Charakterisierung der Signaltransduktionsmechanismen bei ...

Aus dem Institut für Reproduktionsmedizin
der Tierärztlichen Hochschule Hannover
Charakterisierung der Signaltransduktionsmechanismen
bei osmotisch induzierter Volumenregulation von
Spermatozoen am Ebermodell
INAUGURAL-DISSERTATION
Zur Erlangung des Grades einer Doktorin
der Veterinärmedizin
(Dr. med. vet.)
durch die Tierärztliche Hochschule Hannover
Vorgelegt von
Eyke Christina Jebe
aus Lübeck
Hannover 2003
n

Wissenschaftliche Betreuung:
Univ.-Prof. Dr. rer. nat. Dr. med. habil. Edda Töpfer-Petersen
1. Gutachterin: Univ.-Prof. Dr. rer. nat. Dr. med. habil. Edda Töpfer-Petersen
2. Gutachter: Apl. Prof. Dr. rer. nat. Bernd Schröder
Tag der mündlichen Prüfung: 20. November 2003
Gefördert durch die Graduiertenförderung der Tierärztlichen Hochschule Hannover

Nimm dir Zeit
Um zu träumen.
Das ist der Weg
zu den
Sternen.
Aus Irland
In Liebe und aus ganzem Herzen
für meine Eltern
Renate und Hans-Jürgen Jebe
Ich danke Euch für alles.

Inhaltsverzeichnis
Inhaltsverzeichnis
A. Einleitung..........................................................................................................19
B. Literaturübersicht..........................................................................................21
1. Das Ejakulat..........................................................................................................21
1.1. Das Seminalplasma..................................................................................21
2. Die Morphologie des Spermatozoon..................................................................23
2.1. Grundbaustein Zelle.................................................................................23
2.2. Das Spermatozoon - eine besondere Zelle..............................................24
3. Physiologie der Samenzelle...............................................................................29
3.1. Die Plasmamembran................................................................................29
3.1.1. Aufbau............................................................................................29
3.1.2. Funktionen......................................................................................31
3.2. Regulation von Wassergehalt und osmotischem Druck...........................33
3.2.1. Physiologische Grundlagen............................................................33
3.2.2. Der hypoosmotische Schwelltest (HOST)......................................37
3.3. Kapazitation..............................................................................................38
3.4. Signalübertragung....................................................................................40
3.4.1. Allgemeine Mechanismen der Signalübertragung in Zellen...........40
3.4.2. Tyrosinphosphorylierung bei der Signalübertragung von Zellen...43
3.4.3. Signalübertragung bei der Volumenregulation von Zellen.............44
3.4.4. Signalübertragung bei Spermatozoen...........................................47

Inhaltsverzeichnis
C. Eigene Untersuchungen..............................................................................54
1. Versuchskonzeption............................................................................................54
2. Material und Methoden........................................................................................54
2.1. Gewinnung und Aufbereitung der Spermien.............................................54
2.1.1. Probanden......................................................................................54
2.1.2. Gewinnung der Ejakulate................................................................54
2.1.3. Untersuchung der Ejakulatqualität..................................................55
2.1.4. Verdünnen und Lagern des Samens..............................................56
2.1.5. Aufbereitung der Spermien.............................................................56
2.2. Methodik und Messprinzip der Volumenmessung und Durchflusszytometrie................................................................................................57
2.2.1. Zellvolumetrische Messung (Zellvolumetrie).................................57
2.2.1.1. Messprinzip......................................................................57
2.2.1.2. Volumetrische Messung der Eberspermatozoen.............59
2.2.1.3. Modifizierter hypoosmotischer Schwelltest (HOS)...........60
2.2.1.4. Regulatory Volume Decrease (RVD) und Regulatory
Volume Increase (RVI)……………………………………...60
2.2.1.5. Statistische Auswertung der volumetrischen Messung....60
2.2.2. Durchflusszytometrische Untersuchungen............….....................62
2.2.2.1. Messprinzip.....................................................................62
2.2.2.2. Überprüfen der Membranintegrität der Spermatozoen...64
2.2.2.3. Untersuchung der Tyrosinphosphorylierung mit dem
Durchflusszytometer......................................................67
2.3. Immunfluoreszenzmikroskopischer Nachweis der Tyrosinphosphorylierung..........................................................................................................73
2.4. Elektrophoretische Untersuchung der Tyrosinphosphorylierung..............74
2.4.1. Herstellung der Spermienextrakte..................................................74
2.4.2. Eindimensionale SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese der
Spermienextrakte..........................................................................75
2.4.3. Transferieren der aufgetrennten Proteine......................................76

Inhaltsverzeichnis
2.4.4. Durchführung der Immunreaktion...................................................77
3. Einfluss verschiedener Inhibitoren unter unterschiedlichen osmotischen
Bedingungen.........................................................................................................79
3.1. Untersuchung des Einflusses der Lagerung auf die Volumenregulation
und Membranintegrität.............................................................................81
3.2. Untersuchung des Einflusses verschiedener Inhibitoren auf die Volumenregulation
unter verschiedenen osmotischen Bedingungen....................81
3.3. Untersuchung des Einflusses verschiedener Inhibitoren auf die Tyrosinphosphorylierung
unter verschiedenen osmotischen Bedingungen im
Durchflusszytometer................................................................................82
3.4. Untersuchung des Einflusses verschiedener Inhibitoren auf die Tyrosinphosphorylierung
unter verschiedenen osmotischen Bedingungen bei
der elektrophoretischen Auftrennung…...................................................82
4. Statistische Auswertung......................................................................................83
D. Ergebnisse........................................................................................................84
1. Einfluss verschiedener Inhibitoren auf die Volumenregulation unter
unterschiedlichen osmotischen Bedingungen..................................................84
1.1.Einfluss der Lagerung auf die Volumenregulation und Membranintegrität....................………………...........................................................84
1.2.Einfluss verschiedener Inhibitoren auf die Volumenregulation
unter verschiedenen osmotischen Bedingungen.….................................85
1.2.1. Isoosmotische Bedingungen......................................................85
1.2.1.1. Einfluss der Proteinkinase-Inhibitoren........................85
1.2.1.2. Einfluss der Proteinphosphatase-Inhibitoren und
des Phosphodiesterase-Inhibitors..............................87
1.2.1.3. Einfluss der Inhibitoren des cAMP-Spiegels
und verschiedener Ionenkanäle.................................89
1.2.2. Hypoosmotische Bedingungen...................................................93

Inhaltsverzeichnis
1.2.2.1. Einfluss der Proteinkinase-Inhibitoren........................93
1.2.2.2. Einfluss der Proteinphosphatase-Inhibitoren und
des Phosphodiesterase-Inhibitors............................. 96
1.2.2.3. Einfluss der Inhibitoren des cAMP-Spiegels und
verschiedener Ionenkanäle........................................98
1.2.3. Hyperosmotische Bedingungen................................................101
1.2.3.1. Einfluss der Proteinkinase-Inhibitoren......................102
1.2.3.2. Einfluss der Proteinphosphatase-Inhibitoren und
des Phosphodiesterase-Inhibitors............................104
1.2.3.3. Einfluss der Inhibitoren des cAMP-Spiegels und
verschiedener Ionenkanäle......................................106
1.2.4. Einfluss der Inhibitoren auf die Membranintegrität...................110
1.2.5. Ermittlung der optimalen Wirkstoffkonzentrationen der
Inhibitoren...............................................................................110
2. Untersuchung der Tyrosinphosphorylierung unter verschiedenen
osmotischen Bedingungen............................................................................111
2.1. Überprüfung der Spezifität des bei der durchflusszytometrischen
Methode eingesetzten Antikörpers.....................................................111
2.2. Einfluss verschiedener Inhibitoren auf die Tyrosinphosphorylierung im
Durchflusszytometer.............................................................................114
2.2.1. Isoosmotische Bedingungen.....................................................114
2.2.1.1. Einfluss der Proteinkinase-Inhibitoren......................114
2.2.1.2. Einfluss der Proteinphosphatase-Inhibitoren und
des Phosphodiesterase-Inhibitors...........................115
2.2.1.3. Einfluss der Inhibitoren des cAMP-Spiegels und
verschiedener Ionenkanäle......................................116
2.2.2. Hypoosmotische Bedingungen.................................................118
2.2.2.1. Einfluss der Proteinkinase-Inhibitoren......................118
2.2.2.2. Einfluss der Proteinphosphatase-Inhibitoren und
des Phosphodiesterase-Inhibitors...........................119

Inhaltsverzeichnis
2.2.2.3. Einfluss der Inhibitoren des cAMP-Spiegels und
verschiedener Ionenkanäle......................................122
2.2.3. Hyperosmotische Bedingungen.................................................122
2.2.3.1. Einfluss der Inhibitoren des cAMP-Spiegels und
verschiedener Ionenkanäle.........................................123
3. Immunfluoreszenzmikroskopischer Nachweis der Tyrosinphosphorylierung................................................................................................124
4. Tyrosinphosphorylierung unter verschiedenen osmotischen
Bedingungen bei der elektrophoretischen Auftrennung........................125
4.1. Überprüfung der Spezifität des für die Immunreaktion verwendeten
Antikörpers............................................................................................125
4.2. Einfluss verschiedener Inhibitoren auf die Tyrosinphosphorylierung
bei der elektrophoretischen Auftrennung................................................127
4.2.1. Isoosmotische Bedingungen........................................................128
4.2.1.1. Einfluss der Proteinkinase-Inhibitoren.......................128
4.2.1.2. Einfluss der Proteinphosphatase-Inhibitoren und
des Phosphodiesterase-Inhibitors...........................128
4.2.1.3. Einfluss der Inhibitoren des cAMP-Spiegels und
verschiedener Ionenkanäle......................................128
4.2.2. Hypoosmotische Bedingungen....................................................130
4.2.3. Hyperosmotische Bedingungen...................................................130
E. Diskussion......................................................................................................132
1. Erfassung der in der Volumenregulation etablierten Mechanismen.............132
1.1. Signalübertragung bei der Volumenregulation von Spermien.............132
1.2. Phosphorylierungen bei der Signaltransduktion..................................133
1.3. Wirkungsmechanismen der Signalübertragung unter isoosmotischen
Bedingungen..................................................................134
1.4. Wirkungsmechanismen der Signalübertragung unter hypoosmotischen
Bedingungen..................................................................136

Inhaltsverzeichnis
1.5. Wirkungsmechanismen der Signalübertragung unter hyperosmotischen
Bedingungen..................................................................138
2. Entwicklung eines Modells der Signalübertragungsmechanismen bei
der Osmoregulation unter verschiedenen osmotischen Bedingungen
unter Einbeziehung der Phosphorylierung...................................................139
3. Anwendbarkeit der durchflusszytometrischen Untersuchung
für Tyrosinphosphorylierung.........................................................................143
4. Zusammenfassende Abschlussbetrachtung................................................146
F. Zusammenfassung......................................................................................147
G. Summary.........................................................................................................150
H. Literaturverzeichnis....................................................................................153
J. Anhang.............................................................................................................177
1. Rezepturverzeichnis...........................................................................................177
2. Messungen des pH-Wertes und der Osmolarität............................................187
3. Inhibitoren...........................................................................................................188
K. Danksagung....................................................................................194

Abkürzungsverzeichnis
Abkürzungsverzeichnis
Abb. Abbildung
A. dest. Aqua destillata
A. bidest. Aqua bidestillata
alk. alkalische
AP Alkalische Phosphatase
APS Ammoniumpersulfat
ATP Adenosintriphosphat
BCIP 5-Bromo-4-Chloro-3-indolylphosphate p-toluidine salt
BMW Broad Molecular Weight
BSA Bovine Serum Albumin (Rinderserumalbumin)
BTS Beltsville Thawing Solution
bzw. beziehungsweise
°C Grad Celsius
ca. circa
Ca 2+ Kalziumionen
cAMP cyclic adenosine monophosphate (zyklisches Adenosin-
monophosphat)
CASY Cell Counter and Analyzer System
cGMP cyclic guanosine monophosphate (zyklisches Guanosin-
monophosphat)
Cl -
Chloridionen
cm Zentimeter
CO2 Kohlenstoffdioxid
conj. conjugated (konjugiert)
d Tag
DAG Diacycglycerol
DMF N,N,-Dimethylformamid
DNA Desoxyribonucleic acid (Desoxyribonukleinsäure)
1D-Membran PVDF-Membran mit transferierten Proteinen nach 1D-PAGE

Abkürzungsverzeichnis
1D-PAGE eindimensionale Polyacrylamidgelelektrophorese
EDTA Ethylen-N,N,N,N-tetraessigsäure
ER Endoplasmatisches Retikulum
et al. et alii (und andere)
EZ Extrazellulärraum
Fa. Firma
fl Femtoliter
FL-1 Grünfluoreszenz
FL-2 Orangefluoreszenz
FL-3 Rotfluoreszenz
g Gramm, Erdbeschleunigung
FITC Fluoreszeinisothiocyanat
FSC forward scatter (Vorwärtsstreulicht)
GmbH Gesellschaft mit beschränkter Haftung
h hour (Stunde)
HBS Hepes Buffered Saline (Hepesgepufferte Kochsalzlösung)
HCl Salzsäure
Hydrogencarbonat
Hepes N-(2-hydroxyethyl)piperazin-N´-2-ethan
HOST Hypoosmotischer Schwelltest
I Stromstärke
Ig Immunglobulin
I hypo, 5 min Fluoreszenzintensität nach fünfminütiger Inkubation im
hypoosmotischen Medium
I hypo, 20 min Fluoreszenzintensität nach zwanzigminütiger Inkubation
im hypoosmotischen Medium
I hyper, 5 min Fluoreszenzintensität nach fünfminütiger Inkubation im
hyperosmotischen Medium
I hyper, 20 min Fluoreszenzintensität nach zwanzigminütiger Inkubation
im hyperosmotischen Medium
HCO3 -

Abkürzungsverzeichnis
I iso, 5 min Fluoreszenzintensität nach fünfminütiger Inkubation im
isoosmotischen Medium
I iso, 20 min Fluoreszenzintensität nach zwanzigminütiger Inkubation
im isoosmotischen Medium
Inkub. Inkubation
IP3 Inositol-1,4,5-triphosphat
IVF In-vitro-Fertilisation
IZ Intrazellulärraum
K +
Kaliumionen
KCl Kaliumchlorid
kDa Kilodalton
kg Kilogramm
KH2PO4 Kaliumhydrogenphosphat
KOH Kaliumhydroxid
konz. konzentriert
Konz. Konzentration
Lsg. Lösung
M Molar
mA Milliampere
mA/cm 2
Milliampere pro Quadratzentimeter
mg Milligramm
Mg 2+
Magnesiumionen
min Minute
Mio/mm 3
Millionen pro Kubikmillimeter
ml Milliliter
mmol Millimol
mM Millimolar
mosm/kg Konzentration gelöster, osmotisch wirksamer Teilchen pro
ein Kilogramm Lösungsmittel
MW arithmetischer Mittelwert
µg Mikrogramm

Abkürzungsverzeichnis
µl Mikroliter
µm Mikrometer
µM Mikromolar
n Anzahl der Werte
Na +
Natriumionen
NaCl Natriumchlorid
NaF Natriumfluorid
NaHCO3
Natriumhydrogenkarbonat
Na2HPO4
Di-Natriumhydrogenphosphat
NaOH Natriumhydroxid, Natronlauge
NBT Nitroblautetrazoliumchlorid, Nitro-BT
neg. negativ
nM Nanomolar
p Probabilität, Irrtumswahrscheinlichkeit
pAB p-Aminobenzamidine
PAGE Polyacrylamidgelelektrophorese
PBS Phosphat-Buffered-Saline (Phosphatgepufferte
Kochsalzlösung)
PDE Phosphodiesterase
pH negativer dekadischer Logarithmus der
Wasserstoffionenkonzentration
PI Propidiumjodid
PInsP2
Phosphatidyl-Inositol-bisphosphat
PKA Proteinkinase A
PKC Proteinkinase C
PLC Phospholipase C
PP Proteinphosphatase
PPi Sodium pyrophosphate
PTK Proteintyrosinkinase
PTP Proteintyrosinphosphatase
PVA Polyvinylalkohol

PVDF Polyvinylidene Difluoride
PVP Polyvinylpyrrolidon
® eingetragenes Warenzeichen
Abkürzungsverzeichnis
R Widerstand
RNA Ribonucleic acid (Ribonukleinsäure)
RVD Regulatory Volume Decrease (regulative
Volumenabnahme)
RVI Regulatory Volume Increase (regulative
Volumenzunahme)
s. siehe
SDS Sodium-Dodecyl-Sulfate
SH2
Schwefelhydroxid
sog. so genannt
SSC side scatter (Seitwärtsstreulicht)
Strept. Streptavidin
Tab. Tabelle
TBS Tris-Buffered-Saline (Trisgepufferte Kochsalzlösung)
TEMED N,N,N´N´-Tetramethylethylendiamin
TK Tyrosinkinase
Tris Tris(hydroxymethyl)-aminomethan
U Spannung
u. und
u.a. unter anderem
V Volt
v.a. vor allem
verd. verdünnt
Verd. Verdünnung
vgl. vergleiche
V hyper, 5 min Modalwert des Zellvolumens in hyperosmotischer Lösung
nach fünfminütiger Inkubation

Abkürzungsverzeichnis
V hyper, 20 min Modalwert des Zellvolumens in hyperosmotischer Lösung
nach zwanzigminütiger Inkubation
V hypo, 5 min Modalwert des Zellvolumens in hypoosmotischer Lösung
nach fünfminütiger Inkubation
V hypo, 20 min Modalwert des Zellvolumens in hypoosmotischer Lösung
nach zwanzigminütiger Inkubation
V hyper (korr) korrogierter Modalwert des Zellvolumens in hyper-
V hypo (korr)
osmotischer Lösung
korrigierter Modalwert des Zellvolumens in hypo-
osmotischer Lösung
V iso, 5 min Modalwert des Zellvolumens in isoosmotischer Lösung
nach fünfminütiger Inkubation
V iso, 20 min Modalwert des Zellvolumens in isoosmotischer Lösung
nach zwanzigminütiger Inkubation
V iso Modalwert des Zellvolumens in isoosmotischer Lösung
korrigiertes mittleres Spermienvolumen in
V mean hyper (korr)
hyperosmotischer Lösung
V mean hypo (korr) korrigiertes mittleres Spermienvolumen in
hypoosmotischer Lösung
V mean iso
mittleres Spermienvolumen in isoosmotischer Lösung
Vol. Volumen
Vr relative Volumenverschiebung
Vrh relative Volumenzunahme des Modalwertes in
hypoosmotischer Lösung
Vrh 5 relative Volumenzunahme des Modalwertes in
hypoosmotischer Lösung nach fünfminütiger Inkubation
Vrh 20 relative Volumenzunahme des Modalwertes in hypo-
osmotischer Lösung nach zwanzigminütiger Inkubation
Vrhy 5 relative Volumenabnahme des Modalwertes in
hyperosmotischer Lösung nach fünfminütiger Inkubation

Abkürzungsverzeichnis
Vrhy 20 relative Volumenabnahme des Modalwertes in hyper-
osmotischer Lösung nach zwanzigminütiger Inkubation
v/ v volume/volume (Volumen/ Volumen)
w/ v weight/ volume (Gewicht/ Volumen)
xg x-fache der Erdbeschleunigung
z.B. zum Beispiel
z.T. zum Teil
Die Begriffe Spermium, Spermatozoon und Samenzelle werden synonym verwendet.

A. Einleitung
19
A. Einleitung
Die Reizaufnahme und -beantwortung gilt als ein Charakteristikum der Zelle. Jede
Zelle ist darauf programmiert, auf spezifische Signale zu antworten. Sie beeinflussen
das Verhalten der Zelle und entscheiden, ob die Zelle leben oder sterben soll.
Die Plasmamembran einer Zelle ist dabei sehr wichtig, da die Membran die Grenze
zwischen Zelle und dem sie umgebenden Milieu darstellt. Transportproteine, Ionenkanäle
und Rezeptoren der Membran sind in die Volumenregulation und Signalübertragung
involviert (ALBERTS et al. 2002).
Signalübertragung ermöglicht dem Spermium, einer hoch spezialisierten, auf
Fortpflanzung ausgerichteten Zelle, die Anpassung an die sich vom Verlassen des
Hodens bis zur Befruchtung der Eizelle in der Eileiterampulle ständig verändernden
Bedingungen. Spermatozoen reagieren dabei sehr schnell auf osmotische
Veränderungen in ihrer Umgebung. Die genauen Signalübertragungsmechanismen
sind noch unklar und kaum erforscht. Da die Signalübertragungswege zell- und
speziesspezifisch sind, können Informationen nicht ohne weiteres übertragen werden
(TARDIF et al. 2003).
Da Phosphorylierungsreaktionen von Proteinen an der Regulation verschiedener
Spermienfunktionen wie Motilität, Kapazitation, Erkennung der Zona pellucida und
Gameteninteraktionen beteiligt sind (TARDIF et al. 2001), liegt die Vermutung nahe,
dass sie auch in die Volumenregulation involviert sind.
Im Rahmen der vorliegenden Studien sollten die membranabhängigen und
intrazellulären Transportmechanismen sowie eine anzunehmende Beteiligung der
Tyrosinphosphorylierung an osmotisch stimulierten Spermien in vitro untersucht
werden. Der Eber wurde als Modelltier ausgewählt, da die porcinen Spermien als
„perfektes Osmometer“ funktionieren, d.h. die Volumenveränderung verhält sich
umgekehrt proportional zur Osmolarität (PETROUNKINA u. TÖPFER-PETERSEN
2000). Es wurden die Effekte verschiedener Inhibitoren auf die möglicherweise
beteiligten Signalwege der Volumenregulation unter iso-, hypo- und
hyperosmotischen Bedingungen überprüft. Mittels eindimensionaler SDS-
Polyacrylamid-Gelelektrophorese und Immunoblotting wurden die tyrosin-

A. Einleitung
phosphorylierten Proteine analysiert. Der Grad der Tyrosinphosphorylierung wurde
zusätzlich mit dem Durchflusszytometer unter verschiedenen osmotischen
Belastungen und unter der Einwirkung verschiedener Inhibitoren, die Einfluss auf die
volumenregulatorischen Mechanismen erzielten, charakterisiert.
In der vorliegenden Arbeit sollte versucht werden, Informationen über die Signalübertragung
an der Plasmamembran porciner Spermien bei der Volumenregulation
unter verschiedenen osmotischen Bedingungen zu gewinnen. Außerdem wurde die
vermutete Beteiligung der Tyrosinphosphorylierung näher beleuchtet.
Das Ziel war es, ein Modell zu entwickeln, das die Zusammenhänge der in der
Signaltransduktion beteiligten Mechanismen darstellt, um einen Beitrag zum
Verständnis der Zellphysiologie der Spermien zu leisten.
20

B. Literaturübersicht
1. Das Ejakulat
21
B. Literaturübersicht
Als Ejakulat oder Sperma bezeichnet man die Flüssigkeit, die von männlichen Tieren
beim Deckakt abgegeben wird. Von den Spermatozoen ist das Seminalplasma zu
unterscheiden, das sich aus den Sekretionsprodukten des männlichen Genitale
zusammensetzt. Bei der Ejakulation kommen die Spermien mit dem flüssigen Anteil
in Kontakt. Die Zusammensetzung des Ejakulates hängt vom Verhältnis der beiden
genannten Bestandteile zueinander sowie von den männlichen Geschlechtsdrüsen
(Größe, Lagerungskapazität, Sekretionsleistung) ab (MANN 1954). Beim Eber
beträgt das Volumen etwa 150-200 ml.
Neben ausdifferenzierten Spermien, von denen ein Eberejakulat durchschnittlich
60 Milliarden enthält, weist das Ejakulat auch eine geringe Anzahl unreifer
Samenzellen auf. Weitere im Sperma anzutreffende Zellen sind abgestoßene
Epithelzellen, kernlose Zytoplasmatropfen und Leukozyten.
Zunächst soll auf den flüssigen Bestandteil des Ejakulates eingegangen werden.
1.1. Das Seminalplasma
Beim Seminalplasma handelt es sich um den gesamten spermienfreien Teil des
Ejakulates. Dieser flüssige Bestandteil des Spermas besteht aus den Sekreten der
akzessorischen Geschlechtsdrüsen, Hoden, Nebenhoden und exkretorischen
Gängen. Nicht alle gebildeten Sekrete gelangen ins Ejakulat, ein Teil wird vorher
rückresorbiert, dabei handelt es sich im Wesentlichen um Material, das im Hoden,
dem Nebenhoden und den Ausführungsgängen gebildet wird (MANN 1981). Wasser
stellt mit 98% den Hauptbestandteil des Seminalplasmas dar (KÖNIG 1990, WEITZE
u. MÜLLER 1991). Weitere Inhaltsstoffe sind Nährstoffe wie Fructose, Sorbit, Inosit
und Lactat, freie Aminosäuren, Proteine, Lipide, Ionen sowie niedermolekulare
Verbindungen (SCHÜLKE 1991). Die Zusammensetzung des Seminalplasmas

