwändig, so dass man sich ökonomisch zunächst auf die funktionierenden konzentrierte. Die
Ergebnisse der ISH aller am Cortex-Projekt beteiligten Gruppen wurden in eine Datenbank eingetragen,
die bald online zur Expressionskartierung im Cortex der Maus öffentlich zur Verfügung gestellt werden
soll.
Ein besonderes Augenmerk galt den neu entdeckten ESTs oder bekannten Genen, die bisher noch nicht für
das Gehirn und den Cortex charakterisiert worden waren. Mit Fortschreiten der Annotationsmöglichkeiten
sank deren Zahl im Laufe der Zeit. In dieser Arbeit sind diejenigen neuen ESTs dargestellt, die für das
Stadium E18,5 nach wie vor unbekannt sind und Gegenstand einer Veröffentlichung sein sollen.
Klon 137 – Nse1
Klon 137 zeigt eine sehr gute Übereinstimmung zwischen ISH und den Microarray-Vorhersagen. Die
Expression ist sehr spezifisch für das Gehirn und regionalisiert im Cortex. Im Körper ist hingegen keine
oder kaum eine Expression messbar. Die Microarray-Sequenzen wie auch die ISH-Sonde annotieren zu
dem Maus-Homolog des bereits in Mensch und Hefe bekannten Gens Nse1. Auch wenn dieses Gen schon
seit einiger Zeit bekannt ist – der erste Eintrag in PubMed datiert auf Juni 2002 – und seit dem über 10