B. Literaturübersicht
variiert nach Tierart, Rasse, Zuchtsaison, reproduktiver Belastung. PETZOLDT u.
NEHRING (1986) berichten hinsichtlich der Ionenkonzentrationen über
Speziesunterschiede, besonders die Angaben zu den Na + - und K + -Konzentrationen
variieren sehr stark und zeigen tierartspezifische Unterschiede (PETZOLDT et al.
1985). Die Osmolarität des Seminalplasmas beträgt 304±7 mosm/kg (VENGUST
1983).
Das Seminalplasma hat verschiedene Funktionen: Es ist für den passiven Transport
der noch unbeweglichen Spermien während der Ejakulation im weiblichen Genitale
zuständig. Nach der Ejakulation regt es die Spermien zu Schwanzbewegungen an.
Da die Energiereserven der Spermatozoen nur für etwa 30 Sekunden ausreichen,
stellt das Seminalplasma energiereiche Substanzen in Form von Glukose und
Fruktose für die Bewegung zur Verfügung. Die Spermien wandeln diese durch
Zellatmung und Glykolyse in Adenosintriphosphat (ATP) um. Seminalplasma stellt
also die Energiequelle für die Motilität der Spermatozoen dar. Das Seminalplasma
besitzt auch eine puffernde Wirkung und es stimuliert die Aktivität und den
Stoffwechsel der Spermien. Das Seminalplasma nimmt außerdem Einfluss auf die
Kapazitation. Es übt einen dekapazitierenden Effekt auf die Spermien aus (SUZUKI
et al. 2002). Die Proteine des Seminalplasmas lagern sich bei der Ejakulation an die
Spermien an, ummanteln die Spermienoberfläche durch Interaktionen mit cholinen
Phospholipiden, stabilisieren auf diese Weise die Membran und verhindern die
vorzeitige Akrosomreaktion (TÖPFER-PETERSEN et al. 1996, MANJUNATH 2002).
THÉRIEN et al. (2001) beschreiben, dass es bei der Entfernung der Proteine des
Seminalplasmas zur Stimulation des Lipideffluxes aus der Spermienmembran
kommt, ein kapazitationsfördernder Effekt liegt vor.
22

2. Die Morphologie des Spermatozoon
23
B. Literaturübersicht
Nachdem im vorangegangenen Abschnitt der flüssige Bestandteil des Ejakulates
beschrieben worden ist, soll im Folgenden auf die Morphologie und Physiologie der
Spermatozoen näher eingegangen werden.
2.1. Grundbaustein Zelle
Die Zelle stellt die kleinste, noch lebensfähige morphologische Baueinheit dar. Drei
Charakteristika kennzeichnen sie: Die Zelle ist vermehrungsfähig, reizbar in Form
von Reizaufnahme und –beantwortung, und sie muss ihre Struktur gemäß dem
zweiten Hauptsatz der Thermodynamik (Entropiesatz) mit Hilfe eines Stoffwechsels
aufrechterhalten.
Die Zelle ist von einem System von Membranen gekennzeichnet: Die Plasmamembran
grenzt die Zelle nach außen ab und umschließt das Zytoplasma, das die
Gestalt der Zelle bestimmt. Weitere Membranen teilen das Plasma in verschiedene,
geschlossene, getrennt gesteuerte Reaktionsräume (Kompartimente). Gut untersuchte
Kompartimente stellen die von intrazellulären Membranen umgebenen
Zellorganellen dar.
Das größte Zellorganell bildet der die genetische Information (DNA) enthaltende
Zellkern. Bei somatischen Zellen besitzt er in der Regel ein Genom aus zwei
einander entsprechenden Chromosomensätzen (2n), er wird als diploid bezeichnet.
Mit der äußeren Membran des Zellkerns ist das Endoplasmatische Retikulum (ER)
verbunden. Es besteht aus einem in sich geschlossenen System flacher Höhlen und
Röhren. Zu unterscheiden ist das rauhe (granuläre), auf der Oberfläche Ribosomen
aufweisende Endoplasmatische Retikulum (rER) vom glatten (agranulären) (gER).
Während das rER eine Rolle bei der aktiven Proteinbiosynthese spielt, findet im gER
die Lipid- und Phospholipidsynthese statt. Das gER dient weiterhin als Calciumspeicher,
der für den Erhalt eines niedrigen Ca 2+ -Spiegels im Zytoplasma sorgt.
Im Golgi-Apparat findet die Reifung von Proteinen statt, außerdem transportiert er
Membranlipide und Proteine zu ihren Zielen.

B. Literaturübersicht
Zu den Organellen gehören auch die Mitochondrien, die als Haupterzeuger des
Adenosintriphosphates (ATP) durch den oxidativen Abbau von Nahrungsstoffen als
„Kraftwerke“ der Zelle fungieren. In den Mitochondrien finden der Zitrat-Zyklus, der
Abbau von Fettsäuren durch β-Oxidation, die mit der Atmungskette gekoppelte
Synthese von ATP (oxidative Phosphorylierung) und Teile des Harnstoffzyklus statt.
Lysosomen und Peroxisomen sind ebenfalls kleinere, kugelförmige Organellen mit
bestimmtem Enzymbesatz, zu dem auch Hydrolasen und Katalasen gehören, die
dem Abbau der in die Vesikel aufgenommenen Substanzen dienen. Die Oxidasen
und Katalasen enthaltenden Peroxisomen nehmen u.a. am Fettstoffwechsel teil.
Endosomen und Exosomen stellen bläschenförmige Vesikel dar, die am Stoffaustausch
der Zelle mit ihrer Umgebung beteiligt sind.
Trotz eines allgemeinen Grundbauplans gibt es nicht die Zelle schlechthin. Sie tritt in
bestimmter Gestalt, Differenzierung und Determination auf. Trotz Spezialisierung auf
unterschiedliche Aufgaben sind die Zellorganellen allen verschiedenen Zelltypen
gemeinsam. Die wesentlichen, allgemeinen Aussagen dieses Abschnitts sind
ALBERTS et al. (2002) entnommen.
2.2. Das Spermatozoon - eine besondere Zelle
Bei dem Spermatozoon handelt es sich um eine kleine (50-70 µm lange), kompakte,
hochspezialisierte Zelle, die der Fortpflanzung dient. Das Ziel dieser besonderen
Zelle besteht darin, die Gene, das väterliche Erbgut, das sie trägt, weiterzugeben. Ihr
Bauplan ist auf dieses Ziel ausgerichtet und optimiert. Das Spermatozoon muss fähig
sein, die zum Erlangen der Befruchtungsfähigkeit erforderlichen, als Kapazitation
zusammengefassten Reifungsvorgänge im weiblichen Genitale zu durchlaufen. Die
Kapazitation befähigt die Spermatozoen zur Hyperaktivierung und Akrosomreaktion.
Bei der Akrosomreaktion handelt es sich um eine von der Zona pellucida der Eizelle
ausgelöste Exozytose des Akrosoms. Durch Punktfusionen der äußeren
akrosomalen und der darüber befindlichen Plasmamembran entstehen Vesikel,
durch die akrosomale Enzyme freigesetzt werden. Die freigesetzten Enzyme führen
zur Proteolyse der Zona pellucida, die dann ein hyperaktiviertes Spermium
24

25
B. Literaturübersicht
penetrieren kann. Daraufhin erfolgt die Befruchtung, die Verschmelzung der
männlichen und weiblichen Gamete zur Zygote. Die Abb. 1 stellt die funktionellen
Kompartimente des Spermatozoon und ihre Aufgaben dar.
Penetration der Zona pellucida
Fusion mit der
Eizelle
Energie
versorgung
Motilität
Akrosom
Nukleus
Postakrosomale Region
Mittelstück
Schwanz
Abb. 1: Schematische Darstellung des Spermiums: Funktionelle Kompartimente
des Spermatozoons (blau) und ihre Aufgaben (rot)
Das Spermatozoon zählt zu den am stärksten polarisierten Zelltypen (TÖPFER-
PETERSEN u. WABERSKI 2001). ALBERTS et al. (2002) bezeichnen „typische
Spermien“ als „`abgespeckte` Zellen“, denen zytoplasmatische Organellen wie
Ribosomen, Endoplasmatisches Retikulum, Golgi-Apparat fehlen, da diese für die
Aufgabe der Spermien, die DNA des Vatertieres zur Eizelle zu bringen, nicht von
Nutzen sind. Dieser außergewöhnliche Zelltyp ist fast plasmafrei. Statt dessen
verfügt die Samenzelle über zwei charakteristische morphologisch und funktionell
unterscheidbare Regionen, die von einer gemeinsamen Plasmamembran umschlossen
und nach außen abgegrenzt werden: Der Schwanz, der dem Spermium
die aktive Bewegung zur Eizelle ermöglicht und ihm hilft, sich durch die Eihülle zu
bohren, sowie den die DNA enthaltenden Spermienkopf.
Der Kopf des Spermiums ist annähernd oval, 7-10 µm lang, 4-5 µm breit und an den
Seiten abgeflacht (DÖCKE at al. 1982). Der Zellkern nimmt den größten Teil des
Spermienkopfes ein und besteht als Träger der genetischen Information aus
hochgradig kondensiertem Chromatin (MONESI 1976). Ein wichtiger Unterschied zu
somatischen Zellen besteht darin, dass Spermatozoen aufgrund der Reduktion des

B. Literaturübersicht
diploiden Chromosomensatzes im Laufe der Reifeteilung nur über einen haploiden
Satz (n) verfügen. Bei der Befruchtung der Oozyte entsteht durch die Vereinigung
der zwei haploiden Sätze (n+n) dann wieder ein diploider Chromosomensatz (2n).
Der Zellkern weist ein deutlich kleineres Volumen auf als bei somatischen Zellen, er
ist von einer äußeren und einer inneren Kernmembran umgeben. Etwa die Hälfte bis
zwei Drittel des apikalen Spermienkopfes wird von der auch als Akrosom
bezeichneten Kopfkappe bedeckt.
Bei dem Akrosom handelt es sich um ein modifiziertes Lysozym, das aus den
Vesikeln des Golgi-Apparates entsteht. Die Kopfkappe enthält Enzyme, die für den
Befruchtungsvorgang unentbehrlich sind. Bei Kontakt mit der Oozyte (Eizelle)
werden diese Enzyme aktiviert. Es kommt zur Freisetzung der Enzyme, die zur
kontrollierten Proteolyse der Zona pellucida führen. Das Spermium kann dann die
Zona pellucida penetrieren. Schließlich ermöglicht dieser Vorgang die Verschmelzung
mit dem weiblichen Zellkern (MONESI 1976, SCHÜLKE 1991, YANAGIMACHI
1994).
Der Spermienschwanz (Geißel) enthält ein zentrales Axonem, das aus dem direkt
unterhalb des Kernes gelegenen Basalkörper hervorgeht. Das Axonem besteht aus
einem Filamentkomplex mit gleichartiger Struktur, einem Mikrotubulussystem mit
einer 9x2 Fibrillenstruktur und ist von einer fibrinösen Hülle umschlossen. Der
Schwanz gliedert sich in vier Abschnitte oder Regionen: den Hals, das Mittelstück,
Haupt- und Endstück. Die Halsregion, die auch als Verbindungsstück bezeichnet
wird, verbindet den Spermienkopf mit dem Mittelstück der Geißel. Dieser Teil des
Spermiums ist sehr empfindlich, somit treten hier leicht Läsionen auf. Die Halsregion
besteht aus einer in der Eindellung des Kernes gelegenen Basalplatte und dem
peripheren, segmentierten Streifenkörper. Der Hals enthält die Zentriolen. Das
Mittelstück besitzt zentral einen von einer spiraligen Mitochondrienscheide umgebenen
Achsenfaden. Die vielen Mitochondrien sind als Energielieferanten hier
strategisch sehr günstig gelegen, da sie die Geißel besonders gut mit ATP versorgen
können. Die Mitochondrienscheide ermöglicht die lichtmikroskopische Abgrenzung
vom sich anschließenden Haupt- und Endstück. Am Übergang zum Hauptstück
befindet sich der sog. Schlussring. Das Hauptstück bildet den längsten Abschnitt der
26

27
B. Literaturübersicht
Geißel. Es setzt sich aus einem Achsenfaden und Begleitfasern zusammen, die von
einer fibrillären Hülle umgeben sind. Das Endstück weist im Gegensatz zum
Hauptstück weder Begleitfasern noch eine Fibrillenscheide auf. Der Achsenfaden ist
nur von dem Plasmalemm umgeben (SETCHELL 1982, SCHNORR 1996). Die
Morphologie des Spermatozoon ist zur Veranschaulichung in der Abb. 2 dargestellt.
Die Geißel ist für die Fortbewegung und die Penetration der Eizelle von großer
Bedeutung. Die aktive Bewegung entsteht durch das Gegeneinanderschieben von
zwei benachbarten Mikrotubulipaaren.
Die einzelnen Abschnitte der Plasmamembran werden nach der zu umhüllenden
Region verschieden benannt.
Mit dem Eintritt in die Geschlechtsreife beginnen in den Samenkanälchen zyklisch
ablaufende Samenbildungsprozesse, vorher unterliegen die männlichen Keimzellen
einem Meioseblock (TÖPFER-PETERSEN u. AURICH 2000). Die Vermehrung der
Spermatogonien findet in drei Phasen, der Vermehrungs-, Wachstums- und
Reifungsperiode, statt. In ihrem Verlauf entstehen aus den Spermatogonien über die
Stufe der Spermatozyten I. und II. Ordnung Spermatiden. In Bezug auf die
morphologische Betrachtung des Spermiums ist v.a. der letzte Abschnitt der Samenzellbildung,
die Spermiogenese, interessant, da sich während dieser
Differenzierungsperiode aus runden Spermatiden die Spermien entwickeln und die
baulichen Besonderheiten entstehen. In der aus vier Stufen (Golgi-, Kappen-,
Akrosom- und Reifephase) bestehenden Spermiogenese kommt es zur Ausbildung
des Akrosoms, Umgestaltung des Zellkerns und Entwicklung der Geißel. Der
Hauptteil des Zytoplasmas mit Golgi-Apparat, Lipidtropfen und Ribosomen wird
eliminiert (SCHNORR 1996).

B. Literaturübersicht
Abb. 2: Schematische Darstellung der Ebersamenzelle (nach GADELLA 1994)
A. Querschnittdarstellung des Spermiums
B. Regionen der Plasmamembran der Spermienzelle (Darstellung der Oberfläche)
C. Akrosomreaktion
Alle durchgezogenen Linien stellen die Membrandoppelschichten dar:
1. Plasmamembran, 2. äußere akrosomale Membran, 3. akrosomale Flüssigkeit,
4. innere akrosomale Membran, 5. Kernhülle, 6. Kern, 7. Kernring und Manschette,
8. Mitochondrien, 9. proximaler Teil des Flagellums, 10. Schlussring, 11. distaler Teil
des Flagellums, 12. Fibrillen, 13.–16. bezeichnen die Segmente der Plasmamembran:
13. Apikalsegment, 14. Prääquatoriales Segment, 15. Äquatoriales
Segment, 16. Postäquatoriales Segment, 17. Vesikel, die während der Akrosomreaktion
durch Fusion der Plasmamembran mit der äußeren akrosomalen Membran
gebildet werden
28

3. Physiologie der Samenzelle
3.1. Die Plasmamembran
29
B. Literaturübersicht
Die Plasmamembran ist sehr wichtig für die Zelle, da die Membran als Grenze
zwischen Zelle und dem sie umgebenden Milieu dafür sorgt, dass ein konstantes
inneres Milieu geschaffen und erhalten wird. Auch im Hinblick auf die im Rahmen
dieser Studien interessierende Volumenregulation und Signalübertragung spielt die
Membran eine bedeutende Rolle. Somit soll auf diese Begrenzung der Zelle genauer
eingegangen werden.
3.1.1. Aufbau
Bei der Plasmamembran handelt es sich um eine lamelläre Doppelmembranstruktur
oder Lipiddoppelschicht. Man unterscheidet drei Lipidklassen: Phospholipide,
Glykolipide und Cholesterol.
Phospholipide, die mit 20-25% den Hauptanteil bilden, bestehen aus einem polaren,
hydrophilen Kopfstück und zwei unpolaren, hydrophoben Schwänzen. Diese zwei
Bausteine der Phospholipide führen dazu, dass sich die Phospholipide in wässrigem
Milieu so anordnen, dass die hydrophoben Kohlenwasserstoffketten nicht mit der
umgebenden Lösung in Kontakt kommen. Man beobachtet dabei zwei verschiedene
Anordnungen der Phospholipide: Zum einen können Mizellen entstehen. Diese
weisen eine kugelförmige Gestalt auf. Die hydrophoben Schwänze zeigen zur Mitte,
die hydrophilen Köpfe sind dem wässrigen Milieu zugewandt. Zum anderen kann
eine Doppelschicht auftreten. Diese ist im Gegensatz zu den Mizellen nicht
kugelförmig sondern flächig. Aufgrund der amphipathischen Eigenschaften werden in
wässrigen Lösungen spontan Doppelschichten mit hydrophoben Innenbereichen und
einer hydrophilen Oberfläche gebildet. Dieses Phänomen wird als „fluid mosaic
model“ bezeichnet (SINGER u. NICHOLSEN 1972). Die Schwänze zweier Phospholipide
sind also einander zugewandt, mit den Nachbarmolekülen liegen die
Phospholipide Kopf an Kopf. Diese Struktur der Doppelschicht findet man bei den

B. Literaturübersicht
biologischen Membranen. Auf diese Weise sind die Zellen gegen den Eintritt der
meisten wasserlöslichen Moleküle undurchlässig. Innerhalb der Membran findet eine
ATP-abhängige Bewegung der Phospholipide statt, die v.a. von der äußeren zur
inneren Membranschicht verläuft (GADELLA et al. 1999).
Der Anteil des die zweite Lipidklasse bildenden Cholesterols ist mit bis zu zehn
Prozent sehr hoch, das ist charakteristisch für die Spermienplasmamembran
(ALBERTS et al. 2002).
In diese Lipiddoppelschicht sind Proteine auf verschiedene Art und Weise eingebaut:
Bei den integralen Proteinen gibt es einige, die die Membran vollständig durchdringen
(HOUSLEY u. STANLEY 1982), man spricht von sog. Tunnelproteinen, aus
denen Kanäle und Poren bestehen. Andere integrale Proteine sind tief in die
Lipiddoppelschicht eingebaut, ragen aber nur aus einer Membranoberfläche heraus.
Sind sie an der extrazellulären Seite der Membran in dem hydrophilen Bereich
verankert, handelt es sich um Ektoproteine, befinden sie sich auf der dem
Intrazellulärraum zugewandten Membranseite, sind es Endoproteine. Einige Proteine
sind in der Lage, sich lateral in der Membran zu bewegen.
Insgesamt machen die Proteine 60-70% des Gewichtanteils der Membranmasse
aus. Viele der peripheren und integralen Proteine weisen Kohlenhydratseitenketten
mit negativen Ladungen auf, die als Glykolipide oder Glykoproteine kovalent
gebunden sind. Mit Hilfe dieser Seitenketten können Moleküle aus dem umgebenden
Milieu locker gebunden werden. Es entsteht auf der extrazellulären Seite der
Plasmamembran eine Schutzschicht, die als „surface code“ bezeichnet wird (AMANN
u. PICKETT 1987).
Die Plasmamembran stellt eine zweidimensionale Flüssigkeit mit einer dynamischen
und einer flexiblen Struktur dar. Transversalbewegungen einzelner Moleküle sind
innerhalb der Lipidphase möglich, das ist für den Ablauf metabolischer Zellfunktionen
notwendig.
Beim molekularen Bau der Spermienmembran herrschen bezüglich der Fluidität und
Membrantransportmechanismen regionale Unterschiede (ROVAN 2001). Die
Membranfluidität ist von der Temperatur, der Fettsäurezusammensetzung und dem
Verhältnis zwischen Cholesterin und Phospholipiden abhängig (QUINN 1981).
30

31
B. Literaturübersicht
Verschiebt sich das Verhältnis Cholesterin-Phospholipide zugunsten der Phospholipide,
wie es während der Kapazitation (s. Abschnitt 3.3. Kapazitation) zu
beobachten ist (DAVIS 1978), wird die Membran in ihrer Gesamtheit durchlässiger
und flüssiger (LANGLAIS u. ROBERTS 1985). Es herrschen bezüglich des
Cholesterin-Phospholipid-Verhältnisses tierartliche Unterschiede. Eberspermien
weisen einen geringeren Cholesterolgehalt auf (TARDIF et al. 2003). Bei einem
höheren Anteil an Cholesterin sinkt die Membranfluidität, die Resistenz gegenüber
Temperaturschwankungen steigt. Bei einem höheren Anteil ungesättigter Fettsäuren
dagegen steigt die Membranfluidität, die Resistenz und die Vitalität der
Spermatozoen sinken (SCHILLING u. VENGUST 1985). GLAWISCHNIG (1985) und
CIERESZKO et al. (2000) beschreiben saisonale Veränderungen der Membranintegrität
und Spermienmorphologie, die wahrscheinlich auf dem Einfluss der
erhöhten Umgebungstemperatur beruhen.
3.1.2. Funktionen
Die Funktionen der Plasmamembran der Spermatozoen hängen von ihrer selektiven
Permeabilität, ihrer Fähigkeit zum aktiven Transport und ihrer elektrischen
Polarisation ab, wobei die letztgenannte Eigenschaft die beiden ersten voraussetzt
(WITTKE 1987). Die Plasmamembran stellt die Grenze zwischen der Spermienzelle
und dem sie umgebenden äußeren Milieu dar. Ein konstantes inneres Milieu wird mit
Hilfe der Plasmamembran geschaffen und erhalten. Es handelt sich um eine
selektive, kontrollierende Barriere für Bewegungen von polaren Molekülen zwischen
dem inneren und äußeren Zellraum. Somit ist die Unversehrtheit der Plasmamembran
eine wichtige Grundlage für die Funktion der Zelle. Zu den Funktionen der
Spermienmembran gehören außerdem der Schutz vor äußeren Einflüssen, Kontakt
zur Umwelt und das Aufrechterhalten des Stoffwechsels. Als Kontaktstelle und
Grenzschicht ist die Plasmamembran sehr empfindlich gegenüber Veränderungen
des äußeren Milieus wie Änderungen der Temperatur, der Ionenkonzentrationen
oder Schwankungen des pH-Wertes. Es können als Folge dieser Veränderungen
Permeabilitäts- und Fluiditätsschwankungen sowie Verlust von intrazellulären Ionen

B. Literaturübersicht
auftreten (DÖCKE et al. 1982, QUINN 1985, AMANN u. PICKETT 1987). Die
Sensibilität der Plasmamembran ist tierartspezifisch, vor allem Eberspermatozoen
sind sehr empfindlich gegenüber Temperaturänderungen (WATSON 1981). Die
Spermienplasmamembran spielt für die im Rahmen des Zellmetabolismus wichtigen
Stofftransporte eine große Rolle. Selektive Transportmechanismen sind vorhanden,
die Membranproteine haben eine übergeordnete Bedeutung inne. Man unterscheidet
zwei Transportsysteme: das passive und das aktive. Passive Transporte sind durch
Diffusion möglich. Polare Moleküle wie Wasser- oder NH4-Moleküle können auf
diesem Weg die Membran passieren. Die Voraussetzung ist, dass die Moleküle klein
und nicht geladen sind. Man spricht in diesem Zusammenhang auch von der
„Semipermeabilität der Membran“. Der aktive Transport ist energieabhängig. Die
Aufnahme und Abgabe lipidunlöslicher Stoffe wird durch Kanäle oder sog. „carrier“
(Trägerproteine) vermittelt. Dabei können Ionenkonzentrationsgradienten mittels ATP
angetriebener Transportmechanismen aufrechterhalten werden. Auf die
verschiedenen Formen des Wassertransportes durch die Plasmamembran wird im
folgenden Abschnitt, der sich mit der Regulation von Wassergehalt und osmotischem
Druck beschäftigt, näher eingegangen. Weitere Aufgaben der Plasmamembran sind
elektrische Isolation und Ausbildung eines Membranpotentials.
Neben diesen allgemeinen Funktionen haben die Membranbereiche der einzelnen
Spermienabschnitte weitere Aufgaben. Die Samenzellmembran besitzt definierte
Bereiche, die sich durch unterschiedliche Zusammensetzungen und Funktionen
definieren (EDDY u. O´BRIEN 1994). FRIEND 1982 und HOLT 1984 bezeichnen die
verschiedenen Regionen als „Domänen“. Der Spermienkopf weist im akrosomalen
Bereich des Apikalsegmentes einen Membranabschnitt über dem vorderen
Akrosomrand auf. Dieser Abschnitt ist an der Akrosomreaktion beteiligt.
Membranabsorbierte und -integrierte Glykoproteine stabilisieren die Membran in
diesem Bereich zusätzlich und verhindern eine vorzeitige Auslösung der
Akrosomreaktion. Die periakrosomale Plasmamembran spielt außerdem eine Rolle
bei der Interaktion zwischen Spermium und Zona pellucida. Man unterscheidet weiter
die Membranabschnitte des Äquatorialsegmentes sowie des postakrosomalen
Bereiches, die für die Interaktionen mit der Oozyte von Bedeutung sind
32

33
B. Literaturübersicht
(YANAGIMACHI 1994). GADELLA et al. (1994) unterscheiden außerdem den
Membranabschnitt im Bereich des Mittelstückes und im Bereich der restlichen
Geißel. Im zweitgenannten Abschnitt befinden sich Moleküle, die für die
Fortbewegung zuständig sind. Zudem verhindern Glykoproteine eine vorzeitige
Hyperaktivierung (YANAGIMACHI 1994). Die Zusammensetzung und die
Charakteristika der einzelnen Abschnitte ändern sich während der Reifungsphase
der Samenzellen im Nebenhoden, während des Kontaktes mit dem Sekret der
akzessorischen Geschlechtsdrüsen bei der Ejakulation sowie bei der Kapazitation im
weiblichen Genitale. DACHEUX et al. (1979) untersuchen die Veränderungen
während der epididymalen Reifung bei Eberspermatozoen und beobachten im
Zusammenhang mit der Veränderung der Membranzusammensetzung eine
zunehmende Sensibilität der Spermien gegenüber dem umgebenden Milieu.
Während der Reifung der Spermienzellen steigt die Diffusionskonstante aller
Domänen, v.a. die Membran des Akrosoms wird flüssiger (FRIEND 1982, HOLT
1984).
3.2. Regulation von Wassergehalt und osmotischem Druck
3.2.1. Physiologische Grundlagen
Abhängig von Alter und Geschlecht besteht der Körper der Säugetiere bis zu zwei
Dritteln aus Wasser, in dem Ionen und Moleküle gelöst sind. Viele biologische
Funktionen sind mit der Aufnahme, Abgabe, Verbrauch sowie der Regulation von
Wasser im Körper verbunden. Wasser spielt als Lösungs-, Dispersions- und
Transportmedium eine Rolle. Ein konstanter Wasser- und Elektrolytgehalt ist daher
sehr wichtig (GROSS et al. 1989). Im Vergleich zu vielen somatischen Zellen, die
einen Wassergehalt von bis zu 70% aufweisen (KARLSON et al. 1994), verfügen
Samenzellen speziesabhängig über einen geringeren Wasseranteil. Der Wassergehalt
in Eberspermatozoen wird bei GILMORE et al. (1995) mit 30-40% angegeben.
Außerdem besitzen die Spermien einen geringeren Zytoplasmaanteil im Vergleich zu

B. Literaturübersicht
somatischen Zellen (PETZOLDT u. NEHRING 1992). Der zelluläre Stoffwechsel der
Spermatozoen ist vereinfacht, er beschränkt sich auf den Energiestoffwechsel und
regulatorische Vorgänge, die zur Aufrechterhaltung des intrazellulären Milieus
beitragen. Das zelluläre Volumen reagiert sehr empfindlich auf Veränderungen des
extrazellulären Milieus wie Verschiebungen der Zusammensetzung der Elektrolytund
Nichtelektrolytkomponenten, der Temperatur und der Spermiendichte. Wasserpermeation
ist für die Aufrechterhaltung der osmotischen Verhältnisse von großer
Bedeutung. Spermien weisen eine hohe Wasserpermeabilität auf. Aktive und passive
Transportprozesse des Wassers über die Zellmembran ermöglichen die Regulation
des Zellvolumens und der optimalen Ionenverhältnisse im Inneren der Zelle
(PETZOLDT 1988). Unter passivem Wassertransport versteht man einerseits die
Diffusion des Wassers durch die Zellmembran. Zum anderen fällt darunter der
Transport von Wassermolekülen, die nicht einzeln, sondern als sog. „cluster“
vorliegen und durch die Lipidfluidität die Membran passieren können. Das ist möglich
durch Konformationsänderungen der Anordnung der Kohlenwasserstoffketten, die
man sich als höhlenartige „Störstellen“ vorstellen kann, in denen Wasserpakete Platz
finden (KARLSON et al. 1994). Zusätzlich kann Wasser als „Flüssigkeitsfaden“ (bulk
flow) die Poren durchströmen und dabei Ionen mittransportieren. Man spricht dabei
vom „solvant drag“ (GROSS et al. 1989).
Die hohe Wasserpermeabilität der Spermienmembran ist vermutlich durch die
Existenz spezieller Proteine bedingt, die als Wasserkanäle fungieren. Man geht
davon aus, dass diese Proteine demselben Typ entsprechen wie spezielle integrale
Proteine („CHIP 28“), die bei menschlichen Erythrozyten beschrieben werden. LIU et
al. (1995) widerlegen diese Annahme, danach handelt es sich um ein besonderes,
noch nicht isoliertes Protein.
Es findet meist ein osmotischer Wasserfluss statt, der an den Ionenfluss gekoppelt
bzw. von diesem bedingt wird. Der osmotische Druck ist von der Anzahl der im
Lösungsmittel gelösten Teilchen abhängig. Man definiert 6,06 x 10 23 Teilchen
(= 1 mol einer nicht dissoziierten Substanz) als Messeinheit ein „Osmol“. Schon
geringe Differenzen der Ionenkonzentrationen zwischen dem Intra- und
Extrazellulärraum führen zu einem osmotischen Gradienten. Die Membran kann dem
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35
B. Literaturübersicht
osmotischen Druck nicht standhalten. Je nach Richtung des Konzentrationsgefälles
kommt es aufgrund des Strebens der Zelle nach einem osmotischen Gleichgewicht
mit dem umgebenden Medium zur Zellschrumpfung oder -schwellung (NILIUS 1993).
Im Falle einer hypertonen (die Osmolarität des Milieus ist größer als die des
Spermiums) oder hypotonen (die Osmolarität ist extrazellulär kleiner als intrazellulär)
Situation liegt ein osmotischer Druckgradient vor (∆p). Der daraus resultierende
Wasserein- bzw. -ausstrom unterliegt der folgenden Gleichung: ∆p=∆[s]*R*T. Bei R
handelt es sich um die allgemeine Gaskonstante, T steht für die absolute
Temperatur. Der Konzentrationsgradient wird in der Gleichung durch ∆[s] dargestellt.
Sie ist proportional zum osmotischen Druck. Diese Gleichung spiegelt somit den
Einfluss der Temperatur, der Elektrolytverteilung und der Osmolaritätsschwankung
auf die Intensität des Transportes wieder (SCHMIDT u. THEWS 1993). Nach der
Van’t Hoffschen Theorie der Lösungen ist bei konstanter Temperatur der osmotische
Druck proportional der Konzentration gelöster Teilchen und wiederum bei konstanter
Konzentration proportional der absoluten Temperatur (NULTSCH 1991). Kommt es
zum Wasserinflux, schwillt die Zelle an, findet dagegen ein Wasserefflux statt,
schrumpft die Samenzelle in Folge dessen. Nach DREVIS und ERIKSSON (1966)
sind Veränderungen des Zellvolumens daher ein Ausdruck von zellulären
Regulationsleistungen bei osmotischen Belastungen.
Veränderungen der Membraneigenschaften wirken sich auf die Regulation des
Spermienvolumens aus. Die Zellmembran kann durch die osmotische Reaktion
beurteilt werden (PETZOLDT 1988). Eine intakte Membran kann Schwankungen der
Ionenverhältnisse in gewissem Rahmen ausgleichen. Überführt man die osmotisch
belasteten Spermatozoen danach in ein isotones Medium, stellt die Zelle ihren
Ausgangszustand wieder her. Der Vorgang ist somit bei Zellen mit funktionsfähiger
Plasmamembran reversibel. Werden bestimmte Konzentrationen in der
Zellumgebung über- oder unterschritten, kommt es zu irreversiblen Membranschäden,
die eine Volumenregulation verhindern. Als Folge treten Lysis und Zelltod
ein. Bei hypotoner Belastung spricht man von der sog. kritischen Osmolarität, wenn
50% der Zellen platzen. Dieser Wert ist speziesabhängig. Beim Hahn und beim
Ganter liegt die kritische Osmolarität bei 17 mOsm, die Zellen sind bis kurz vor

B. Literaturübersicht
diesem Wert völlig intakt. Bei dem Spermatozoen der Bullen ist ein kontinuierlicher
Abfall der Vitalität zu beobachten, die kritische Osmolarität beträgt 36 mOsm
(WATSON et al. 1992). Beim Schwein liegt ebenfalls ein stetiger und sehr deutlicher
Verlust der Lebensfähigkeit vor. Mit einer kritischen Osmolarität von 150 mosm/kg ist
es am empfindlichsten. Die Osmolarität liegt im nativen Ejakulat der Eber bei
304±7 mosm/kg, dabei können Schwankungen zwischen 286-324 mosm/kg auftreten
(VENGUST 1983).
Bei hypertoner Belastung hat man ein minimal tolerierbares Zellvolumen festgestellt,
unter das die Zellen nicht mehr schrumpfen können. Eine weitere Dehydration führt
zu irreversiblen Schäden. MERYMAN (1979) erklärt dieses Phänomen durch die
„Minimum Cell Volume“ Hypothese, nach der es zu einer Kompression des
Zellinhaltes kommt. Die Zelle reagiert mit Widerstand auf den Schrumpfungsvorgang,
ein osmotischer Druckunterschied baut sich an der Zellmembran auf, durch den es
schließlich zu Membranschäden kommt. Die komplexe und starre Struktur sowie der
geringe Plasmaanteil sprechen für diese Theorie (WATSON u. DUNCAN 1988).
An der Volumenregulation der Zellen soll eine Na + -/K + -ATPase beteiligt sein
(ALBERTS et al. 2002). Die Volumenabnahme scheint bei Überführung der Zellen
aus einem hypo- in ein isotones Milieu an die Aktivität dieses Enzyms gebunden zu
sein, da bei der Hemmung der ATPase eine Rückregulation ausbleibt, wie es bei
Astrozyten der Ratte festgestellt worden ist (FRASER u. SWANSON 1994).
Entsprechende Untersuchungen sind auch schon bei Spermien von Hund, Schaf und
Schwein durchgeführt worden (RODRIGUEZ-GIL u. RIGAU 1996, PETROUNKINA
1998).
Bemerkenswert ist, dass die osmotischen Verhältnisse sich nicht nur auf die
Volumenregulation auswirken, sondern auch Einfluss auf die Motilität der
Samenzellen nehmen. DACHEUX et al. (1979) beschreiben, dass reife Eberspermien
unter hypotoner Belastung ihren Stoffwechsel verändern: Die Zellen
produzieren vermehrt CO2, während die ATP-Produktion sinkt. Es folgt eine
verminderte Motilität. FRASER et al. (2001) bestätigen einen verringerten, zu einer
Motilitätsreduktion führenden ATP-Gehalt in Spermien unter hypo- und
hyperosmotischen Belastungen. Sowohl die Fähigkeit der Volumenregulation als
36

37
B. Literaturübersicht
auch der Motilität entwickelt sich bei Spermien während der Nebenhodenreifung
(YEUNG et al. 2002).
3.2.2. Der hypoosmotische Schwelltest (HOST)
Das Phänomen der Volumenregulation unter verschiedenen osmotischen
Bedingungen ist mit Hilfe verschiedener Testverfahren der Spermatologie zu
erfassen. Der Hypoosmotische Schwelltest (HOST) spielt dabei eine wichtige Rolle,
auf dessen Messtechnik auch im Abschnitt C. (Eigene Untersuchungen) näher
eingegangen wird. Dieses Testverfahren beruht darauf, dass unter hypoosmotischen
Bedingungen ein Flüssigkeitstransport über eine intakte Zellmembran abläuft, bis ein
Konzentrationsausgleich geschaffen ist (JEYENDRAN et al. 1992). Die Zelle schwillt
zunächst an, dann erfolgt eine regulative Volumenabnahme (RVD = Regulative
Volume Decrease). Unter hyperosmotischen Belastungen folgt nach einem
anfänglichen Schrumpfen ein regulativer Volumenanstieg (RVI = Regulative Volume
Increase). Mit Hilfe des HOST kann die osmotische Belastungsfähigkeit (Resistenz)
der Spermatozoen untersucht (JEYENDRAN et al. 1984) und auf die Integrität sowie
Funktionalität der Zellmembran geschlossen werden (JEYENDRAN et al. 1992,
CABRITA et al. 1999). Auf der Grundlage des HOST ist auch versucht worden,
Voraussagen in Bezug auf die Lebensfähigkeit von Spermien zu treffen, indem sie
mit Vitalfärbungen kombiniert worden sind (NEILD et al. 1999, MUNUCE et al. 2000).
Aufgrund der speziesabhängigen, unterschiedlichen Sensitivität der Plasmamembran
hinsichtlich des Wassertransportes können verschiedene Schwellungsmuster
beobachtet werden (CURRY u. WATSON 1994). Bei Spermien des Bullen, der
Maus und des Ebers stellt man fest, dass die Volumenveränderung umgekehrt linear
zur Osmolarität erfolgt. Die Samenzellen dieser Spezies verhalten sich wie sog.
„perfekte Osmometer“ (DREVIUS 1972, DU et al. 1994, GILMORE et al. 1996,
PETROUNKINA 1998, PETROUNKINA u. TÖPFER-PETERSEN 2000) im Gegensatz
zu den Spermien von Kaninchen und Schafböcken (HAMMERSTEDT et al.
1978).

B. Literaturübersicht
PETROUNKINA et al. (2000) weisen bei iso- und hypoosmotischen Volumen von
Eberspermien zyklische Veränderungen unter Kapazitationsbedingungen nach, die
einer mathematischen Periodizität folgen.
Die Korrelationen von Ergebnissen des HOST und denen der In-vitro-Fertilisation
(IVF) fallen sehr unterschiedlich aus, der HOST als Untersuchungsmethode
männlicher Infertilität ist umstritten. Während einige Autoren zeigen, dass der HOST
Voraussagen zur Befruchtungsfähigkeit zulässt (JEYENDRAN et al. 1984, VAN DER
VEN et al. 1986, CHECK et al. 1989, OKADA et al. 1990, CHAN et al. 1991), tragen
bei anderen die Ergebnisse des HOST nicht zur Vorhersage der Befruchtungsfähigkeit
bei (CHAN et al. 1988, AVERY et al. 1990, ROTA et al. 2000).
Die Regulation des Wasserhaushaltes und das Zellverhalten bei Dehydration ist für
die Tiefgefrier- und Flüssigkonservierung von elementarer Bedeutung, da die
Dynamik des Wasserverlustes und ihre Folgen die Lebensfähigkeit, Motilität und
Befruchtungsfähigkeit kryokonservierter Spermien beeinflussen (KAPP 1995).
3.3. Kapazitation
Um fertil zu werden, müssen die Spermien nach der epididymalen Reifung in einer
komplexen Reihe molekularer Ereignisse, die in unteren Oviduktregionen stattfindet,
von einem geschützten in einen funktionsaktivierten Zustand übertreten (TÖPFER-
PETERSEN 1996). Dieses Phänomen haben zuerst AUSTIN (1951) und CHANG
(1951) entdeckt, AUSTIN (1952) führt den Begriff der „Kapazitation“ ein. HARRISON
(1996) definiert die Kapazitation als Serie positiv destabilisierender Ereignisse, die
den Spermien erlaubt, die Zona-induzierte Akrosomreaktion und hyperaktivierte
Motilität innerhalb eines kleinen Zeitfensters durchzuführen und danach zum Zelltod
führt.
Bikarbonat-induzierte Phospholipidänderungen der Membran stellen ein frühes
Ereignis während des Kapazitationsprozesses dar (HARRISON et al. 1996,
GADELLA u. HARRISON 2002). Kapazitation ist mit einem Cholesterinausstrom aus
der Plasmamembran verbunden, der zu einem Anstieg der Membranfluidität,
38

39
B. Literaturübersicht
Modulation der intrazellulären Ionenkonzentrationen (z.B. Ca 2+ -Konzentration steigt
an), Hyperpolarisation der Membran und einer Zunahme der Proteintyrosinphosphorylierung
führt. Der Kapazitationsvorgang ist außerdem mit Veränderungen des
Metabolismus und der volumenregulatorischen Leistung verbunden. Die Ereignisse
induzieren die Hyperaktivierung, die als Akrosomreaktion bezeichnete Vesikulation
und Verschmelzung der Plasmamembran mit der äußeren akrosomalen Membran
am Äquatorialsegment (VISCONTI et al. 2002). PETROUNKINA et al. (2001b) stellen
bei ihren Untersuchungen an Eberspermien verschiedene Muster der Tyrosinphosphorylierung
im Bereich der akrosomalen Region im Laufe der Kapazitation fest.
Die an die Spermienoberfläche assoziierten Proteine wie beispielsweise die
Spermadhäsine beim Schwein sind an den Regulationsprozessen der Kapazitation
beteiligt (SANZ et al. 1993), zusätzlich spielen Sekrete des weiblichen Genitaltraktes,
Enzyme und Hormone eine Rolle.
In vitro werden die Kapazitationsbedingungen mit Hilfe spezieller, definierter Medien
nachempfunden, um die In-vivo-Situation nachzustellen und die komplexen
Ereignisse untersuchen zu können. Serumalbumin, Ca 2+ und HCO3 - spielen in diesen
Medien eine wichtige Rolle (VISCONTI u. KOPF 1998).
Da nur kapazitierte Spermien auf die Signale der Eizelle antworten können, scheinen
die entsprechenden Signal übertragenden, regulierenden und auch osmosensitiven
Mechanismen erst während der Kapazitation vorbereitet zu werden (TÖPFER-
PETERSEN et al. 2000).
Es werden potentielle Ähnlichkeiten zwischen der Kapazitation der Spermien und
frühen, Ca 2+ -vermittelten Ereignissen während der Membranfusion bei Eukaryonten
sowie bei verschiedenen Schritten der sekretorischen und endozytotischen
Signalwege diskutiert (ABOU-HAILA u. TULSIANI 2003). Mit Hilfe von Modulatoren
der Kapazitation wie Serumalbumin, Ca 2+ und NaHCO3 hat gezeigt werden können,
dass es transmembrane und intrazelluläre Signalwege geben muss, die die
Kapazitation regeln (JHA u. SHIVAJI 2002).

B. Literaturübersicht
3.4. Signalübertragung
Wie im Abschnitt 2. „Morphologie des Spermatozoon“ bereits erwähnt, ist ein
Charakteristikum einer Zelle die Reizbarkeit in Form von Reizaufnahme und
-beantwortung. Dieses Kennzeichen hängt somit eng mit dem Thema dieses Kapitels
zusammen, da für die Aufnahme und Beantwortung von Reizen eine Signalübertragung
in Zellen notwendig ist.
3.4.1. Allgemeine Mechanismen der Signalübertragung in Zellen
Jede Zelle ist programmiert, auf spezifische Signale zu antworten, die einzeln oder in
Kombination auftreten und wirken können. Sie beeinflussen das Verhalten der Zelle
und entscheiden, ob die Zelle leben oder sterben soll, außerdem ist die Signalübertragung
für die Koordination des Stoffwechsels essentiell.
Die Zelle steht über ihre Plasmamembran mit anderen Zellen und der umgebenden
Flüssigkeit, in der Nährstoffe, Hormone, Neurotransmitter und Antigene vorhanden
sind, in Kontakt. Allosterische Enzyme, Hormon- und Nervensignale spielen bei der
Signalübertragung von Zellen eine Rolle. Hormon- und Nervensystem sind der
chemischen Signalübertragung zuzuordnen, ihre Mechanismen sind sehr ähnlich.
Sie nutzen einige Botenstoffe wie Noradrenalin und Adrenalin gemeinsam und
werden als neuroendokrines System zusammengefasst. Während Hormone von
endokrinen Zellen sezerniert, durch das Blut zu entfernten Zellen transportiert
werden und durch das Anbinden an einen Rezeptor an der Zelle eine Aktivitätsänderung
der Zelle bewirken, werden Neurotransmitter von Neuronen freigesetzt und
müssen nur den synaptischen Spalt überwinden, um das nächste Neuron der
Übertragungskette zu erreichen.
Transportproteine und Rezeptoren der Membran spielen eine bedeutende Rolle bei
der Signalübertragung. Die Erstgenannten befördern Nährstoffe in und Abfallstoffe
aus der Zelle, dabei findet keine Verstärkung der Signale statt. Bei Signalrezeptoren
handelt es sich dagegen um Membranproteine, die hochspezifische Bindungsstellen
für von außen ankommende Signalmoleküle (Rezeptorliganden) darstellen.
40

41
B. Literaturübersicht
Nur wenige kleine, hydrophobe Signalmoleküle (beispielsweise Steroid- oder
Thyreoidhormone) und einige lösliche Gase wie Stickstoffmonoxid und
Kohlenmonoxid können durch die Membran der Zielzelle hindurchdiffundieren, um
intrazellulär Rezeptorproteine zu aktivieren. Die meisten extrazellulären Signalmoleküle
sind jedoch hydrophil, so dass sie nicht problemlos die lipophile
Zellmembran durchdringen können. Sie können nur an der Oberfläche der Zielzelle
Rezeptorproteine aktivieren. Ihr Signal muss über diese membranständigen
Rezeptoren ins Zellinnere übertragen werden. Der Fachbegriff für dieses Phänomen
lautet Signaltransduktion. Die Rezeptorproteine wirken als Signalüberträger, die das
extrazelluläre Ereignis der Ligandenbindung, die eine Änderung der Raumstruktur
des Rezeptors nach sich zieht, in ein intrazelluläres Signal umwandeln, das das
Zellverhalten beeinflusst.
Entsprechend der Signalübertragungsmechanismen lassen sich die Zelloberflächenrezeptoren
in drei große Gruppen unterteilen: Ionenkanal-gekoppelte Rezeptoren,
G-Protein-gekoppelte Rezeptoren und katalytische Rezeptoren.
Bei den Ionenkanal-gekoppelten Rezeptoren, die auch als Transmitter-abhängige
Ionenkanäle bezeichnet werden, bindet ein Ligand an Proteine des Ionenkanals. Der
Kanal wird daraufhin vorübergehend geöffnet oder geschlossen, die Permeabilität
der Membran für bestimmte Ionen, beispielsweise Na + -, K + - oder Cl - -Ionen, ändert
sich.
Da die G-Protein-gekoppelten Rezeptoren zu einer Familie homologer Proteine
gehören, die die Plasmamembran siebenfach durchspannen, werden sie auch
7-Helix-Rezeptoren genannt. Diese Rezeptoren übertragen mit Hilfe eines trimeren
GTP-bindenden Regulatorproteins (G-Protein) Signale auf Effektorproteine
(nachgeschaltete Enzyme oder Ionenkanäle). Handelt es sich bei dem aktivierten
Zielprotein um ein Enzym, wird die intrazelluläre Konzentration von Mediatoren oder
second messenger („zweite Botenstoffe“) geändert. Liegt bei dem Zielprotein ein
Ionenkanalprotein vor, kommt es zu einer Veränderung der Ionenpermeabilität der
Plasmamembran.
Katalytische Rezeptoren wirken selbst als Enzyme oder sind mit einem Enzym
assoziiert. Sie durchspannen die Membran mit nur einer Helix und werden folglich

B. Literaturübersicht
auch 1-Helix-Rezeptoren genannt. Die Bindungsstelle für den Liganden befindet sich
außerhalb, das katalytische Zentrum liegt innerhalb der Zelle. Der Signalstoff wird
gebunden, es kommt zu einer Dimerisierung des Rezeptors, die eine Aktivierung
eines Enzyms nach sich zieht. Im Gegensatz zu den zwei zuerst vorgestellten
Rezeptoren handelt es sich bei den enzymgekoppelten Rezeptoren um eine
heterogene Gruppe, die sich in fünf Untergruppen unterteilen lässt: Transmembran-
Guanylylcyclasen stellen cGMP her. Während Rezeptor-Tyrosinphosphatasen
Phosphate von Tyrosin-Resten spezifischer Proteine abspalten, übertragen
Transmembran-Rezeptor-Serin/ Threoninkinasen Phosphatgruppen auf Serin- und
Threoninseitenketten von Zielproteinen. Am häufigsten treten Rezeptor-
Tyrosinkinasen und Tyrosinkinasen-gekoppelte Rezeptoren auf, die vermutlich auf
die gleiche Weise arbeiten. Bei ihnen kommt es nach der Ligandenbindung und
Dimerisierung des Rezeptors zu der Aktivierung der Kinase, die einen Teil des
Rezeptors bildet oder als Nicht-Rezeptorkinase mit diesem assoziiert ist. Die
aktivierte Rezeptor-Tyrosinkinase überträgt Phosphatgruppen auf verschiedene
Tyrosin-Reste, an die spezifische Proteine über ihre SH2-Domäne binden. Auf diese
Weise wird ein Multi-Protein-Signalkomplex aktiviert, von dem sich das Signal im
Zellinneren ausbreitet.
Der Oberflächenrezeptor besitzt die Funktion eines Signalverstärkers: Ein
Ligandenmolekül bindet an den Rezeptor, durch den geöffneten Kanal können dann
viele Ionen hindurchtreten, oder es erfolgt durch die Aktivierung eines Enzyms die
Synthese vieler Moleküle eines Botenstoffes.
Im Rahmen der Signaltransduktion spielen zusätzlich innerhalb der Zelle die second
messenger eine Rolle. Dabei handelt es sich um intrazelluläre, chemische Signale,
deren Konzentration von extrazellulären, über Membranrezeptoren in die Zelle
übertragenen Signale streng kontrolliert werden. Zu den wichtigsten Second
messenger zählen cAMP (3´,5´-cyclo-Adenosin-monophosphat), cGMP, Ca 2+ , IP3
(Inositol-1,4,5-triphosphat) und DAG (Diacylglycerol).
Das Nukleotid cAMP wird von membrangebundener Adenylatcyclase gebildet. Die
Aktivität dieses Botenstoffes wird über G-Proteine gesteuert, meist stimulieren sie die
Adenylatcyclase (Typ Gs), einige hemmen sie (Typ Gi). Ca 2+ und Calmodulin
42

43
B. Literaturübersicht
aktivieren ebenfalls die Adenylatcyclase. Das cAMP stellt einen allosterischen
Effektor der Proteinkinase A (PKA) und von Ionenkanälen dar. Die enzymatisch
aktivierte PKA kann dann bestimmte Serin- und Threonin-Reste von verschiedenen
Proteinen phosphorylieren und damit den Funktionszustand dieser Proteine ändern.
Innerhalb der Zellen herrscht eine geringe cytosolisch freie Ca 2+ -Konzentration, die
mit Hilfe von Ca 2+ -ATPasen in der Plasmamembran, ATP-getriebenen Ca 2+ -Pumpen
im Endoplasmatischen Retikulum und in der inneren Mitochondrien-Membran sowie
Na + / Ca 2+ -Austauscher niedrig gehalten wird, so dass Ca 2+ -Ionen intrazellulär als
Signalmolekül genutzt werden können. Da extrazellulär ein hoher Ca 2+ -Spiegel
herrscht, besteht an der Plasmamembran ein Konzentrationsgefälle. Kommt es durch
ein Signal vorübergehend zu einem Öffnen der Ca 2+ -Kanäle in der Membran, steigt
die intrazelluläre Ca 2+ -Konzentration sehr stark an und aktiviert Ca 2+ -abhängige
Proteine in der Zelle, u.a. Calmodulin.
Aus dem zweifach phosphorylierten Membranlipid Phosphatidyl-Inositol-bisphosphat
(PInsP2) entstehen unter der Enzymwirkung der Phospholipase C (PLC) das
hydrophile IP3 und das lipophile DAG. Der erstgenannte Botenstoff wandert zum ER
und setzt dort Ca 2+ aus den Speichern frei, der zweitgenannte bleibt in der Membran,
aktiviert die Proteinkinase C (PKC), die dann in Gegenwart von den vom IP3
freigesetzten Ca 2+ Proteine phosphoryliert und damit den Funktionszustand der
Proteine verändert.
Wichtig ist, dass diese verschiedenen Systeme miteinander vernetzt sind und sich
gegenseitig beeinflussen. Das Zusammenspiel verschiedener Signalkaskaden
ermöglicht der Zelle, die Informationen vieler Signale aufeinander abzustimmen.
Die wesentlichen Aussagen dieses Abschnittes sind ALBERTS et al. (2002) entnommen.
3.4.2. Tyrosinphosporylierung bei der Signalübertragung von Zellen
Unter Phosphorylierung versteht man die Übertragung eines Phosphorsäureesters
auf organische Verbindungen durch Ester- oder Säureanhydridbildung. Die
Konformationsänderung resultiert in einer Aktivierung bzw. Inaktivierung der

B. Literaturübersicht
Proteine. In vielen Stoffwechselwegen müssen Metaboliten erst durch
Phosphorylierung, die durch Kinasen enzymatisch katalysiert werden, aktiviert
werden, bevor sie umgesetzt werden können. Proteinkinasen und -phosphatasen
regulieren den Phosphorylierungsstatus. Phosphorylierte Verbindungen sind sehr
energiereich. Bei der Proteinphosphorylierung handelt es sich um post-translationale
Modifikationen von Proteinen, die es der Zelle erlauben, verschiedene zelluläre
Prozesse zu kontrollieren (URNER u. SAKKAS 2003). Die Proteinphosphorylierung
und –dephosphorylierung zählt zu den wichtigsten Regulationsmechanismen, die
einer Zelle zur Verfügung stehen. Wie bereits im Abschnitt 3.4.1. (Allgemeine
Mechanismen der Signalübertragung in Zellen) angedeutet, ist die Tyrosinphosphorylierung
bei verschiedenen Zellen in die Signalübertragung involviert. Da reife
Spermien transkriptional inaktiv sind und ihnen die Fähigkeit zur Synthese neuer
Proteine fehlt, ist es denkbar, dass reife Spermatozoen im Vergleich zu anderen
Zelltypen von diesem Mechanismus der Funktionsänderung in viel größerem Maße
abhängig sind (URNER u. SAKKAS 2003). Im nächsten Abschnitt soll die Beteiligung
der Tyrosinphosphorylierung neben anderen Mechanismen bei der Volumenregulation
näher beleuchtet werden.
3.4.3. Signalübertragung bei der Volumenregulation von Zellen
Zellen antworten auf physiologischen Stress (Han et al. 1994). Sie reagieren auf
osmotische Belastungen aus ihrer Umgebung. Verschiedene Mechanismen sind in
die damit verbundene Volumenregulation involviert.
BREWSTER et al. (1993) beobachten einen durch die Änderung der extrazellulären
Osmolarität aktivierten Signalübertragungsweg schon bei Hefen. Die Autoren
vermuten, dass der Anstieg des Turgordruckes durch den Zusammenbruch des
osmotischen Gradienten an der Plasmamembran das initiale Signal sein könnte, da
die Hefen über mechanosensitive Ionenkanäle in ihrer Membran verfügen.
Bei hypoosmotischer Stimulation werden schnell aktivierte, kompensatorische
Cl - - und K + -Ströme diskutiert, die ein übermäßiges Anschwellen der Zelle verhindern
und das Ausgangszellvolumen wiederherstellen (OKADA u. HAZAMA 1989,
44

45
B. Literaturübersicht
GRINSTEIN u. SMITH 1990, TILLY et al. 1996). Ein schwellungsinduzierter Anstieg
der intrazellulären Ca 2+ -Konzentration aktiviert diese Ionenströme (MCCARTY u.
O´NEIL 1992). Es werden volumenregulierte, ATP-abhängige Anionen/ Cl - -Kanäle
beschrieben, die durch die Volumenzunahme der Zelle stimuliert werden; genaue
Mechanismen der Aktivierung sind noch nicht klar (OKADA 1997, STRANGE et al.
1996). Es werden auch volumensensitive organische osmolytische und
Anionenkanäle (VSOACs) erwähnt (STRANGE et al. 1996, OKADA 1997, NILIUS
1997, KIRK 1997), die vom intrazellulären ATP-Spiegel abhängig sind (DELEUZE et
al. 2000). Der Mechanismus ihrer Regulation ist bisher kaum erforscht. An ihrer
Aktivierung scheinen bei Astrozyten (CREPEL et al. 1998, MONGIN et al. 1999),
Lymphozyten (LEPPLE-WIENHUES et al. 1998), Kardiomyozyten (SOROTA 1995),
epithelialen (TILLY et al. 1993) und endothelialen Zellen (VOETS et al. 1998)
Proteintyrosinkinasen beteiligt zu sein.
Bei Versuchen an Endothelzellen der Aorta des Rindes ist festgestellt worden, dass
die Proteinphosphorylierung zur Aktivierung eines Na + /K + /2Cl - -Cotransporters führt,
während sich die Inaktivierung dieses Cotransporters mit Hilfe des Phosphatase-
Inhibitors Calyculin, der vorwiegend auf die Proteinphosphatase des Typ I wirkt, auf
die Typ I Phosphatase zurückführen lässt. Es wird angenommen, dass eine
volumensensitive Proteinkinase existiert (KLEIN et al. 1993).
Neben diesem Na + /K + /2Cl - -Cotransporter untersuchten MARUNAKA et al. (1999)
zusätzlich Aniloride-sensitive Na + -Kanäle und Quinin-sensitive K + -Kanäle bei Typ II
Pneumozyten fetaler Rattenlungen im Zusammenhang mit Insulin und unter dem
Einfluss von Ca 2+ und Proteinkinasen. Die Ergebnisse dieser Studien zeigen, dass
unter Anwesenheit von extrazellulärem Ca 2+ -Ionen Insulin über eine Proteinkinase
die Aniloride-sensitiven Na + -Kanäle und Bumetanide-sensitive Cotransporter aktiviert,
daraus resultiert ein Volumenanstieg. Bei fehlenden extrazellulären Ca 2+ -Ionen
dagegen werden diese zwei Systeme nicht beeinflusst, Insulin stimuliert in diesem
Fall nur die Quinin-sensitiven K + -Kanäle über eine Proteinkinase mit nachfolgender
Volumenabnahme.
Bei humanen zervikalen Krebszellen ist festgestellt worden, dass die osmotische
Schwellung zu einer Aktivierung verschiedener Kinasen, darunter eine

B. Literaturübersicht
Tyrosinkinase, führt, die einen intrazellulären Anstieg der Ca 2+ -Konzentration durch
die Freisetzung aus intrazellulären Lagern und Influx über die Plasmamembran
bewirkt. Der Einsatz von Tyrosinphosphatase-Inhibitoren potentiert das Ereignis,
während die Hemmung der Tyrosinkinasen zu einer Hemmung führt (SHEN et al.
2001).
Beim Rochen führt eine Volumenzunahme der Erythrozyten zur Tyrosinphosphorylierung,
die einen Taurine-Efflux aktiviert. Eine PTK ist an der Regulation des
schwellungsaktivierten Taurine-Ausstroms involviert. Bei dem Einsatz von PKC-
Inhibitoren tritt kein signifikanter Effekt auf, daher kann eine Beteiligung der PKC
ausgeschlossen werden (MUSCH et al. 1998, HUBERT et al. 2000).
Untersuchungen von DELEUZE et al. (2000), die sich ebenfalls mit dem Einfluss der
Tyrosinphosphorylierung auf die Osmosensitivität des volumenabhängigen Taurine-
Efflux bei Gliazellen der Ratte beschäftigt haben, ziehen die Vermutung nach sich,
dass die Tyrosinphosphorylierung den osmotischen Setpoint der Aktivierung des
Ausstromes bestimmt und die Sensitivität der Taurine-permeablen Kanäle
modifiziert, nicht aber für die Aktivierung nötig ist.
Phosphorylierung von Serin/ Threonin und Tyrosin ist bei der Aktivierung und/ oder
Regulierung der Cl - -Kanäle bei verschiedenen Zelltypen beteiligt (OKADA 1997).
Tyrosinphosphorylierung tritt bei Herzmyozyten des Hundes (SOROTA 1995), Astrozyten
der Ratte (CREPEL et al. 1998) und Endothelzellen des Rindes (VOETS et al.
1998) auf, bei diesen Zelltypen dieser Tierarten ist sie durch PTK-Inhibitoren
hemmbar. Im Gegensatz dazu ist sie bei chromaffinen Zellen des Rindes
(DOROSHENKO 1998) und Mäusefibroblasten (THOROED et al. 1999) durch
PTP-Inhibitoren zu beeinflussen. Bei niedrigem ATP-Spiegel hält die Tyrosinphosphorylierung
bei Fibroblasten der Maus Cl - -Kanäle aktiv. Sowohl eine Beteiligung der
PTK als auch der PTP hat bei der Regulation der Cl - -Kanäle später nachgewiesen
werden können (BRYAN-SISNEROS et al. 2000).
Die Phosphorylierung von Serin/ Threonin tritt bei Kardiomyozyten von Meerschweinchen
(DUAN et al. 1999) und Huhn (HALL et al. 1995) sowie bei
Endothelzellen der Ratte (VON WEIKERSTHAL et al. 1999) auf.
46

47
B. Literaturübersicht
Untersuchungen von GALCHEVA-GARGOVA et al. (1994) weisen ebenfalls eine
Beteiligung der Threonin- und Tyrosinphosphorylierung in osmotisch „geschockten“
Säugetierzellen und Hefen nach, die zur Aktivierung einer Proteinkinase führt.
Zusammenfassend lässt sich feststellen, dass bei verschiedenen Zelltypen
unterschiedlicher Tierarten die Beteiligung der Tyrosinphosphorylierung an
osmotisch induzierten Zellvolumenveränderungen beobachtet werden kann, doch die
genauen Wirkungsmechanismen unterscheiden sich bei den verschiedenen Zellarten
und von Tierspezies zu Tierspezies.
3.4.4. Signalübertragung bei Spermatozoen
Auch bei Spermien werden alle Interaktionen zwischen ihnen und ihrer Umwelt durch
intrazelluläre Signalwege vermittelt. Die Signalübertragung ermöglicht dem
Spermium die Anpassung an die sich vom Verlassen des Hodens bis zur
Befruchtung der Eizelle in der Eileiterampulle ständig verändernden Bedingungen.
Fast alle von somatischen Zellen bekannten Signalwege sind in Spermien gefunden
worden, wobei hinsichtlich ihrer Funktion bei einigen noch Unklarheit herrscht (BALDI
et al. 2002). Ionenkanäle und -transporter stellen Schlüsselelemente der Spermien-
Eizell-Interaktion und Reaktion auf Umwelteinflüsse dar und haben eine große
Bedeutung für die Befruchtung. Die Eizelle nimmt Einfluss auf die Ionenpermeabilität
und das Verhalten der Spermien (DARSZON et al. 2001).
ZENG et al. (1995) und MUNOZ-GARAY et al. (2001) demonstrieren, dass die
Kapazitation von einer Hyperpolarisation der Spermienmembran begleitet ist, die u.a.
auf einer Steigerung der Kaliumpermeabilität der Membran beruht und Einfluss auf
die Ca 2+ -Freisetzung während der Akrosomreaktion nimmt. Calcium- und
Magnesium-Ionen vermitteln die Aktivität von Enzymen, die in die Mechanismen der
Schwanzkontraktion und -relaxation miteingebunden sind (TASH u. MEANS 1983).
Während der Kapazitation steigt der intrazelluläre pH-Wert an (PARRISH et al.
1989). Aus der Sicht von FRASER (1995) spielen Kationen und Anionen eine
bedeutende Rolle bei der Modulation der Spermienfunktionen während der
Kapazitation und Akrosomreaktion, eine besondere Aufmerksamkeit ist den

B. Literaturübersicht
Ca 2+ -, Na + -, K + - und H + -Ionen zu schenken. Spermien scheinen über einen Na + -Ca 2+ -
Austauscher zu verfügen (Untersuchungen beim Schwein: ASHRAF et al. 1982;
beim Bullen: RUFO et al. 1984). Von diesem Mechanismus wird angenommen, dass
er im Gegensatz zu somatischen Zellen nicht nur Na + - in und Ca 2+ -Ionen aus der
Zelle transportiert und damit für eine intrazellulär niedrige Ca 2+ -Konzentration sorgt,
sondern auch umgekehrt funktioniert und zu einem Anstieg des Ca 2+ -Spiegels führt
(RUFO 1984). Andere Autoren vermuten spannungssensitive Ca 2+ -Kanäle bei
Spermien (Versuche beim Schwein: COX u. PETERSON 1989; bei der Maus:
FRASER 1993; beim Bullen: FRASER et al. 1995). Die Rolle des Natriums ist bisher
noch unklarer. FRASER (1995) vermutet aufgrund verschiedener Versuche mehrerer
Wissenschaftler, dass eine geringe Konzentrationszunahme mit der Kapazitation,
eine starke mit der akrosomalen Exozytose verbunden ist. An der Regulation des
Na + -Spiegels ist wahrscheinlich eine Na + -/K + -ATPase beteiligt. Gegen einen
Na + -Ca 2+ -Austauscher spricht, dass beide Ionenkonzentrationen ansteigen, was bei
einem Austausch schwer möglich wäre.
Als Regulator des intrazellulären Kaliumionengehaltes wird v.a. eine Na + -/K + -ATPase
diskutiert, wobei Kalium eher für terminale Ereignisse wie die Akrosomreaktion von
Bedeutung ist, nicht für die Kapazitation selbst (FRASER 1995). Es ist ein Anstieg
der ATPase-Aktivität bei Spermien des Hamsters während der Kapazitation zu
beobachten, der durch intrazelluläres cGMP vermittelt wird (MRSNY et al. 1984).
Studien von KOCAK-TOKER et al. (2002) zeigen den Einfluss einer Na + -/K + -ATPase
auf die Motilität: Der Einsatz des Inhibitors Ouabain führt zur Abnahme bzw. dem fast
gänzlichen Verlust der Beweglichkeit. Im Gegensatz dazu beeinflusst Relaxin die
Motilität positiv. Es wird angenommen, dass der Stoff sich an einen Oberflächenrezeptor
anlagert, einen Anstieg der Aktivität der Adenylatcyclase bewirkt, der dann
in einer Steigerung des intrazellulären cAMP-Levels resultiert (KOHSAKA et al.
2001).
Eine Schlüsselrolle scheint cAMP bei der Zunahme der Tyrosinphosphorylierung
und bei der Lipidumstrukturierung während der Kapazitation bei Eberspermien zu
spielen. Bikarbonat dient dabei nicht nur als Puffer für einen alkalischen pH-Wert,
sondern wirkt auch direkt auf das Spermium ein (HARRISON et al. 1993,
48

49
B. Literaturübersicht
ASHWORTH et al. 1995). Bikarbonat stimuliert die Adenylatcyclase, die zu einer
Aktivierung der Proteinkinase A führt. Es kommt zur Proteinphosphorylierung, die
einen Anstieg der Merocyaninbindung nach sich zieht (HARRISON u. MILLER 2000,
GADELLA u. HARRISON 2000). Die Regulation des Anstieges der Tyrosinphosphorylierung
über einen cAMP-abhängigen Signalweg mit Involvierung der
Proteinkinase A ist bei den Spermien der Maus (VISCONTI et al. 1995b, VISCONTI
et al. 1997), des Hamsters (VISCONTI et al. 1999c), des Menschen (LECLERC et al.
1996), des Ebers (KALAB et al. 1998), des Bullen (GALANTINO-HOMER et al.
1997), der domestizierten Katze (PUKAZHENTHI et al. 1998a) und bei
verschiedenen wilden Arten der Familie der Felidae (PUKAZHENTHI et al. 1998b)
festgestellt worden. Die Beteiligung des sekundären Botenstoffes cAMP bei der
Akrosomreaktion wird ebenfalls noch diskutiert (ROLDAN 1998). VISCONTI et al.
(1999 a, b) stimmen mit der Ansicht überein, dass ein Signalweg mit der Beteiligung
von cAMP und Tyrosinkinase bei Spemien vorliegt, doch haben sie Hinweise
gefunden, dass die Cholesterinfreisetzung aus der Spermienmembran die
Signalkaskade auslöst.
VISCONTI et al. (2002) fassen drei Regulationsmöglichkeiten der Tyrosinphosphorylierung
durch einen cAMP/PKA-abhängigen Signalweg zusammen: (in)direkte
Stimulation der Tyrosinkinase durch die PKA, (in)direkte Hemmung der Phosphotyrosinphosphatase
und (in)direkte Phosphorylierung der Proteine durch die PKA
über Serin- oder Threoninreste, die eine Tyrosinphosphorylierung nach sich zieht.
Bei Studien mit Koffein (Inhibitor der Phosphodiesterase) und Adenosin (Stimulator
des Adenylatcyclase/cAMP-Signalweges) an Eberspermien ist herausgefunden
worden, dass beide Stoffe die Kapazitation stimulieren, doch nur Adenosin hemmt
die spontane Akrosomreaktion (FUNAHASHI u. TAKASHI 2001). Die Hemmung der
Phosphodiesterase führt außerdem zu einem Motilitätsanstieg (MOUSSA 1983).
Auch das den Kalziummetabolismus regulierende Calcitonin wirkt sich auf die
Motilität aus, bei einem geringen Calcitonin-Level des Seminalplasmas kommt es zu
einer Abnahme der Spermienbeweglichkeit (MUNGAN et al. 2001). FORESTA et al.
(1989) bestätigen, dass Calcitonin in Ca 2+ -abhängige Mechanismen involviert ist.

B. Literaturübersicht
Das Vorkommen von intrazellulären Ca 2+ -Lagern wird vermutet (WALENSKY u.
SNYDER 1995, DRAGILEVA et al. 1999, O´TOOLE et al. 2000), doch über die
Lokalisation von Ca 2+ -Lagern in reifen Spermien herrscht noch Unklarheit, da ein
Endoplasmatisches Retikulum fehlt und das Akrosom kein Ca 2+ zu enthalten scheint
(KIRMAN-BROWN 2000, KOBORI 2000). DRAGILEVA et al. (1999) vermuten
dagegen, dass das Akrosom als potentieller, zellulärer Ca 2+ -Speicher in Frage
kommt. Ihre Versuche mit Thapsigargin, einem hochspezifischen Inhibitor der
Ca 2+ -Mg 2+ -ATPase, an Ratten- und Bullenspermien lassen darauf schließen, dass
das zytosolische Ca 2+ aktiv mit Hilfe von ATP-abhängigen, Thapsigargin-sensitiven
Ca 2+ -Pumpen ins Akrosom transportiert wird. Über einen IP3–aktivierten
Ca 2+ -Kanal werden die Ionen dann während der Akrosomreaktion aus dem Akrosom
freigesetzt. Die Lokalisierung von IP3-Rezeptoren am Akrosom von Spermien bei
Ratte, Hamster, Maus und Hund weist ebenfalls auf das Akrosom als einen
intrazellulären Ca 2+ -Speicher hin (WALENSKY u. SNYDER 1995). Die
physiologische Rolle der Ca 2+ -Ionen ist noch unklar, vermutlich fungieren sie als
intrazellulärer Botenstoff, was eine präzise Kontrolle des intrazellulären
Ca 2+ -Spiegels erfordern würde (BREITBART u. SPUNGIN 1997). Die intrazelluläre
Ca 2+ -Konzentration wird vermutlich auch über die Plasmamembran (FLORMAN et al.
1998) und die Membran der Mitochondrien (BREITBART et al. 1996) reguliert.
O´TOOLE et al. (2000) haben einen Ca 2+ -Eintritt aus Ca 2+ -Lagern und einen daraus
resultierenden Anstieg der Ionenkonzentration als Antwort auf die Zonaproteine
beobachtet. Ein Anstieg des intrazellulären freien Ca 2+ -Spiegels ist auch bei der
Kapazitation zu beobachten (BALDI et al. 1991). Eine durch Dekapazitationsfaktoren
regulierte Ca 2+ -ATPase wird als Hauptmechanismus der intrazellulären
Ca 2+ -Konzentration während der Kapazitation aufgefasst (FRASER u.
MC DERMOTT 1992, FRASER 1995).
Werden kapazitierte Spermatozoen mit Hilfe von Progesteron oder Proteinen der
Zona pellucida stimuliert, kommt es zu einer Aktivierung der Phospholipasen mit
einer Bildung von lipiden Signalmolekülen. Es tritt eine verstärkte Aktivierung der
Ca 2+ -abhängigen Phospholipase C auf, die zur Freisetzung von IP3 und DAG führt
(RICE et al. 2000, SWANN et al. 2001). Wie bereits im Kapitel 3.4.1. (Allgemeine
50

51
B. Literaturübersicht
Mechanismen der Signalübertragung in Zellen) angesprochen worden ist, führt IP3 in
somatischen Zellen zu einem Ca 2+ -Anstieg durch die Freisetzung von Ca 2+ aus
IP3-sensitiven intrazellulären Lagern. Da bei Spermien das Vorhandensein dieser
Lager nicht geklärt ist, treten Zweifel an der physiologischen Rolle von IP3 auf. Bei
dem zweiten Mediator, DAG, handelt es sich um den physiologischen Aktivator der
Proteinkinase C, deren Präsenz und Aktivität in Spermien nachgewiesen ist
(ROLDAN 1998).
Proteinphosphorylierung ist einer der Hauptmechanismen der Kontrolle der
Zellantwort auf veränderte Umweltbedingungen. TARDIF et al. (1999) stellen bei der
Inkubation von Eberspermien ohne kapazitationsfördernde Bedingungen die
Phosphorylierung von zwei Proteinen mit einem Molekulargewicht von 44 kDa und
57 kDa fest, unter Kapazitationsbedingungen wird dagegen eine Reihe von
Phosphoproteinen (Mr 28,000-60,000) phosphoryliert. Beim Schwein ist außerdem
eine 42 kDa Kinase nachgewiesen worden (BERRUTI 1994). Proteintyrosinkinase
(PTK) und Proteintyrosinphospatase (PTP) spielen bei der Regulation eine Rolle,
doch es ist noch umstritten, ob die Aktivierung der PTK oder die Hemmung der PTP
zum Anstieg der Tyrosinphosphorylierung führt. Es wird angenommen, dass die
Kinaseaktivität bei humanen Spermatozoen von cAMP aktiviert, von Ca 2+ -Ionen
gehemmt wird (LECLERC u. GOUPIL 2002). Ein zeitabhängiger Anstieg der
Tyrosinphosphorylierung hochmolekularer Proteine während der Kapazitation bei
menschlichen Spermien ist bei Untersuchungen von LUCONI et al. (1995)
nachgewiesen worden. CARRERA et al. (1996) bestätigen die zeitabhängige Zunahme
der Tyrosinphosphorylierung während der Kapazitation und weisen zusätzlich
durch den Einsatz des Proteintyrosinkinase-Inhibitors Genistein die Beteiligung von
PTK an der Regulation sowie eine Ca 2+ -induzierte Dephosphorylierung nach. Das
Phänomen der zeitabhängigen Zunahme der Tyrosinphosphorylierung lässt sich
beim Hamster beobachten. Bei dieser Tierart führt die Abwesenheit von Ca 2+ -Ionen
und NaHCO3 zu einer Verzögerung des Ereignisses, das Fehlen von BSA zieht eine
Abnahme der Tyrosinphosphorylierung nach sich (KULANAND u. SHIVAJI 2001).
Bei den Samenzellen der Ratte (PÉREZ-PÉ et al. 2002) induziert der Kälteschock
die Tyrosinphosphorylierung, Seminalplasmaproteine verhindern sie.

B. Literaturübersicht
Auch BALDI et al. (2000) stellen ohne einen definierten Stimulus eine verstärkte
Tyrosinphosphorylierung während der Kapazitation fest, die sich in Bezug auf die
Zeit ähnlich verhält wie der intrazelluläre Ca 2+ -Anstieg. Während CARRERA et al.
(1996) und LUCONI et al. (1996) eine Verstärkung der Tyrosinphosphorylierung
beobachten, wenn das Medium Ca 2+ -frei ist, beeinflusst bei der Maus extrazellulär
vorhandenes Ca 2+ dieses Ereignis positiv (VISCONTI et al. 1995 a, b).
NAABY-HANSEN et al. (2002) demonstrieren ein während der Kapazitation
phosphoryliertes Protein, das die Fähigkeit erhält, Kalzium zu binden.
Die Tyrosinphosphorylierung wird während der Kapazitation durch cAMP-abhängige
Signalübertragung (VISCONTI et al. 1995 a, b, LECLERC et al. 1998) und reaktive
Oxygenderivate reguliert (AITKEN et al. 1995, EMILIOZZI u. FENICHEL 1997,
LECLERC et al. 1998).
HAYASHI et al. (1987) weisen die Tyrosinphosphorylierung eines Proteins, das in die
Einleitung der Motilität involviert ist, in einer cAMP-abhängigen Weise nach. Die
Anwesenheit von Mg 2+ -Ionen ist dabei unerlässlich, während Ca 2+ -Ionen keinen
Einfluss nehmen. Die Assoziation von Anstieg der Tyrosinphosphorylierung und
Hyperaktivierung ist von SI u. OKUNO (1999) bei Hamsterspermien bestätigt
worden. Durch die Hemmung der Proteinkinase A oder der Proteintyrosinkinase
haben sie die Hyperaktivität und die Produktion tyrosinphosphorylierter Schwanzpeptide
feststellen können. Bei Hundespermien repräsentiert die cAMP-abhängige
Phosphorylierung eines 56 kDa Peptides eine Hauptregulationskomponente der
Geißelmotilität (TASH et al. 1984). Zusätzlich wird die Beteiligung einer Calmodulinabhängigen
Proteinphosphatase in der Ca 2+ -abhängigen Regulation der Hyperaktivierung
beim Rüden vermutet (TASH u. MEANS 1982, TASH et al.1988).
Unklar ist dennoch, ob die Tyrosinphosphorylierung eine physiologische Rolle
während der Kapazitation spielt oder nur mit diesem Phänomen verbunden ist
(LECLERC et al. 1998). Bei dem Einsatz des nicht-spezifischen Tyrosinkinase-
Inhibitors Erbstatin, der die Tyrosinphosphorylierung während der Kapazitation
aufhebt (LUCONI et al. 1995), hemmt dieser in vitro nicht die Kapazitation, obwohl
die Tyrosinphosphorylierung stark gehemmt wird (LUCONI et al. 1996). Die
Tyrosinphosphorylierung zeigt auch Bedeutung hinsichtlich der Spermien-Eizell-
52

53
B. Literaturübersicht
Interaktion: Zwei tyrosinphosphorylierte Proteine (35 und 46 kDa) der Membran
kapazitierter Spermien des Schweins weisen eine besondere Affinität zur Zona
pellucida auf (FLESCH et al. 2001).
Neben der Tyrosinphosphorylierung ist bei humanen Spermien auch die
Phosphorylierung von Serin- und Threoninresten beobachtet worden, ihre Rolle im
Zusammenhang mit der Kapazitation ist jedoch noch nicht geklärt (NAZ 1999).
Es ist bei dem Wissen über die intrazelluläre Signalübertragung eine gewisse
Vorsicht geboten, weil zum einen die Erkenntnisse bei In-vitro-Versuchen erworben
worden sind und nicht problemlos die Situation in vivo erklären, zum anderen
aufgrund von Speziesunterschieden die Informationen nicht ohne weiteres
übertragbar sind. Auch bei der Interpretation der Ergebnisse ist Skepsis angebracht,
da die Spezifität der eingesetzten Inhibitoren oft zweifelhaft ist und auch andere
Wege der Signalübertragung beeinflusst werden.
Die vorliegende Arbeit sollte dazu beitragen, die Signalübertragungsmechanismen
bei der Volumenregulation an Eberspermatozoen zu beleuchten.

C. Eigene Untersuchungen
C. Eigene Untersuchungen
1. Versuchskonzeption
Wie in der Einleitung bereits beschrieben, soll in der vorliegenden Arbeit eine weitere
Untersuchung hinsichtlich der an der Volumenregulation beteiligten Signalübertragungsmechanismen
an Spermienmembranen sowie eine eventuelle
Beteiligung der Tyrosinphosphorylierung am Schweinemodell erfolgen. Die Versuche
wurden in den Einrichtungen des Institutes für Reproduktionsmedizin der
Tierärztlichen Hochschule Hannover durchgeführt.
2. Material und Methoden
2.1. Gewinnung und Aufbereitung der Spermatozoen
2.1.1. Probanden
Es wurden die Ejakulate vier fertilitätsgeprüfter Eber des Institutes verwendet. Bei
den Tieren handelte es sich um Hybridzüchtungen. Das Allgemeinbefinden der Eber
war ungestört, es gab keine Anzeichen für Beeinträchtigungen der Sexualfunktion
oder Erkrankungen der Geschlechtsorgane.
2.1.2. Gewinnung der Ejakulate
Die Eber wurden regelmäßig im Abstand von fünf bis sieben Tagen zur
Ejakulatgewinnung herangezogen. Ein Phantom diente als Sprungpartner bei der
Gewinnung des Samens mit der sog. Handmethode. Mit Hilfe eines auf 35°C
vorgewärmten, einen Plastikbeutel enthaltenden Thermobechers, über dessen
Öffnung eine sterile, doppelte Gaze zur Abtrennung des Bulbourethraldrüsensekretes
gespannt war, wurde das Ejakulat gewonnen (KÖNIG 1990). Danach
54

55
C. Eigene Untersuchungen
erfolgte innerhalb von fünf bis zehn Minuten die Aufbereitung des Versuchsmaterials.
Für alle durchgeführten Versuche wurde das Gesamtejakulat verwendet.
2.1.3. Untersuchung der Ejakulatqualität
Es wurde zunächst die Ejakulatqualität hinsichtlich der Erfüllung der
Mindestanforderungen untersucht.
Es wurde das Volumen bestimmt sowie die Farbe des Samens, die Konsistenz,
pH-Wert, etwaige Beimengungen und der Geruch des Ejakulates beurteilt. Ein
Eberejakulat mit einem Durchschnittsvolumen von 200 ml ist physiologischer Weise
nahezu geruchslos, hellgrau, weiß oder leicht elfenbeinfarben bei milchig- oder
molkeähnlicher Konsistenz und einem pH-Wert zwischen 6,8-7,8 (KÖNIG 1990,
WEITZE 2001).
Die Bewegungsaktivität der nativen Spermien wurde mit Hilfe eines Phasenkontrastmikroskopes
(Zeiss 1697, Jena), das über einen auf 38°C beheizbaren Objekttisch
(Minitüb GmbH, Landshut) verfügte, bei 160facher Vergrößerung untersucht. Es
wurde der Anteil der motilen Spermien geschätzt, der sich beim Eber aus den
vorwärtsbeweglichen einschließlich der ortsbeweglichen zusammensetzt, da bei den
Spermatozoen des Ebers rasch Anabiose eintritt. Parallel wurde auf mikroskopische
Beimengungen und Agglutinationen geachtet.
Die Dichtebestimmung des Ejakulates erfolgte mit der Thomazählkammer bei
400facher Vergrößerung im Phasenkontrastmikroskop. Dazu wurden 25 µl des
Samens in 10 ml 0,9%ige NaCl-Lösung verdünnt.
Von einer mit Formol fixierten Probe wurden im Phasenkontrastmikroskop bei
1000facher Vergrößerung und Ölimmersion 200 Spermatozoen auf morphologische
Abweichungen und Veränderungen der Kopfkappe nach KRAUSE (1966) untersucht.
In den weiteren Untersuchungen wurden nur Ejakulate eingesetzt, die den
Mindestanforderungen (Volumen 100 ml, Dichte 0,1 Mio./mm 3 , Motilität 70 %,
morphologisch veränderte Spermien 45 %, davon 25 % Plasmatropfen und 20 %
übrige Abweichungen) entsprachen (WEITZE 2001).

C. Eigene Untersuchungen
2.1.4. Verdünnen und Lagern des Samens
Das Ejakulat wurde mit BTS (Beltsville Thawing Solution, Rezeptur s. J. Anhang) auf
eine Spermienzahl von 6x10 7 Spermatozoen/ml verdünnt. Je nach Versuchsumfang
wurden ein oder zwei Besamungsflaschen mit je 80 oder 100 ml benötigt. Das
verdünnte Ejakulat wurde zwei Stunden bei Raumtemperatur abgekühlt und dann bis
zum nächsten Tag bei 16,8°C gelagert. Bei allen Versuchen wurden 24 Stunden
gelagerte Spermien benutzt.
2.1.5. Aufbereitung der Spermien
Das gelagerte Ejakulat wurde am Tag des Versuches mit der Dichtegradientenzentrifugation
unter Verwendung von Percoll (Amersham Biosciences AB,
Schweden) behandelt, um Bestandteile des Verdünners, Seminalplasma, Plasmatropfen,
defekte Spermatozoen und Spermienagglutinationen zu entfernen.
Dieser Arbeitsgang wurde bei Raumtemperatur durchgeführt. Reagenzgläser mit
konisch zulaufendem Boden (10 ml) wurden zunächst mit zwei Milliliter 70%igem
Percoll und darauf mit vier Milliliter 35%igem Percoll beschickt (Herstellung der
Percoll-Lösungen s. J. Anhang). Der Percollgradient wurde dann mit der verdünnten
Spermiensuspension beschichtet. Zunächst wurden für 10 Minuten ungefähr 300 x g
(Megafuge 2.0 R Heraeus instruments, Hanau) zentrifugiert, ein bis zwei Minuten vor
Ablauf der Zeit erfolgte eine Erhöhung auf 800 x g für 20 Minuten. Danach wurde der
Überstand entfernt und das Spermienpellett in einem geringen Restüberstand von
etwa 0,5 ml resuspendiert ( in Anlehnung an HARRISON et al. 1993, ASHWORTH et
al. 1995).
Nach dem Waschen mit Percoll wurden die Spermatozoen auf eine Dichte von
5x10 6 Spermien/ml in isoosmotischem HBS (Hepes Buffered Saline, Rezeptur s. J.
Anhang) verdünnt und für die weiteren Untersuchungen bereitgestellt.
56

57
C. Eigene Untersuchungen
2.2. Methodik und Messprinzip der Volumenmessung und Durchfluss-
zytometrie
Bei den in diesen Versuchen angewandten Methoden der modernen Spermatologie
handelte es sich um die Volumenmessung, die Propidiumjodid-Färbung (PI) und
Untersuchung der Tyrosinphosphorylierung bei durchflusszytometrischer Messung,
auf die in den folgenden Abschnitten näher eingegangen werden soll.
2.2.1. Zellvolumetrische Messung (Zellvolumetrie)
2.2.1.1. Messprinzip
Zur Bestimmung der Volumina wurde das Cell Counter and Analyse System
(CASY 1, Schärfe System GmbH) eingesetzt (Abb. 3). Dieser Methode liegt das
Prinzip der Widerstandsmessung im hochfrequenten elektrischen Feld zugrunde. Die
angeschlossene Signalauswertung erfolgt mit Hilfe einer Pulsflächenanalyse.
Das Gerät verfügt über eine Präzisionsmesspore, bei der es sich um eine Bohrung in
einem Rubin handelt, der in einen Kapillarkörper eingegossen ist. Diese
Messkapillare weist bei definiertem Querschnitt und definierter Länge eine
zylindrische Form auf. An dem Messwandler liegen außen und innen zwei
Platinelektroden an, zwischen denen durch das Anlegen einer Spannung an der
Kapillarstrecke während der Messung ein konstanter Strom fließt. Die
elektrolytgefüllte Kapillare stellt einen definierten elektrischen Widerstand dar. Bei
der Messung werden 200 µl der leitfähigen Probenflüssigkeit durch die Präzisionskapillare
aufgrund eines von dem Gerät erzeugten Unterdruckes bis zum Erreichen
einer Lichtschranke angezogen. Die Flüssigkeit tritt durch die Kapillaröffnung des
Messwandlers in den Stromkreis ein. Da die Zellen eine ihrem Volumen
entsprechende Menge Elektrolytlösung verdrängen, unterscheidet sich der
Widerstand der Partikel von dem der umgebenden Lösung. Somit kommt es beim
Durchtritt jeden Spermiums zu einer Vergrößerung des Widerstandes entlang der
Kapillarstrecke, da intakte Zellen in erster Linie als Isolatoren betrachtet werden

C. Eigene Untersuchungen
können. Der Anstieg des Widerstandes entspricht daher einem Maß des Volumens
der Zellen. Die daraus resultierende Spannungsänderung kann dann gemessen
werden.
Mit Hilfe der Grundlagen der Physik lässt sich das Messprinzip folgendermaßen
herleiten: Nach dem Ohmschen Gesetz (U = R x I) ergibt sich die elektrische
Spannung (U) aus dem Produkt von Widerstand (R) und Stromstärke (I). Da bei
diesem Meßsystem eine konstante Stromstärke vorliegt, kann die Spannung als
Funktion des Widerstandes aufgefasst werden. Die Gleichung I lautet dann U = f (R).
Zusätzlich gilt, dass die Widerstandsänderung dem Volumen der Elektrolytlösung,
das die Zelle verdrängt, proportional ist. In einer Gleichung II ausgedrückt bedeutet
das R = f (V). Setzt man dann die Gleichung I in die Gleichung II ein, ergibt sich die
Formel U = f (V). Diese Formel sagt aus, dass die gemessene Spannung U eine
Funktion des Volumens V der Zelle ist.
In jeder einzelnen Messung werden mehrere tausend Zellen gleichzeitig erfasst.
Jeder Messkanal addiert die Anzahl der Partikel, die beim Durchtritt durch die
Messpore eine bestimmte Widerstandsänderung zur Folge hat. Aus den
Originalvolumen der Einzelmessungen der 1024 Messkanäle ergibt sich die
Durchschnittsverteilung der Volumen. Dieses hochempfindliche Analysesystem der
Pulsflächenanalyse ermöglicht außerdem, dass nicht nur die Amplitude sondern der
gesamte Messverlauf erfasst wird. Das Gerät berechnet aus den Einzelmessungen
mit Hilfe der Pulsflächenanalyse ein Integral des Messsignals.
Die ermittelten Volumina werden im Anschluss an die Messung automatisch auf dem
Bildschirm des CASY1 in einem Histogramm dargestellt. Die Verteilung der
Durchmesser wird im CASY-Datei-Format (CASYstat-software, Schärfe System
GmbH) ausgegeben. Abbildung 3 zeigt eine solche Verteilung zur Verdeutlichung.
58

59
C. Eigene Untersuchungen
Abb. 3: CASY-Datei-Format: Beispiel für die beim Einsatz des Cell Counter-
Systems gemessenen Volumenverteilungen von Eberspermien (unter
isoosmotischen Bedingungen)
Auf der x-Achse stehen die Größen gemessen in µm, auf der y-Achse sind die
Partikelanzahlen aufgetragen. Der Messbereich ist variabel, durch das Setzen der
Cursor erfolgt eine Auswertung der Messergebnisse durch das Gerät. Als untere
Grenze wurde 2,24 µm gewählt, um auszuschließen, dass Schmutzpartikel und
Zellfragmente in die Messung mit eingehen, als obere Grenze wurden unter
Berücksichtigung des mittleren Spermiendurchmessers 6,00 µm eingestellt.
Abhängig von der Dichte wurden bei jeder Messung 18.000 bis 30.000 Spermien
erfasst.
2.2.1.2. Volumetrische Messung der Eberspermatozoen
Es erfolgten volumetrische Messungen der Eberspermien bei verschiedenen
Osmolaritäten (isoosmotisch, hypoosmotisch, hyperosmotisch) in HBS (s. J. Anhang)
nach fünf und zwanzig Minuten. Beim Wechsel der Osmolarität des Messmediums
wurde das System vorher zweimal mit der entsprechenden Messlösung gespült.
Dann wurde eine Leermessung mit der entsprechenden Osmolarität der eigentlichen
Probenmessung vorangestellt. Alle eingesetzten Spülflüssigkeiten und Proben-

C. Eigene Untersuchungen
flüssigkeiten wurden mit Hilfe einer Einwegspritze durch einen Filtrationsvorsatz
(Millex TM GP Filter Unit, 0,22 µm von Millipore Express® PES membrane) gegeben,
um einen möglichst geringen Messhintergrund zu erzielen, der die Messung nicht
durch Überlagerungen von Schmutzpartikeln beeinträchtigt.
2.2.1.3. Modifizierter hypoosmotischer Schwelltest (HOST)
Bei den volumetrischen Untersuchungen der Spermien mit Hilfe des CASY1 wurde
der modifizierte HOST angewendet. Die mit Percoll gewaschenen Spermatozoen
wurden auf eine Dichte von 5x10 6 Spermien/ml in isoosmotischem HBS eingestellt
und für 10 Minuten bei 38°C im Wärmeschrank vorinkubiert. Dann wurden 80 µl der
Spermiensuspension in Messgläser mit vier Milliliter isoosmotischem
(300 ± 5 mosm/kg), hypoosmotischem (180 ± 5 mosm/kg) oder hyperosmotischem
(450 ± 5 mosm/kg) HBS überführt. Nach einer Inkubation von fünf Minuten bei 38°C
im Wärmeschrank erfolgte die Messung von 200 µl der Probe im einfachen
Messzyklus.
2.2.1.4. Regulatory Volume Decrease (RVD) und Regulatory Volume Increase (RVI)
Für die Erfassung der regulativen Volumenverminderung (RVD) unter
hypoosmotischer Belastung und des regulativen Volumenanstieges (RVI) im
hyperosmotischen Medium wurde genauso vorgegangen wie bei dem HOST,
inkubierte aber zusätzlich Proben 20 Minuten in HBS drei verschiedener
Osmolaritäten (300, 180, 450 mosm/kg) bei 38°C. Dann erfolgte die Messung mit
dem CASY1.
2.2.1.5. Statistische Auswertung der volumetrischen Messungen
Für die statistische Bearbeitung der Messergebnisse der volumetrischen
Untersuchung wurden die unter hypoosmotischen und hyperosmotischen
Belastungen gemessenen mittleren Spermienvolumen und Modalwerte der
60

61
C. Eigene Untersuchungen
Spermienvolumenverteilung mit Hilfe von in Latexeichungen ermittelten Korrekturfaktoren,
mit denen die gemessenen Werte multipliziert wurden, korrigiert. Die
Korrekturfaktoren wurden nach den folgenden Formeln berechnet, wobei für die
Variable y die genaue Osmolarität des isoosmotischen Mediums eingesetzt wird, für
z die des hypoosmotischen und für w die des hyperosmotischen Mediums.
Korrektur des mittleren Spermienvolumens ( Mean Volume in fl ):
Korrekturfaktor für Vhypo (korr) = (0,0103 x y + 22,705)/(0,0103 x z + 22,705)
Korrekturfaktor für Vhyper (korr) = (0,0103 x y + 22,705)/(0,0103 x w + 22,705)
Korrektur des Modalvolumens ( Volume in fl ):
Korrekturfaktor für Vhypo (korr) = (0,0113 x y + 14,546)/(0,0113 x z + 14,546)
Korrekturfaktor für Vhyper (korr) = (0,0113 x y + 14,546)/(0,0113 x w + 14,546)
Die folgenden Parameter wurden bei der statistischen Auswertung berücksichtigt:
• Mittleres Spermienvolumen (Mean Vol in fl) in isoosmotischer Lsg.
= V mean iso
• Mittleres Spermienvolumen (Mean Vol in fl) in hypoosmotischer Lsg.
= V mean hypo (korr)
• Mittleres Spermienvolumen (Mean Vol in fl) in hyperosmotischer Lsg.
= V mean hyper (korr)
• Quotient aus V mean hypo (korr) und V mean iso
• Quotient aus V mean hyper (korr) und V mean iso
• Modalwert der Spermienvolumenverteilung (Volume in fl) in isoosmotischer
Lsg. = V iso
• Modalwert der Spermienvolumenverteilung (Volume in fl) in hypoosmotischer
Lsg. = V hypo (korr)
• Modalwert der Spermienvolumenverteilung (Volume in fl) in hyperosmotischer
Lsg. = V hyper (korr)
• Quotient aus V hypo (korr ) und V iso
• Quotient aus V hyper (korr ) und V iso

C. Eigene Untersuchungen
Die Quotienten wurden gebildet, um von den absoluten Messwerten abgeleitete
Größen zu erhalten, die die Reaktion der Spermien verschiedener Eber vergleichbar
machten.
2.2.2. Durchflusszytometrische Untersuchungen
2.2.2.1. Messprinzip
Mit Hilfe der Durchflusszytometrie können sowohl physikalische Zelleigenschaften
(Größe, Form, Struktur) als auch unter Verwendung von Fluoreszenzstoffen, die an
Marker gekoppelt sind, Funktionen der Zellen eines Zellstroms untersucht werden.
Dabei werden mehrere tausend Zellen in wenigen Sekunden registriert (z.B.
GRAHAM et al. 1990, BLOTTNER et al. 1998, GADELLA et al. 1999, JIMÉNEZ et al.
2002).
Bei den zu analysierenden Proben handelt es sich bei dieser Methode um
Einzelzellsuspensionen. Durch einen von dem Gerät (Galaxy der Firma Dako,
Hamburg) erzeugten Unterdruck wird die Probenflüssigkeit aus dem Probengefäß
(Sarstedt, Nürnberg) über eine Stahlkapillare in die Quarz-Durchflussküvette
gesaugt. Die Spermien werden dann in der sie umgebenden Probenflüssigkeit stark
beschleunigt, auf diese Weise werden Aggregate gelöst, es passiert immer nur eine
einzelne Zelle den fokussierten Strahl des Lasers. Dabei bewirken die Spermien
eine von ihrer Größe und Granularität abhängige Lichtbrechung, die als
Streulichtsignal von Lichtdetektoren in bis zu 65.636 Kanälen pro Parameter
empfangen wird. Zwei Anteile der Lichtbeugung sind zu unterscheiden und geben
verschiedene Auskünfte über die gemessenen Zellen: Das Vorwärtsstreulicht
(FSC = forward scatter) verhält sich proportional zur Spermiengröße, das
Seitwärtsstreulicht (SSC = side scatter) gibt Informationen über die Granularität und
Komplexität der Spermatozoen.
Bei dem Einsatz fluoreszenzmarkierter Farbstoffe wird das Prinzip der Quantenoptik
genutzt: Licht einer bestimmten Wellenlänge regt Materie an. Die Materie absorbiert
das Licht, wobei die absorbierte Energie umgekehrt proportional zur Wellenlänge des
62

63
C. Eigene Untersuchungen
Lichtes ist. Die absorbierte Energie überführt die Zelle in einen angeregten Zustand,
wenn die Energie dann durch das Aussenden eines Photons geringerer Energie und
größerer Wellenlänge wieder abgegeben wird, kehrt die Materie in den
Grundzustand zurück. Bei dieser Rückkehr von dem angeregten in den
Grundzustand wird Fluoreszenz erzeugt, die mit Hilfe des Durchflusszytometers
gemessen wird. Die emittierten Photonen weisen eine für jeden Fluorchromfarbstoff
typische Wellenlänge auf. Das Gerät verfügt über für verschiedene Wellenlängen
empfindliche Lichtdetektoren: Es kann sowohl eine Grünfluoreszenz (FL-1) messen
als auch Orange- (FL-2) und Rotfluoreszenz (FL-3) erfassen. Die Fluoreszenzintensität
wird dann logarithmisch verstärkt.
Während der gesamten Versuche wurden bei jeder Messung 10.000 Zellen
ausgewertet.
Das verwendete Durchflusszytometer (Galaxy der Firma Dako, Hamburg) verfügt
über eine integrierte Computereinheit mit Software (Mikrosoft Windows 98, Flomax),
die sofort eine optische Darstellung der durchgeführten Messung und sich
anschließende gezielte Auswertung der Sechsparameterdarstellung (zwei optische:
FSC, SSC; vier Fluoreszenzparameter: FL-1, FL-2, FL-3, FL-4) ermöglicht. Es
werden zwei Formen der Darstellung unterschieden: Das Histogramm und der Dot
Plot. Bei dem Histogramm wird nur ein Parameter gezeigt, der auf der x-Achse
aufgetragen wird. Auf der y-Achse stehen die Anzahlen der gemessenen Zellen
(counts). Mit Hilfe des Dot Plot, bei dem es sich um ein Punktediagramm handelt,
können zwei Messgrößen betrachtet und miteinander in Verbindung gebracht
werden. Auf jeder Diagrammachse wird einer der zu untersuchenden Parameter
aufgeführt. An der Stelle der Graphik, an der beide Kriterien erfüllt sind, wird dieses
durch einen Punkt markiert.
Das Durchflusszytometer wurde zu Beginn jeden Versuchstages neu eingestellt. Das
genaue Vorgehen dabei ist in den jeweiligen Versuchsabschnitten gesondert erklärt.
Auch die durchzuführende Auswertung der Messungen durch einzusetzende
Messfenster, das gating, mit deren Hilfe verschiedene Zellsubpopulationen abgegrenzt
werden, wird in den jeweiligen Versuchsabschnitten erläutert.

C. Eigene Untersuchungen
2.2.2.2. Überprüfen der Membranintegrität der Spermatozoen
Parallel zu den volumetrischen Messungen wurde die Membranintegrität der
Spermien mit der Propidiumjodid-Färbung überprüft, um sicherzustellen, dass die
Untersuchungen an lebenden Zellen stattfanden. Die Impermeabilität intakter
Zellmembranen für den Fluoreszenzfarbstoff Propidiumjodid (PI) ermöglicht eine
Differenzierung lebender und toter Spermien mit Hilfe der Vitalfärbung. Ist die
Zellmembran permeabel, dringt der Farbstoff in die Zelle ein und lagert sich ohne
oder mit geringfügiger Basenpräferenz an die DNA und RNA an. Daher stellen sich
tote Zellen mit defekter Zellmembran PI-positiv dar. Diese rote Fluoreszenz kann im
Durchflusszytometer (DAKO Galaxy, Dako GmbH) dargestellt werden. Das
Absorptionsmaximum liegt bei 536 nm, das Emissionsmaximum beträgt 617 nm. Es
wurde für die PI-Färbung der 610 nm Bandpass Filter verwendet.
Die mit Percoll gewaschenen Spermien wurden in einer Konzentration von 5x10 6 /ml
in isoosmotischem HBS für 10 Minuten bei 38°C im Wärmeschrank inkubiert, dann
wurden 100 µl dieser verdünnten Spermiensuspension in 400 µl isoosmotisches,
hypoosmotisches oder hyperosmotisches HBS überführt, das 5 µl einer PI-
Gebrauchslösung (s. J. Anhang) enthielt. Es folgte eine fünf- bzw. zwanzigminütige
lichtgeschützte Inkubation der Proben bei 38°C. Nach Ablauf der Inkubationszeiten
wurden die Messungen mit dem Durchflusszytometer vorgenommen.
Es wurde für die Untersuchung der Membranintegrität mit der PI-Färbung eine
Darstellung (Layout) mit vier Diagrammen gewählt (s. Abb. 4, 5). Die Achsen der
Diagramme wurden folgendermaßen beschriftet: Histogramm oben links: x-Achse
FSC, y-Achse counts. Diese Graphik diente der Darstellung der Größenverteilung
der Spermien.
Histogramm oben rechts: x-Achse FL-3, y-Achse counts. Mit Hilfe dieses Diagramms
wurden die Populationen der lebenden und toten Zellen dargestellt.
Dot Plot unten links: x-Achse FSC, y-Achse SSC, diese Graphik gab Auskünfte über
die Zellen einer bestimmten Granularität und Größe.
64

65
C. Eigene Untersuchungen
Dot Plot unten rechts: x-Achse FL-3, y-Achse FSC. Bei diesem Diagramm handelte
es sich um eine Darstellung der lebenden und toten Zellen unter Einbeziehung der
Größenverteilung.
FSC, SSC wurden mit linearer Skala (lin) eingestellt, für FL-3 wurde eine
logarithmische Skala (log4) gewählt.
Mit einer nativen, nicht PI-gefärbten Spermienprobe wurde das Gerät so eingestellt,
dass die intakten Zellen sich als ein Gipfel im Histogramm oben rechts darstellten,
der bis zur Markierung eins der x-Achse reichte (s. Abb. 4), indem man die
Verstärkung für FL-3 variierte. Der zweite Gipfel der Kurve, der bei der PI-gefärbten
Probe auftrat und die toten Spermien darstellte, war rechts von der Markierung eins
der x-Achse zu erkennen (s. Abb. 5). Bei der Einstellung von SSC und FSC war
zusätzlich darauf zu achten, dass in den zwei Dot Plots nicht ein Teil der Population
abgeschnitten wurde, sondern die gesamte Population erfasst wurde. Bei korrekter
Einstellung sollte im Dot Plot die Verteilung der Spermien an die Form eines „L“
erinnern, wie es der Abb. 5 zu entnehmen ist.
Nach der Auswahl der Grundeinstellung wurde diese gespeichert und während des
laufenden Versuchstages nicht verändert, um einen Vergleich der Messergebnisse
zu ermöglichen.
Abb. 4: Graphik des Durchflusszytometers: Beispiel für das Einstellen der Parameter
mit einer nativen, nicht PI-gefärbten Probe

C. Eigene Untersuchungen
Abb. 5: Graphik des Durchflusszytometers: Beispiel für das Einstellen der Parameter
mit einer PI-gefärbten Probe
Die Messungen von 10.000 Zellen der Proben erfolgten bei der Geschwindigkeit
sechs. Anschließend wurden Messfenster, die „Gates“, gesetzt, um die Auswertung
der Messungen vornehmen zu können (s. Abb. 6).
Mit dem Range RN1 wurden die toten Spermien im Histogramm oben rechts erfasst.
Der Dot Plot unten rechts wurde mit Hilfe von vier Quadranten eingeteilt. Der
Quadrant Q1 (oben links) enthielt die toten Spermien mit niedriger Fluoreszenz. Der
Quadrant Q2 (oben rechts) gab Auskunft über tote Zellen hoher Fluoreszenz.
Während der Quadrant Q3 (unten links) den Anteil der lebenden Spermien niedriger
Fluoreszenzintensität darstellte, befanden sich lebende, stark fluoreszierende Zellen
im Quadranten Q4 (unten rechts). Diese Messfenster wurden bei jeder Probe einzeln
gesetzt und nicht gespeichert. Zur Verdeutlichung der Anordnung der Histogramme
und Setzen der Gates wurde die Abb. 6 angeführt.
66

67
C. Eigene Untersuchungen
Abb. 6: Graphik des Durchflusszytometers: Beispiel für das Setzen der Messfenster
(„Gates“) bei den aus einer Messung einer mit PI-beladenen Spermienprobe
erstellten Graphiken. Darunter stehen die von dem Gerät berechneten
Werte für PI-positive Spermien (RN1), tote Spermien mit niedriger
Fluoreszenz (Q1), tote Zellen hoher Fluoreszenz (Q2), den Anteil der
lebenden Spermien niedriger Fluoreszenzintensität (Q3) und lebende,
stark fluoreszierende Zellen (Q4)
2.2.2.3. Untersuchung der Tyrosinphosphorylierung mit dem Durchflusszytometer
Um die Beziehung zwischen Volumenveränderungen und Tyrosinphosphorylierung
zu untersuchen, wurde parallel zu den Volumenmessungen die Tyrosinphosphorylierung
mit Hilfe des Durchflusszytometers dargestellt und analysiert.
Zum Nachweis der Tyrosinphosphorylierung an Spermien im Durchflusszytometer
wurde ein direkt Fluoreszenz markierter Antiphosphotyrosin-Antikörper, P-Tyr (Ab-4)
FITC conjugate (Oncogene Research Products, Boston), eingesetzt, bei dem es sich
um einen murinen, monoklonalen Antikörper handelte.
Die mit Percoll gewaschenen Spermatozoen wurden in isoosmotischem HBS auf
eine Dichte von 1,5 x 10 7 Spermien/ml bzw. 2,5 x 10 7 Spermien/ml in HBS eingestellt
und 10 Minuten im Eppendorfgefäß bei 38°C im Wärmeschrank vorinkubiert. Es

C. Eigene Untersuchungen
wurden 10 µl Spermiensuspension der Konzentration 2,5 x 10 7 Spermien/ml in 0,1 ml
hypoosmotisches HBS überführt, je 20 µl der Spermiensuspension mit der Dichte
1,5 x 10 7 Spermien/ml in 0,2 ml isoosmotisches bzw. hyperosmotisches HBS
pipettiert. Die Spermien wurden 5 bzw. 20 Minuten in HBS bei 38°C im
Wärmeschrank inkubiert, dann wurde die Reaktion durch Hinzufügen der Inhibitor-
Lösung I (0,35 ml zu der hypoosmotischen und 0,25 ml zu der isoosmotischen
Probe) bzw. Inhibitor-Lösung II (0,25 ml zu der hyperosmotischen Probe) beendet,
Rezepte s. J. Anhang. Durch diesen Versuchsaufbau sollte eine Veränderung der
osmotischen Verhältnisse verhindert werden. Anschließend wurde der
Inkubationsansatz mit BSA (Bovines Serumalbumin, Merck, Darmstadt) in einer
Konzentration von 5 mg/ml versetzt, um unspezifische Bindungsstellen zu blockieren,
sowie fünf Mikroliter einer Propidiumjodid-Stammlösung (0,5 mg/ml) zugegeben.
Fünf Minuten später wurde der Antikörper P-Tyr (Ab-4) FITC conjugate hinzugefügt.
Nach einer Einwirkzeit bei Raumtemperatur erfolgte die Messung im
Durchflusszytometer. Es wurden zunächst verschiedene Antikörperkonzentrationen
(0,5 µg/ml, 1 µg/ml, 2 µg/ml, 3 µg/ml, 5 µg/ml) und unterschiedliche Einwirkungszeiten
(1 min, 3 min, 5 min, 7 min, 10 min, 15 min, 20 min, 25 min, 30 min) des
Antikörpers bei Raumtemperatur getestet. Die weiteren Versuche wurden dann mit
einer Antikörperkonzentration von 2,0 µg/ml und fünfminütiger Einwirkzeit des
Antikörpers durchgeführt.
Die Spezifität des bei der durchflusszytometrischen Methode eingesetzten
Antikörpers, P-Tyr (Ab-4) FITC conjugate, wurde in drei Versuchen überprüft. Zum
Nachweis der Spezifität des Antikörpers wurden die Proben 10 Minuten bei 38°C in
isoosmotischem HBS inkubiert und dann die Reaktion durch Hinzufügen der
Inhibitor-Lösung I gestoppt. Fünf Minuten nach der Zugabe von BSA in der
Konzentration von 5 mg/ ml und PI (Endkonzentration 5 mg/ml) wurden die Proben
im ersten Ansatz mit präimmunem Serum der Maus (Maus-IgG, Serum;
Calbiochem®) einer Konzentration von 15 µg/ml für 10 Minuten bei Raumtemperatur
anstelle des Antikörpers inkubiert. Anschließend wurde ein zweiter Antikörper, FITCkonjugierter
Anti-Maus-IgG (FITC-conjugated AffiniPure Goat Anti-Mouse IgG,
Jackson Immuno Research Laboratories, Baltimore) in der Verdünnung 1 : 1000
68

69
C. Eigene Untersuchungen
hinzupipettiert. Nach einer erneuten Einwirkzeit von 10 Minuten bei Raumtemperatur
erfolgte die Messung im Durchflusszytometer. Zusätzlich wurden unterschiedliche
Konzentrationen (2 µg/ml, 4 µg/ml, 8 µg/ml, 15 µg/ml, 20 µg/ml) des präimmunen
Mausserums bei fixierter Konzentration (1 : 1000) des zweiten FITC-konjugierten
Anti-Maus-IgG getestet.
In einem zweiten Ansatz wurde wie oben beschrieben vorgegangen, doch der
Antikörper P-Tyr (Ab-4) FITC conjugate wurde eine Stunde mit Ortho-Phosphotyrosin
(55 mM) bei Raumtemperatur vorinkubiert. Nach 10minütiger Inkubationszeit bei
Raumtemperatur wurden die Proben im Durchflusszytometer gemessen.
Für die Messung dieser Proben wurden im Durchflusszytometer sechs Diagramme
benötigt, da parallel zu der PI-Färbung mit FITC konjugiertem Antikörper gearbeitet
wurde (s. Abb. 7).
Abb. 7: Graphik des Durchflusszytometers: Diagrammanordnung und Darstellung
der Parameter, die für die Untersuchung der Tyrosinphosphorylierung im
Durchflusszytometer gewählt wurden (Graphiken einer nativen Spermienprobe
zum Einstellen des Gerätes)
Die ersten vier Darstellungen stimmen mit denen, die bereits im Abschnitt 2.2.2.2.
(Überprüfen der Membranintegrität der Spermatozoen) beschrieben worden sind,

C. Eigene Untersuchungen
überein, zusätzlich wurden zwei Diagramme ergänzt. Oben rechts erschien ein
zusätzliches Histogramm: x-Achse FL-1, y-Achse counts. Diese Graphik gab
Auskunft über die Anzahl der Zellen einer bestimmten Fluoreszenzintensität. Unten
rechts wurde ein weiterer Dot Plot gewählt: x-Achse FL-1, y-Achse FL-3. Es wurden
somit Spermien dargestellt, die eine bestimmte Rot- und zugleich Grünfluoreszenz
aufwiesen.
Bei der Eingabe der Grundeinstellung wurde für FSC und SSC eine lineare Skala
(lin) gewählt, für FL-1, FL-2 und FL-3 wurde eine logarithmische Skala (log4)
eingestellt.
Die Einstellung der Grundeinstellung erfolgte wie in Abschnitt 2.2.2.2. beschrieben,
zusätzlich war darauf zu achten, dass im Histogramm FL-1/ counts die Fluoreszenz
der unbeladenen Probe nicht über die Markierung eins der x-Achse hinausging
(s. Abb. 7 und 8).
Abb. 8: Graphik des Durchflusszytometers für die Untersuchung der Tyrosinphosphorylierung:
Beispiel für die Grundeinstellung der Parameter bei der
Messung einer mit PI beladenen Probe
Bei der Auswertung der Graphiken mit Hilfe der Messfenster („Gates“) wurde
zunächst ein Gate RN1 im Histogramm mit der Achsenbezeichnung FL-1/ counts
gesetzt. Die erste Markierung wurde fast an den Nullpunkt gesetzt, die zweite
Markierung befand sich auf der rechten Seite der Kurve, wobei darauf zu achten war,
70

71
C. Eigene Untersuchungen
die zweite dicht an die absteigende Kurve zu setzen. Das zweite Gate RN2 schloss
in demselben Histogramm die gesamte glockenförmige Kurve ein. Diese zwei Gates
beschreiben die Tyrosinphosphorylierung. Außerdem wurde der Cursor auf den
Kurvengipfel gelegt. Der Wert der x-Achse konnte dann in der grauen Leiste unten
links auf dem Bildschirm abgelesen werden. Der abzulesende Zahlenwert gab
Auskunft über die Intensität der gemessenen Fluoreszenz. Danach wurden in dem
Dot Plot unten rechts mit der Achsenbeschriftung FL-1/ FL-3 so Quadranten gesetzt,
dass die senkrechte Linie dicht rechts an den linken Populationen lag. Diese
Senkrechte lag ungefähr auf der gleichen Höhe wie die rechte Markierung des Gates
RN1, daher wurden diese zwei Diagramme zur Kontrolle stets untereinander gestellt.
Abschließend grenzte ein neues Gate RN3 in der Graphik mit der
Achsenbeschriftung FL-3/ counts (oben, Mitte) den zweiten Gipfel der Kurve ab, der
dem Anteil der PI-positiven und somit toten Spermien entsprach. Diese Auswertung
wurde zuerst an den Histogrammen der Probe vorgenommen, die fünf Minuten im
isotonen Medium inkubiert wurde (s. Abb. 9).
Abb. 9: Graphik des Durchflusszytometers: Beispiel für das Setzen der Messfenster
in den Diagrammen, die bei der Messung einer Kontrollprobe, die fünf
Minuten im isoosmotischen HBS-Medium inkubiert worden war, erstellt
wurden.

C. Eigene Untersuchungen
Dann wurde diese Einstellung gespeichert und für die Auswertung der anderen
Proben auf diese übertragen, indem sie neu geladen wurde (s. Abb. 10).
Abb. 10: Graphik des Durchflusszytometers: Beispiel für das Laden gespeicherter
Messfenster. Auf diese Weise wurden die Gates auf die Messkurven,
die bei der Analyse einer mit einem Inhibitor behandelten Probe (Calyculin
10 nM, 180 mosm/kg, Inkubation 20 Minuten) erstellt worden waren, übertragen,
um dann eine evtl. Verschiebung der Populationen darstellen zu
können. RN2 und RN3 wurden immer neu gesetzt.
Auf diese Weise konnte beobachtet werden, ob sich die Kurve in dem Gate RN1
verschob, wie sich also die Tyrosinphosphorylierung eventuell veränderte. Außerdem
konnten Verschiebungen der vier Populationen in den vier Quadranten sichtbar
gemacht werden.
RN2 und RN3 wurden dagegen bei der Auswertung jeder Probe neu gesetzt.
72

73
C. Eigene Untersuchungen
2.3.Immunfluoreszenzmikroskopischer Nachweis der Tyrosinphosphorylierung
Zum Nachweis der Tyrosinphosphorylierung im Fluoreszenzmikroskop wurden die
Spermien in einer Dichte von 5 x 10 6 Zellen/ml in isoosmotischem HBS verdünnt.
Nach einer fünf- bzw. zwanzigminütigen Inkubation im Wärmeschrank bei 38°C
wurden die Proben auf mit Methanol gereinigten Objektträgern ausgestrichen. Nach
einer Trockenzeit von 45 Minuten wurden die Proben 10 Minuten in Methanol fixiert.
Auf die getrockneten Objektträger wurde jeweils 200 µl Blockierungslösung
(s. J. Anhang) aufgetragen. Die mit Parafilm (Parafilm „M“® Laboratory Film,
American National Can, Chicago) bedeckten Objektträger wurden anschließend
über Nacht in einer feuchten Kammer bei 4°C im Kühlschrank gelagert. Nach
dreimaligem Waschen der Objektträger am folgenden Versuchstag mit PBS + 0,1%
Triton-X 100 (AppliChem, Darmstadt) inkubierten die Proben mit dem Antikörper
P-Tyr (Ab-4) FITC conjugate (Oncogene Research Products, Boston) für 90 Minuten
in einer feuchten Kammer im Wärmeschrank bei 38°C. Verschiedene
Antikörperkonzentrationen wurden gewählt: 2 µg/ml, 5 µg/ml, 10 µg/ml, 20 µg/ml und
15 µg/15 µl. Danach fand dreimaliges Waschen je 10 Minuten mit
PBS + 0,1% Triton-X 100 statt. Auf die getrockneten Objektträger wurden drei kleine
Tropfen Einbettungsmedium (PBS : Glycerin 1:9) pipettiert und ein großes Deckglas
vorsichtig daraufgelegt. Die Objektträger lagerten im Kühlschrank bei 4°C bis zur
Auswertung. Bei der Durchführung war darauf zu achten, dass die Proben, wenn der
fluoreszierende Antikörper aufgetragen wurde, nur noch dunkel gehandhabt und
gelagert werden sollten.
Die Auswertung erfolgte bei 1000facher Vergrößerung, Ölimmersion unter
Verwendung des 546 nm Erregungsfilters unter dem Fluoreszenzmikroskop.

C. Eigene Untersuchungen
2.4. Elektrophoretische Untersuchung der Tyrosinphosphorylierung
Für die Untersuchung der Tyrosinphosphorylierung an Eberspermatozoen wurde die
eindimensionale SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (1D-Page) modifiziert nach
der von LAEMMLI (1970) beschriebenen Methode durchgeführt.
2.4.1. Herstellung der Spermienextrakte
Für die elektrophoretische Analyse der Spermienproteine wurden zunächst
Spermienextrakte angefertigt. Die Herstellung der dafür nötigen Stammlösungen
(s. J. Anhang) und die Extraktion erfolgten in Anlehnung an die Protokolle von
Dr. R.A.P. HARRISON, die zur Zeit im Druck sind und aufgrund einer langjährig
bestehenden Kooperation mit seiner Arbeitsgruppe in Cambridge freundlicherweise
zur Verfügung gestellt wurden.
Nach dem Verdünnen des frischen Ejakulates in BTS auf 4x10 7 Spermien/ml am
Vortag und Lagerung bei 16,8°C für 24 Stunden wurden die Spermien mit Percoll
gewaschen, dabei wurde der Arbeitsschritt für diesen Versuchsabschnitt leicht
variiert. Die Beschickung der konischen Zentrifugenröhrchen verlief wie folgt: 2 ml
70%iges Percoll, 2 ml 35%iges Percoll, 7 ml Spermiensuspension. Zentrifugiert
wurde 15 Minuten bei ca. 300 x g, 15 Minuten bei 800 x g. Die gewaschene
Spermiensuspension wurde in HBS unterschiedlicher Osmolaritäten (180 mosm/kg,
300 mosm/kg, 450 mosm/kg) überführt:
Eppendorfgefäß mit 450 µl HBS 300 mosm/kg + 50 µl Spermiensusp., 5 min
Inkubation
Eppendorfgefäß mit 225 µl HBS 180 mosm/kg + 25 µl Spermiensusp., 5 min
Inkubation
Eppendorfgefäß mit 450 µl HBS 450 mosm/kg + 50 µl Spermiensusp., 5 min
Inkubation
Eppendorfgefäß mit 450 µl HBS 300 mosm/kg + 50 µl Spermiensusp., 20 min
Inkubation
74

75
C. Eigene Untersuchungen
Eppendorfgefäß mit 225 µl HBS 180 mosm/kg + 25 µl Spermiensusp., 20 min
Inkubation
Eppendorfgefäß mit 450 µl HBS 450 mosm/kg + 50 µl Spermiensusp., 20 min
Inkubation
Die Inkubation der Proben von fünf bzw. 20 Minuten bei 38°C erfolgte im Wasserbad.
Nach Ablauf der Inkubationszeit wurden die entsprechenden Proben entnommen,
500 µl den isoosmotischen bzw. 750 µl Inhibitor-Lösung I (s. J. Anhang) den
hypoosmotischen Proben und 500 µl Inhibitor-Lösung II (s. J. Anhang) den
hyperosmotischen Proben hinzugefügt, dann zentrifugierte (Biofuge 13, Heraeus
sepatech) man die Proben 25 s bei 13000 Umdrehungen. Danach wurde der
Überstand (etwa 950 µl bzw. 975 µl) entfernt und im nächsten Schritt dem Restpellett
von etwa 50 µl 100 µl NR-Lösung hinzugefügt. Es schloss sich eine sechsminütige
Erhitzung der Proben im Thermomixer (Thermomixer 5436, Eppendorf) bei 95°C
(Stärke10) an, anschließend kühlten die Proben bei Raumtemperatur ab. Nach einer
erneuten Zentrifugation bei etwa 13000 Umdrehungen erfolgte die Dichtebestimmung.
Nach einer vierminütigen Zentrifugation bei 13000 Umdrehungen wurde
der jeweilige Überstand, der für die Analyse verwendet werden sollte, abpipettiert
und in Eppendorfgefäßen bei -80°C eingefroren.
2.4.2. Eindimensionale SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese der Spermienextrakte
Die eindimensionale SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (1D-PAGE) wurde
modifiziert mit dem nach LAEMMLI (1970) beschriebenen Verfahren durchgeführt.
Die Herstellung der „Mini-Gele“ mit einer Größe von 6,4 cm x 8,0 cm erfolgte am
Versuchstag selbst. Nach Vorversuchen mit 12- und 15%igem Gel wurden für die
Hauptversuche die 15%igen Gele gewählt, um alle Proteine zu erfassen. Nach der
Polymerisation des 15%igen Trenngels (s. J. Anhang) wurde das 4,5%ige
Sammelgel (s. J. Anhang) daraufgeschichtet, in das vorsichtig ein Kunststoffkamm
zur Herstellung von zehn Taschen zum späteren Auftragen der Proben geschoben
wurde.

C. Eigene Untersuchungen
Es wurden zunächst Aliquote verschiedener Spermienmengen (3x10 5 , 6x10 5 , 1x10 6 ,
2x10 6 , 3x10 6 , 5x10 6 ), in weiteren Versuchen der Menge von 5 x 10 6 Spermien aus
den aufgetauten Spermienextrakten entnommen, um sicherzugehen, dass eine
ausreichend große Probenmenge zur Auftrennung zur Verfügung stand. Die
Aliquoten wurden dann mit reduzierendem, fünffach konzentriertem LAP-Puffer (s. J.
Anhang) versetzt. Dieser Puffer enthielt u.a. Bromphenolblau, das ermöglichte, den
Lauf der Proben im Gel zu verfolgen. Fünf Minuten wurden die Proben im
Thermomixer (MWG-Biotech, Gesellschaft für angewandte Biotechnologie mbH) bei
95°C erhitzt, dann erfolgte eine einminütige Zentrifugation (Biofuge 13, Heraeus
sepatech) bei 13.000 Umdrehungen. Die entsprechenden Standardproteine (Broad
Range Molecular Weight Proteinstandard (BMW), Biorad, München) wurden in
gleicher Weise behandelt.
Für die Elektrophorese wurde eine mit Elektrodenlauf-Puffer (s. J. Anhang) gefüllte
Elektrophoresekammer (Mini-Protean II, BioRad, München) benutzt. Die Taschen im
Gel wurden mit den Proben beschickt. Es wurde eine Spannung von 100 V
(~20-25 Minuten) angelegt, die beim Übertritt der Proben vom Sammel- in das
Trenngel auf 200 V (~50-60 Minuten) erhöht wurde. Die Auftrennung wurde beendet,
wenn der Farbstoff Bromphenolblau am unteren Gelrand auslief.
2.4.3. Transferieren der aufgetrennten Proteine
Zur weiteren Analyse wurden die elektrophoretisch aufgetrennten Proteine unter den
üblichen Bedingungen auf eine PVDF-Blotmembran (Roche) transferiert. Dafür
wurde ein Elektroblotter (Biometra, Göttingen) mit Wasserkühlung benutzt. Zuerst
wurden drei in Blotting-Puffer (s. J. Anhang) getränkte Filterpapiere (Schleicher &
Schuell, Dassel) übereinandergeschichtet. Darauf wurde die kurz in Methanol,
A. dest. und dann in Blotting-Puffer geschwenkte Membran (Immobilon -P Transfer
Membrane von Millipore, USA) gelegt. Auf dieser kam dann das Gel zu liegen, nicht
vom Gel bedeckte Randstreifen der Membran wurden mit Parafilm (Parafilm „M“®
Laboratory Film, American National Can, Chicago) abgedeckt. Den Abschluss
bildeten drei in Blotting-Puffer getränkte Filterpapiere. Das Transferieren der Proteine
76

77
C. Eigene Untersuchungen
auf die Membran erfolgte bei einer Stromstärke von 1 mA/ cm 2 bei Raumtemperatur,
für ein Mini-Gel der Größe 6,4 cm x 8,0 cm wurde somit eine Stromstärke von 50 mA
für 90 Minuten angelegt.
Die Membranen wurden anschließend fünf Minuten bei Raumtemperatur in
Ponceaurot (s. J. Anhang) gefärbt, um das Gelingen des Transfers zu überprüfen.
Die Proteine wurden dann mit A. dest. entfärbt. Die Membranen wurden in Blocking-
Lösung (s. Anhang) gelegt und über Nacht bei Kühlschranktemperatur (4°C)
inkubiert, um die Membran abzusättigen und unspezifische Bindungsstellen zu
blockieren.
Die Gele wurden nach dem Transferieren der Proteine auf die Membran in
Coomassie Brilliant Blue R Färbung (Serva, Heidelberg) (s. J. Anhang) 15 Minuten
bei Raumtemperatur geschwenkt und anschließend der Hintergrund mit Hilfe einer
mehrmals zu erneuernden Entfärbelösung (s. J. Anhang) entfärbt, um die
aufgetrennten Proteine zur Kontrolle direkt auf dem Gel sichtbar zu machen. Danach
wurden die Gele zwischen zwei Cellophanseiten bei Raumtemperatur getrocknet
(Gel Drying Film, Promega, Madison) und archiviert.
2.4.4. Durchführung der Immunreaktion
Zum Nachweis der Tyrosinphosphorylierung wurde das Biotin-Streptavidin-System
benutzt. Die entsprechend vorbehandelten 1D-Membranen wurden in Plastikfolie
eingeschweißt und mit dem murinen Anti-Phosphotyrosin-Antikörper, Anti-
Phosphotyrosine PY 20 (mouse) biotin conjugate (Calbiochem-Novabiochem
Corporation, Bad Soden), in den Konzentrationen 1 µg/ml, 3 µg/ml, 5 µg/ml,
10 µg/ml, 15 µg/ml (Verdünnungsmedium: Blocking-Lösung, Rezeptur s. J. Anhang)
für eine Stunde im Wärmeschrank bei 38°C inkubiert. Für die sich anschließenden
Untersuchungen wurde eine Antikörperkonzentration von 3 µg/ml eingesetzt.
Nach diesem ersten Schritt der Immunreaktion wurden die Membranen dreimal für je
10 Minuten in TBS (s. J. Anhang) gewaschen, um nicht gebundenen Antikörper von
der Membran zu entfernen, und anschließend mit Alkalische Phosphatase conj.
Streptavidine (Jackson Immuno Research Laboratories, Dianova, Hamburg) in der

C. Eigene Untersuchungen
Konzentration 1:5000 bei Raumtemperatur unter leichtem Schwenken inkubiert.
Nach der zweiten Inkubation wurden die Membranen für je 10 Minuten einmal in TBS
und zweimal in TBS + 1% Tween (s. J. Anhang) gewaschen. Der letzte
Waschvorgang endete mit einem zehnminütigem Schwenken der Membranen in
Detektionslösung (s. J. Anhang). Danach wurden die Membranen 45 Minuten unter
Lichtabschluss in Detektionslösung, der NBT und BCIP (s. J. Anhang) zugesetzt
worden waren, gefärbt. Die Färbung beruht darauf, dass BCIP als Substrat für die
alkalische Phosphatase nach der Dephosphorylierung oxidativ in einen Indigofarbstoff
überführt wird. Parallel oxidiert NBT ebenfalls, der dabei entstehende
Farbstoff verstärkt die Farbreaktion. Die gefärbten Membranen wurden abschließend
mit Wasser gewaschen, um die Farbreaktion zu stoppen, dann getrocknet,
abfotografiert und in Folie eingeschweißt. Unter Lichtabschluss wurden die
eingeschweißten Membranen aufbewahrt.
Um sicherzustellen, mit den eingesetzten Antikörpern spezifische Proteinbanden zu
erkennen, wurde die Spezifität des verwendeten Antikörpers Anti-Phosphotyrosine
PY 20 (mouse) biotin conjugate und der Alkalischen Phosphatase conj. Streptavidine
überprüft. Nach dem nachfolgenden Schema wurde vorgegangen, wobei a1-a3,
b1-b3 und c1-c3 mit den Teilen je einer gedrittelten 1D-Membran mit sich
wiederholender Probenabfolge durchgeführt wurden, um einen Vergleich der
Ergebnisse zu ermöglichen. Die dazwischen erfolgten Waschungen und die
abschließende Detektion erfolgten, wie es zuvor beschrieben worden ist.
a1. Anti-Phosphotyrosine PY 20 (mouse) biotin conjugate (10 µg/ml) Inkubation 1h
im Wärmeschrank bei 38°C
Alkalische Phosphatase conj. Strept. (Verd. 1: 5000), Inkub.1h Raumtemperatur
a2. Alkalische Phosphatase conj. Strept. (Verd. 1: 5000), Inkub.1h Raumtemperatur
a3. Anti-Phosphotyrosine PY 20 (mouse) biotin conjugate (10 µg/ml) + 90 µl Ortho-
Phosphotyrosin (55mM), Vorinkubation 1h
Inkubation 1h im Wärmeschrank 38°C
Alkalische Phosphatase conj. Strept. (Verd. 1: 5000), Inkub.1h Raumtemperatur
78

79
C. Eigene Untersuchungen
b1. Anti-Phosphotyrosine PY 20 (mouse) biotin conjugate (10 µg/ml) Inkubation 1h
im Wärmeschrank 38°C
Anti-Maus-Alkalische Phosphatase (Verd. 1: 5000), Inkub.1h Raumtemperatur
b2. Anti-Maus-Alkalische Phosphatase (Verd. 1: 5000), Inkub.1h Raumtemperatur
b3. Anti-Phosphotyrosine PY 20 (mouse) biotin conjugate (10 µg/ml) + 90 µ Ortho-
Phosphotyrosin (55 mM), Vorinkubation 1h
Inkubation 1h im Wärmeschrank 38°C
Anti-Maus-Alkalische Phosphatase (Verd. 1: 5000), Inkub. 1h Raumtemperatur
c1. Anti-Phosphotyrosine PY 20 (mouse) biotin conjugate (3 µg/ml) Inkubation 1h
im Wärmeschrank 38°C
Alkalische Phosphatase conj. Strept. (Verd. 1:5000), Inkub. 1h Raumtemperatur
c2. Alkalische Phosphatase conj. Strept. (Verd. 1:5000), Inkub. 1h Raumtemperatur
c3. Maus-Serum (15 µg /ml) Inkubation 1h im Wärmeschrank 38°C
Anti-Maus-Alkalische Phosphatase (Verd. 1:1000), Inkub. 1h Raumtemperatur
3. Einfluss verschiedener Inhibitoren unter unterschiedlichen osmotischen
Bedingungen
Eine Reihe verschiedener Inhibitoren unterschiedlicher Signalübertragungsmechanismen
wurde unter verschiedenen osmotischen Bedingungen hinsichtlich
ihres Einflusses auf die Volumenregulation, Membranintegrität und Tyrosinphosphorylierung
untersucht. Die nachfolgende Tabelle 1 dient der Übersicht der
eingesetzten Inhibitoren.

C. Eigene Untersuchungen
Tab.1: Übersicht zu den eingesetzten Inhibitoren, ihren Wirkungsweisen und den
eingesetzten Konzentrationen
Reagenz Konzentrationen
Proteinkinase-Inhibitoren Stauroporin 0.1, 1, 5 µM
Lavendustin A 1, 5, 15 µM
H 89 5, 15, 50 µM
GF 109203X HCl 1, 5, 15 µM
(Bisindolylmaleimide I hydrochloride)
Proteinphosphatase-Inhibitoren Calyculin A 10, 100 nM
(+ Papaverin 20 µM)
Okadainsäure 10, 100 nM
(+ Papaverin 20 µM)
Phosphodiesterase-Inhibitor Papaverin 20 µM
Einfluss auf IZ cAMP-Konz. Forskolin 1, 5, 10, 50 µM
ohne Einfluss auf IZ cAMP- Dedoxy-Forskolin 1, 5, 10, 50 µM
Konz. (neg. Kontrolle)
Inhibitoren der Cl - -Kanäle Tamoxifen 1, 5, 25 µM
Hydroxytamoxifen 0.5, 1, 5, 10 µM
Tyrosinphosphatase-Inhibitor Vanadat 100 µM
Inhibitor der K + -Kanäle Quinin 1000 µM
Inhibitor der K + - und Na + -Kanäle Quinidin 5,25, 100, 200, 500, 1000 µM
Ergebnisse der Studien anderer Zelltypen, Untersuchungen bei Eberspermien
(HARRISON u. MILLER 2000, HOLT u. HARRISON 2002) und Vorarbeiten der
hannöverschen Arbeitsgruppe (PETROUNKINA et al. 2000a, 2001a,
PETROUNKINA u. TÖPFER-PETERSEN 2002) dienten bei der Auswahl der Stoffe
zur Orientierung.
Die eingesetzten Inhibitoren, die in DMSO gelöst worden waren, wurden bis zum
Gebrauch in mit Silica-Gel (Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Steinheim) gefüllten Tüten
bei –20°C eingefroren. Der prozentuale Anteil des Lösungsmittels (Ethanol,
Methanol, DMSO) betrug nicht mehr als 0,5-1,0 % des Endvolumens der Probe.
80

81
C. Eigene Untersuchungen
3.1. Untersuchung des Einflusses der Lagerung auf die Volumenregulation und
Membranintegrität
Am Beispiel des Quinidin sollte der Einfluss der Lagerung auf die Volumenregulation
und Membranintegrität beobachtet werden, dazu wurden Versuche mit den
Ejakulaten von sechs verschiedenen institutseigenen Ebern vorgenommen. Die
verdünnten Spermien jeden Ejakulates wurden am Tag der Entnahme (d0), einen
Tag danach (d1) und zwei Tage später (d2) untersucht. Die mit Hilfe der Percoll-
Dichtezentrifugation gewaschenen Spermien wurden in einer Konzentration von
5 x 10 6 Zellen/ml in isoosmotischem HBS-Medium 10 Minuten bei 38°C im
Wärmeschrank vorinkubiert, bevor je 80 µl dieser Spermiensuspension in vier
Milliliter HBS der Osmolarität 180, 300 und 450 ± 5 mosm/kg pipettiert wurden. Nach
einer Inkubationszeit von fünf bzw. 20 Minuten bei 38°C erfolgte die volumetrische
Messung der Proben im CASY 1. Es wurde immer eine Quinidin freie Kontrolle
gemessen sowie Proben, denen Quinidin in einer Konzentration von 5 µM bzw. 200
µM sowohl bei der Vorinkubation als auch der Inkubation unter verschiedenen
osmotischen Belastungen zugefügt worden waren.
Die Integrität der Spermienmembranen wurde parallel mit Hilfe der PI-Färbung im
Durchflusszytometer überprüft.
3.2. Untersuchung des Einflusses verschiedener Inhibitoren auf die Volumen-
regulation unter verschiedenen osmotischen Bedingungen
Die Untersuchungen erfolgten nach einer 10minütigen Präinkubation in
isoosmotischem HBS unter verschiedenen osmotischen Bedingungen
(300 mosm/kg, 180 mosm/kg, 450 mosm/kg) und bei zwei Inkubationszeiten, fünf
und zwanzig Minuten. Es wurde der Einfluss verschiedener Konzentrationen der
vorgestellten Inhibitoren auf die osmotisch induzierte Volumenregulation bei
Eberspermien mit Hilfe des CASY 1, wie es unter dem Abschnitt 2.2.1. beschrieben
worden ist, untersucht.

C. Eigene Untersuchungen
Parallel wurde die Membranintegrität mit Hilfe der PI-Färbung im Durchflusszytometer
(s. Abschnitt 2.2.2.2. Überprüfen der Membranintegrität der Spermatozoen)
überprüft, um sicherzustellen, vorwiegend Veränderungen an Populationen
lebender, osmotisch aktiver Spermien zu erfassen.
Bei der Untersuchung des Einflusses von Inhibitoren auf die Volumenregulation
wurde sowohl der Vorinkubation im isoosmotischen Medium als auch der Inkubation
in den verschiedenen Osmolaritäten der zu untersuchende Stoff hinzugefügt.
In diesem Versuchsabschnitt wurden 25 Ejakulate sieben verschiedener Eber
untersucht.
3.3. Untersuchung des Einflusses verschiedener Inhibitoren auf die Tyrosinphos-
phorylierung unter verschiedenen osmotischen Bedingungen im Durchfluss-
zytometer
Die Stoffe, die im Versuchsabschnitt 3.2. mit dem CASY1 und Durchflusszytometer
untersucht worden waren, wurden in den ermittelten optimalen Wirkstoffkonzentrationen
den Proben der Ejakulate drei verschiedener Eber zugefügt. Die
Proben wurden nach zwei Inkubationszeiten (fünf und zwanzig Minuten) bei 38°C
unter verschiedenen osmotischen Bedingungen (300, 180, 450 mosm/kg) im
Durchflusszytometer gemessen. Die Behandlung der Proben ist den Angaben des
Abschnittes 2.2.2. zu entnehmen.
3.4. Untersuchung des Einflusses verschiedener Inhibitoren auf die Tyrosin-
phosphorylierung unter verschiedenen osmotischen Bedingungen bei der
elektrophoretischen Auftrennung
Es wurden aus vier Ejakulaten drei verschiedener Eber für diesen Versuchsabschnitt
Extrakte hergestellt. Die Stoffe, die im Versuchsabschnitt 3.2. mit dem CASY1 und
Durchflusszytometer untersucht worden waren, wurden in den ermittelten optimalen
Wirkstoffkonzentrationen den Proben bei der Erstellung der Spermienextrakten
zugefügt. Die Inkubation der Proben unter verschiedenen osmotischen Bedingungen
82

83
C. Eigene Untersuchungen
(300, 180, 450 mosm/kg) betrug 20 Minuten und wurde im Wasserbad bei 38°C
vorgenommen. Die Kontrollextrakte, die nur Spermien enthielten und denen kein
weiterer Stoff zugefügt worden war, wurden sowohl fünf als auch zwanzig Minuten
inkubiert. Das weitere Vorgehen entsprach den Angaben des Abschnittes 2.4.
(Untersuchung der Tyrosinphosphorylierung mit der Elektrophorese).
4. Statistische Auswertung
Mit den bei den Versuchen erhaltenen Daten wurden unter Verwendung von
Microsoft Excel ® (Microsoft), Casystat-software (Schärfe System GmbH) und
Flowmax (Dako Galaxy, Dako GmbH, Hamburg) Zwischenberechnungen
durchgeführt und graphische Darstellungen angefertigt. Die statistische Auswertung
erfolgte mit den in SAS® (Statistical Analysis System, Institute Ltd., Version 6.02) zur
Verfügung stehenden Funktionen und wurde von Frau Dr. A. M. Petrounkina des
Institutes für Reproduktionsmedizin der Tierärztlichen Hochschule Hannover
durchgeführt.
Bei der statistischen Auswertung wurden mit Hilfe der im SAS-Programm
vorhandenen Prozedur MEANS arithmetischer Mittelwerte (MW), Standardabweichungen,
Minimum und Maximum berechnet. Aus Gründen der Übersicht werden
die Standardabweichungen in den Abb.11-44, Abb. 46-51, Abb. 53-54 nicht
aufgeführt. Die Standardabweichungen waren kleiner als 15% der Mittelwerte. Unter
Zuhilfenahme der multifaktoriellen Varianzanalyse wurden im Rahmen der GLM-
Prozedur (General Linear Models-Prozedur) die Werte der PI-positiven Spermien
und die Spermienvolumina in Abhängigkeit von den verschiedenen osmotischen
Bedingungen, dem Einfluss der Zeit und verschiedener Inhibitoren und die jeweiligen
Wechselwirkungen dieser Faktoren untereinander analysiert.
Bei den Berechnungen galten Wahrscheinlichkeitswerte p≤ 0,05 als statistisch
signifikant, p≥ 0,1 als statistisch nicht signifikant. Ergebnisse zwischen diesen
Grenzwerten (0,05 < p < 0,1) wurden als statistisch auffällig (Tendenz) bezeichnet.

D. Ergebnisse
D. Ergebnisse
1. Einfluss verschiedener Inhibitoren auf die Volumenregulation unter unter-
schiedlichen osmotischen Bedingungen
Die Ergebnisse der einzelnen Abschnitte der Hauptversuche sind nach den Effekten
in den verschiedenen Osmolaritäten zusammengefasst worden.
1.1. Einfluss der Lagerung auf die Volumenregulation und Membranintegrität
Der Vergleich der Ergebnisse der an drei aufeinander folgenden Tagen untersuchten
Ejakulate ergab, dass die Spermienvolumina unter isoosmotischen Bedingungen
sowohl nach fünf als auch nach zwanzigminütiger Inkubation keine Unterschiede
aufwiesen. Ab dem zweiten Untersuchungstag (d2) konnte tendenziell eine Abnahme
der hypoosmotischen Schwellung beobachtet werden. Die 20 Minuten lang hypoosmotischen
Belastungen ausgesetzten Spermatozoen verfügten bei den
Messungen am Tag 1 und 2 (d1, d2) über niedrigere Volumina, doch eine regulative
Volumenabnahme (RVD) lag am d1 noch vor, am d2 war das RVD dagegen
signifikant herabgesetzt (p≤ 0,04). Hinsichtlich der hyperosmotischen Volumen lagen
keine Unterschiede zwischen den Messergebnissen der drei Tage vor.
In Bezug auf die Membranintegrität waren unter iso- und hypoosmotischen
Bedingungen am d1 im Vergleich zum d0 bessere PI-Werte zu erzielen, wobei keine
Signifikanz erreicht wurde.
Da keine Verschlechterung der Ergebnisse der ein Tag lang gelagerten Spermien
(d1) gegenüber dem frisch untersuchten Samen (d0) vorlag, zeigte dieser
Vorversuch, dass ein Tag gelagerte Spermien (d1) für Studien der
Volumenregulation geeignet sind. Am zweiten Untersuchungstag (d2) waren zwar
Tendenzen zu beobachten, doch notfalls könnten auch diese Spermien eingesetzt
werden. Aufgrund dieser Versuchsergebnisse wurden bei den weiteren Versuchen in
BTS verdünnte, ein Tag bei 16,8°C gelagerte Ejakulate verwendet, um die
84

85
D. Ergebnisse
Durchführbarkeit der sehr zeitintensiven und probenreichen Untersuchungen zu
erleichtern.
1.2. Einfluss verschiedener Inhibitoren auf die Volumenregulation unter
verschiedenen osmotischen Bedingungen
1.2.1. Isoosmotische Bedingungen
Unter isoosmotischen Bedingungen blieb das Volumen der Kontrolle konstant. Die
durchschnittlichen Spermienvolumen betrugen 12,2-13,1 fl.
1.2.1.1. Einfluss der Proteinkinase-Inhibitoren
Der Einsatz von Proteinkinase-Inhibitoren führte zu einem dosisabhängigen und
spezifischen Volumenanstieg der Spermatozoen in isoosmotischem HBS-Medium.
Dieser Effekt war bereits bei der geringen Stauroporin-Konzentration von 0,1 µM zu
beobachten (s. Abb. 11): Nach fünf Minuten betrug das Volumen 14,3 fl, nach
zwanzig Minuten 15,2 fl. Bei einer Erhöhung der Stauroporin-Konzentration auf
5,0 µM stiegen die Werte auf 19,2 bzw. 22,3 fl. Dieser Anstieg war nach fünf Minuten
statistisch auffällig (p≤ 0,1), nach zwanzig Minuten trat eine Signifikanz auf (p≤ 0,01).
Sowohl die Hemmung der Tyrosinkinase mit Hilfe von Lavendustin A als auch der
Einsatz des Proteinkinase C-Inhibitors GF-109203X in der Konzentration von 5,0 µM
zog zu beiden Messzeitpunkten eine isoosmotische Spermienvolumenvergrößerung
von 17,9-25,1 fl (Lavendustin A) bzw. 18,5-26,6 fl (GF-109203X) nach sich (s. Abb.
12 und 14). Unter dem Einfluss von GF-109203X war die Zunahme nach fünf
(p≤ 0,02) und zwanzig Minuten (p≤ 0,0001) signifikant. Dieser Inhibitor führte ab einer
Konzentration von 5,0 µM zu starken Anstiegen der PI-positiven Spermien um das
fast sechsfache. Im Gegensatz zu diesen zwei Stoffen bewirkte H-89 (s. Abb. 13),
ein Inhibitor der Proteinkinase A, erst ab 15 µM eine nach fünf Minuten statistisch

D. Ergebnisse
auffällige (p≤ 0,06), nach zwanzig Minuten signifikante (p≤ 0,03) Volumenzunahme
(15,7-18,0 fl).
Vol. in fl
25
20
15
10
5
0
0
0,1
Konz. in µM
1,0
86
5,0
V iso, 5 min
V is o, 20 min
V iso, 20 min
V iso, 5 min
Abb. 11: Einfluss von Stauroporin auf das Spermienvolumen unter isoosmotischen
Bedingungen (MW, n=6)
Vol. in fl
30
25
20
15
10
5
0
0
1,0
Konz. in µM
5,0
15,0
V iso, 5 min
V iso, 20 min
V iso, 5 min
V iso, 20 min
Abb. 12: Einfluss von Lavendustin A auf das Spermienvolumen unter
isoosmotischen Bedingungen (MW, n=6)

Vol. in fl
35
30
25
20
15
10
5
0
0
5,0
Konz. in µM
15,0
87
50,0
V is o, 5 m in
V is o, 20 min
V iso, 20 min
V iso, 5 min
Abb. 13: Einfluss von H-89 auf das Spermienvolumen unter isoosmotischen
Bedingungen (MW, n=6)
Vol. in fl
35
30
25
20
15
10
5
0
0
1,0
Konz. in µM
5,0
15,0
V iso, 20 min
V iso, 5 min
V is o, 5 min
V is o, 20 m in
D. Ergebnisse
Abb. 14: Einfluss von GF-109203X auf das Spermienvolumen unter isoosmotischen
Bedingungen (MW, n=6)
1.2.1.2. Einfluss der Proteinphosphatase-Inhibitoren und des Phosphodiesterase-
Inhibitors
Manipulationen der Proteinphosphatasen PP1 und PP2A durch die Inhibitoren
Calyculin A und Okadainsäure äußerten sich in einem Volumenanstieg nach

D. Ergebnisse
20 Minuten im Vergleich zu den Kontrollwerten (s. Abb. 15, 16), dabei lag nur bei
einer Calyculin A-Konzentration von 100 nM eine Signifikanz vor (p≤ 0,04). Die
gemessenen Volumina von 16,2 fl (Calyculin A) bzw. 15,4 fl (Okadainsäure)
entsprachen einer Zunahme von 20-27 % bei einer Hemmstoffkonzentration von
100 nM. Das gleichzeitige Hinzufügen von Papaverin, das PDE hemmt, verstärkte
diesen Effekt. Schon nach fünfminütiger Inkubation traten unter dem Einfluss von
Okadainsäure und Papaverin signifikante (10 nM: p≤ 0,02; 100 nM: 0,0005)
Volumenvergrößerungen, unter der Einwirkung von Calyculin A und Papaverin erst
bei einer Konzentration von 100 nM statistisch auffällige (p≤ 0,06) Volumen-
zunahmen von 47-78 % auf. Nach 20 Minuten betrugen die signifikanten Anstiege
der Spermienvolumina sogar 82-122 % (Okadainsäure 10 nM: p≤ 0,1; 100 nM:
p≤ 0,03; Calyculin A 10 nM: p≤ 0,003; 100 nM: p≤ 0,0002). Zur Verdeutlichung dieser
Ergebnisse wurden die Abbildungen 15, 16 angefügt.
Der alleinige Einsatz von Papaverin (s. Abb. 17) nahm nach fünf und 20 Minuten
Einfluss auf die Volumenregulation, das zeigte sich bei beiden Messpunkten mit
14,9 fl und 16,1 fl ebenfalls in einer signifikanten Vergrößerung des Zellvolumens
unter isoosmotischen Bedingungen (5 min: p≤ 0,0001; 20 min: p≤ 0,02).
Vol. in fl
30
25
20
15
10
5
0
vi 5
vi 20
Kontrolle
88
Kontrolle
Okadainsäure 10 nM
Okadainsäure 100 nM
Okadainsäure Okadainsäure 100 nM + 10 nM +
Papaverin
Okadainsäure
Okadainsäure
100 nM
100 nM +
Papaverin
Abb.15: Einfluss von Okadainsäure (+ Papaverin) auf das Spermienvolumen unter
isoosmotischen Bedingungen (MW, n=3)

Vol. in fl
25
20
15
10
5
0
vi 5
vi 20
Kontrolle
89
Kontrolle
Calyculin A 10 nM
Calyculin 100 nM
Calyculin A 10 nM +
Calyculin Papaverin A 10 nM +
Papaverin
Calyculin A 100 nM +
Papaverin
D. Ergebnisse
Abb. 16: Einfluss von Calyculin A (+ Papaverin) auf das Spermienvolumen unter
isoosmotischen Bedingungen (MW, n=3)
Vol. in fl
30
25
20
15
10
5
0
vi5 vi20 vh5
vh20
vhy5 vhy20
Kontrolle
Papaverin 20 µM
Papaverin 20 µM
Kontrolle
Abb. 17: Einfluss von Papaverin auf das Spermienvolumen unter verschiedenen
osmotischen Bedingungen (MW, n=3)
1.2.1.3. Einfluss der Inhibitoren des cAMP-Spiegels und verschiedener Ionenkanäle
Die Abbildung 18 zeigt, dass bei Beeinflussung der Adenylatcyclase durch Forskolin
in den Konzentrationen 5 und 10 µM im Vergleich zu der Kontrolle bereits nach fünf
Minuten ein signifikanter Anstieg des Spermienvolumens (15,2 fl bzw. 18,4 fl)
ermittelt werden konnte (5 µM: p≤ 0,05; 10 µM: p≤ 0,0009). Das biologisch inaktive
Analogon D-Forskolin (Abb. 19) zeigte dagegen keine Wirkung nach dieser

D. Ergebnisse
Inkubationszeit. Nach 20 Minuten führten beide Reagenzien in hohen Konzentrationen
von 10 und 50 µM zu signifikanten Volumenzunahmen (Forskolin 10 µM:
p≤ 0,05; 50 µM: p≤ 0,02; Dedoxy-Forskolin 10 µM, 50 µM: p≤ 0,0001).
25
20
15
Vol. in fl 10
5
0
0
1,0
5,0
Konz. in µM
10,0
90
50,0
V iso, 5 min
V iso, 20 min
V iso, 20 min
V iso, 5 min
Abb. 18: Einfluss von Forskolin auf das Spermienvolumen unter
isoosmotischen Bedingungen (MW, n=3)
25
20
15
Vol. in fl 10
5
0
0
1,0
5,0
Konz. in µM
10,0
50,0
V iso, 5 min
V iso, 20 min
V iso, 20 min
V iso, 5 min
Abb. 19: Einfluss von Dedoxy-Forskolin auf das Spermienvolumen unter
isoosmotischen Bedingungen (MW, n=3)
Auch Tamoxifen bewirkte einen konzentrationsabhängigen, signifikanten Anstieg des
Spermienvolumens nach 20 Minuten (1µM: p≤ 0,03; 5µM: p≤ 0,0001; 25 µM:

91
D. Ergebnisse
p≤ 0,0001), wie es die Abbildung 20 verdeutlicht. Bei einer Konzentration von 1 µM
betrug die Zunahme 15 %, das entsprach einem Volumen von 18,3 fl. Ab einer
Konzentration von 5,0 µM war zusätzlich ein deutlicher Effekt auf die
Membranintegrität festzustellen, der Anteil der PI-positiven Spermien stieg zu beiden
Messzeitpunkten signifikant (p≤ 0,0003) um das vier- bis sechsfache an.
Unter dem Einfluss von Hydroxytamoxifen (s. Abb. 21) konnte zu beiden Messzeitpunkten
eine dosisabhängige Vergrößerung des isoosmotischen Zellvolumens
beobachtet werden. Bei einer fünfminütigen Einwirkzeit stiegen die Werte um
3-59 %, bei Konzentrationen von 5,0 µM (p≤ 0,04) und 10,0 µM (p≤ 0,001) waren die
Zunahmen signifikant. Nach zwanzig Minuten Inkubationszeit lagen die Volumen
4-37 % höher im Vergleich zu der Kontrolle, dabei waren die Werte bei einer
Konzentration von 5,0 µM auffällig (p≤ 0,09), bei der Konzentrationssteigerung auf
10,0 µM wandelte es sich in eine Signifikanz (p≤ 0,0001).
35
30
25
20
Vol. in fl
15
10
V iso, 5 min
V iso, 20 min
5
0
0
1,0
5,0
Konz. in µM
25,0
V iso, 20 min
V iso, 5 min
Abb. 20: Einfluss von Tamoxifen auf das Spermienvolumen unter
isoosmotischen Bedingungen (MW, n=3)

D. Ergebnisse
30
25
20
Vol. in fl 15
10
5
0
0
0,5
1,0
Konz. in µM
5,0
92
10,0
V iso, 5 min
V iso, 20 min
V iso, 20 min
V iso, 5 min
Abb. 21: Einfluss von Hydroxytamoxifen auf das Spermienvolumen unter
isoosmotischen Bedingungen (MW, n=3)
Bei geringen Konzentrationen konnte kein Einfluss von Quinidin auf die
Volumenregulation beobachtet werden. Erst bei Quinidin-Konzentrationen ab
200 µM traten Effekte auf. Nach fünfminütiger Einwirkzeit dieses Inhibitors war eine
konzentrationsabhängige Volumenzunahme zwischen 25 % (200 µM) und 118 %
(1000 µM) zu beobachten, wobei der Anstieg nur bei der Einwirkung der höchsten
Quinidin-Konzentration von 1000 µM signifikant war (p≤ 0,0004). Unter iso-
osmotischen Bedingungen (Abb. 22) kam es nach einer Inkubation von 20 Minuten
ebenfalls zu einem signifikanten Volumenanstieg, der bei 200 µM fast 50 %
(Kontrolle 12,0 fl, 200 µM 17,8 fl) betrug (p≤ 0,02), bei einer Quinidin-Konzentration
von 1000 µM verdoppelte sich das Volumen der Spermien fast (p≤ 0,0002). Die
PI-Werte stiegen konzentrationsabhängig zu beiden Messzeitpunkten bis zum
dreifachen der Kontrollwerte und entwickelten bei den höchsten Quinidin-
Konzentrationen Signifikanzen (500 µM 5 min: p≤ 0,008; 20 min: p≤ 0,0005; 1000µM
5 min: p≤ 0,01; 20 min: p≤ 0,001).

30
25
20
15
Vol. in fl
10
5
0
0 5 25 100 200 500 1000
Konz. in µM
93
V iso, 5 min
Abb. 22: Einfluss von Quinidin auf das Spermienvolumen unter
isoosmotischen Bedingungen (MW, n=6)
1.2.2. Hypoosmotische Bedingungen
V iso, 5 min
V iso, 20 min
D. Ergebnisse
Wurden die Spermien einer hypoosmotischen Umgebung ausgesetzt, war nach
einem anfänglichen Volumenanstieg eine Schrumpfung der Zellen nach 20 Minuten
in der Kontrolle festzustellen. Dieses Phänomen wird, wie bereits schon im
Literaturteil (3.2.2. Der hypoosmotische Schwelltest (HOST)) erwähnt, als RVD
bezeichnet. Die durchschnittlichen Spermienvolumen betrugen nach fünfminütiger
Inkubation 22,0-29,3 fl, zum zweiten Messzeitpunkt sank das Durchschnittsvolumen
auf 17,3-23,4 fl.
1.2.2.1. Einfluss der Proteinkinase-Inhibitoren
Durch die Zugabe der verschiedenen Proteinkinase-Inhibitoren (Abb. 23-26) wurde
zu beiden Inkubationszeitpunkten das absolute hypoosmotische Spermienvolumen
signifikant (p≤ 0,05) beeinflusst, konzentrationsabhängige Volumenzunahmen waren
zu beobachten, die jedoch nicht in dem Maße stattfanden, wie unter isoosmotischen
Bedingungen bei gleichen Konzentrationen. Eine Manipulation der Spermatozoen mit

D. Ergebnisse
Hilfe von Proteinkinase-Inhibitoren führte unter hypoosmotischer Belastung zu einer
Verbesserung der regulativen Volumenreduktion. Stauroporin (1,0; 5,0 µM) senkte
das Vrh 5 nach fünf Minuten um 18-21 %, wobei aber keine Signifikanz auftrat. Die
Wirkung der gleichen Lavendustin-Konzentrationen war ähnlich, das Vrh sank nach
fünf Minuten Einwirkzeit um 6 %. Das Hinzufügen von 5 und 15 µM H-89 (Inhibitor
der Proteinkinase A) beschleunigte das RVD, die Spermienvolumen sanken um etwa
18-25 %. Bei der statistischen Auswertung zeigte sich bei einer Konzentration von
15 µM eine Tendenz (p≤ 0,09). Die Hemmung der Proteinkinase C durch
GF-109203X wirkte sich sehr positiv auf die Rückreglation aus: Statt 37-55 %
Volumenabnahme bei den Kontrollen schrumpften die Spermien bei GF-109203X-
Konzentrationen von 1 und 5 µM mit 87-93 % fast um das zweifache der Kontrollwerte
nach einer zwanzigminütigen Inkubation. Bei einer Konzentration von 5µM war
Vrh 20 statistisch auffällig (p≤ 0,06). Im Zusammenhang mit den Proteinkinase-
Inhibitoren sollte der signifikante, starke Anstieg des Anteils PI-positiver Zellen bei
der H89-Konzentration von 50 µM um das dreifache (5 min: p≤ 0,009; 20 min:
p≤ 0,005) und ab einer GF-109203X-Konzentration von 5 µM (p≤ 0,0001) erwähnt
werden. Bei der GF-109203X-Konzentration von 15 µM waren fast alle Spermien tot.
Vol. in fl
30
25
20
15
10
5
0
0
0,1
1,0
Konz. in µM
94
5,0
V hypo, 20 min
V hypo, 5 min
V hypo, 5 min
Abb. 23: Einfluss von Stauroporin auf das Spermienvolumen unter
hypoosmotischen Bedingungen (MW, n=6)
V hypo, 20 min

Vol. in fl
35
30
25
20
15
10
5
0
0
1,0
Konz. in µM
5,0
95
15,0
V hypo, 5 min
V hypo, 20 min
V hypo, 20 min
V hypo, 5 min
Abb. 24: Einfluss von Lavendustin A auf das Spermienvolumen unter
hypoosmotischen Bedingungen (MW, n=6)
Vol. in fl
40
35
30
25
20
15
10
5
0
0
5,0
Konz. in µM
15,0
50,0
Abb. 25: Einfluss von H-89 auf das Spermienvolumen unter
hypoosmotischen Bedingungen (MW, n=6)
V hypo, 20 min
V hypo, 5 min
V hypo, 5 min
V hypo, 20 min
D. Ergebnisse

D. Ergebnisse
Vol. in fl
40
35
30
25
20
15
10
5
0
0
1,0
5,0
Konz. in µM
96
15,0
V hypo, 20 min
V hypo, 5 min
V hypo, 5 min
V hypo, 20 min
Abb. 26: Einfluss von GF-109203X auf das Spermienvolumen unter
hypoosmotischen Bedingungen (MW, n=6)
1.2.2.2. Einfluss der Proteinphosphatase-Inhibitoren und des Phosphodiesterase-
Inhibitors
Durch den Einsatz von Proteinphosphatase-Inhibitoren bei hypoosmotischer
Zellumgebung konnte zum einen die regulative Volumenabnahme signifikant
unterdrückt werden, zum anderen waren Auswirkungen auf das absolute Volumen zu
beobachten. Unter dem Einfluss von Okadainsäure (s. Abb. 27) stieg das absolute
Spermienvolumen signifikant bei einer zwanzigminütigen Einwirkzeit im Vergleich zur
Kontrolle um 55 % (100,0 nM) bzw. 72 % (10,0 nM) an (10,0 nM: p≤ 0,003; 100,0 nM:
p≤ 0,009). Es wurden Volumen von 36,4 fl (10,0 nM) und 32,8 fl (100,0 nM)
gemessen. Die Hemmung der Proteinphosphatase durch eine Konzentration von
Calyculin A (s. Abb. 28) bewirkte mit Werten von 41,0 fl und 43,4 fl sogar eine
Volumenzunahme um 84 % - 95 % (10,0 nM - 100,0 nM), nach 20 Minuten Einwirk-
zeit der Inhibitoren lag eine signifikante Zunahme vor (p≤ 0,0001). Vrh 20 stieg um
63 % (100,0 nM) bzw. 65 % (10,0 nM) ebenfalls signifikant (10,0 nM, 100 nM:
p≤ 0,0004).
Die Hemmung der Proteinphosphatasen bei gleichzeitigem Einsatz von Papaverin
(s. Abb. 27, 28) ließ, verglichen mit den Ergebnissen, die ohne Papaverin erzielt

97
D. Ergebnisse
wurden, eine Verbesserung der Volumenregulation erkennen. Mit einem Abfall von
Vrh nach zwanzigminütiger Einwirkzeit um 34-41 % im Vergleich zu den Proben
ohne Papaverin lagen die Werte unter dem Einfluss von Okadainsäure fast bei
denen der Kontrolle. Mit dem Inhibitor Calyculin gelang nur eine partielle Umkehr der
Hemmung, nach zwanzig Minuten Inkubationszeit sank Vrh mit 2,43 bzw. 1,86 um
14-34 % im Vergleich zu den Papaverin-freien Proben (Vrh 20 2,83 und 2,82).
Sowohl bei Okadainsäure in einer Konzentration von 100 nM (p≤ 0,07) als auch bei
Calyculin A in einer Konzentration von 10,0 nM (p≤ 0,08) waren die Werte für Vrh 20
statistisch auffällig.
Vol. in fl
40
35
30
25
20
15
10
5
0
vh 5
vh 20
Kontrolle
Kontrolle
Okadainsäure 10 nM
Okadainsäure 100 nM
Okadainsäure Okadainsäure 100 nM 10 nM + +
Papaverin Papaverin
Okadainsäure 100 nM +
Okadainsäure 100 nM
Papaverin
Abb. 27: Einfluss von Okadainsäure (+ Papaverin) auf das Spermienvolumen unter
hypoosmotischen Bedingungen (MW, n=3)
Vol. in fl
45
40
35
30
25
20
15
10
5
0
vh 5
vh 20
Kontrolle
Calyculin A 10 nM
Calyculin 100 nM
Calyculin A 100 nM Calyculin + Papaverin A 10 nM +
Calyculin A 10 nM + Papaverin
Calyculin 100 nM
Calyculin A 100 nM +
Calyculin A 10 nM Papaverin
Kontrolle
Abb. 28: Einfluss von Calyculin A (+ Papaverin) auf das Spermienvolumen unter
hypoosmotischen Bedingungen (MW, n=3)

D. Ergebnisse
Die alleinige Stimulation durch Papaverin (s. Abb. 17) beschleunigte unter
hypoosmotischen Bedingungen die Volumenregulation, Vrh 5 (Wert: 1,46) lag nach
fünfminütiger Einwirkzeit signifikant (p≤ 0,02) unter den Werten der Kontrolle (Wert:
1,92), es lag eine Reduktion um 24 % vor.
1.2.2.3. Einfluss der Inhibitoren des cAMP-Spiegels und verschiedener Ionenkanäle
Forskolin (s. Abb. 29) führte bei Konzentrationen von 5,0 µM und 10,0 µM zu Vrh 5-
Werten von 1,95 bzw. 1,48. Es lag somit ein konzentrationsabhängiger, signifikanter
Abfall des Vrh 5 um 16-36 % (Konzentration von 5,0 µM: p≤ 0,05, 10,0 µM:
p≤ 0,0007) nach fünf Minuten Inkubation in Bezug auf den Kontrollwert (Vrh 5: 2,32)
vor. Das hypoosmotische Volumen stieg nicht im gleich großen Umfang wie das
isotone. Forskolin wirkte sich günstig auf die von der hypoosmotischen Umgebung
der Zelle induzierte Regulation aus.
35
30
25
20
Vol. in fl 15
10
5
0
0
1,0
5,0
Konz. in µM
10,0
98
50,0
V hypo, 5 min
V hypo, 20 min
V hypo, 20 min
V hypo, 5 min
Abb. 29: Einfluss von Forskolin auf das Spermienvolumen unter hypoosmotischen
Bedingungen (MW, n=3)
Der Abbildung 30 ist zu entnehmen, dass bei der Hemmung Dedoxy-Forskolinsensitiver
Chloridkanäle die Wirkung von der eingesetzten Konzentration abhing:
Während bei geringen Konzentrationen von 1,0 µM die regulative Volumenabnahme

99
D. Ergebnisse
ausblieb, verbesserten Gehalte von 10,0 und 50,0 µM die Volumenregulation. Diese
Beobachtung ließe sich dadurch erklären, dass vermutlich nicht nur diese
Chloridkanäle sondern auch andere Chloridkanäle oder Transportmechanismen
angesprochen wurden.
Vol. in fl
40
35
30
25
20
15
10
5
0
0 1,0 5,0
Konz. in µM
10,0 50,0
V hypo, 5 min
V hypo, 5 min
V hypo, 20 min
Abb. 30: Einfluss von Dedoxy-Forskolin auf das Spermienvolumen unter
hypoosmotischen Bedingungen (MW, n=3)
Die Manipulation von Tamoxifen-empfindlichen Chloridkanälen führte zu ähnlichen
Ergebnissen (vgl. Abb. 31, 32). Bei einer Tamoxifen-Konzentration von 1,0 µM
vergrößerte sich das hypoosmotische Volumen signifikant (p≤ 0,01) nach zwanzig
Minuten über 100 % (Kontrolle 18,2 fl, Tamoxifen 1,0 µM 37,9 fl). Nach zwanzig
Minuten Inkubationszeit hemmten sowohl Tamoxifen (1,0 µM: p≤ 0,07) als auch
Hydroxy-Tamoxifen (0,5 µM: p≤ 0,06) das RVD statistisch auffällig. Eine Konzen-
trationssteigerung der Inhibitoren resultierte dagegen in einer Verbesserung der
Volumenregulation, da das isoosmotische Volumen schneller anstieg. In Bezug auf
die PI-Werte war ab einer Tamoxifen-Konzentration von 5 µM zu beiden
Messzeitpunkten ein signifikanter Anstieg festzustellen (p≤ 0,0001).

D. Ergebnisse
40
35
30
25
Vol. in fl 20
V hypo, 5 min
15
10
5
V hypo, 20 min
0
V hypo, 20 min
0
1,0
5,0
25,0
V hypo, 5 min
Konz. in µM
Abb. 31: Einfluss von Tamoxifen auf das Spermienvolumen unter hypoosmotischen
Bedingungen (MW, n=3)
45
40
35
30
25
Vol. in fl 20
15
10
5
0
0
0,5 1,0
Konz. in µM
5,0
100
10,0
V hypo, 5 min
V hypo, 20 min
V hypo, 20 min
V hypo, 5 min
Abb. 32: Einfluss von Hydroxy-Tamoxifen auf das Spermienvolumen unter
hypoosmotischen Bedingungen (MW, n=3)
Unter hypoosmotischen Belastungen (Abb. 33) war bei einer Quinidin-Konzentration
von 200 µM bereits nach fünf Minuten eine signifikante (p≤ 0,04), 25prozentige
Zellvolumenzunahme (Kontrolle 12,1 fl, 200 µM 15,1 fl) zu verzeichnen, nach
20 Minuten bestand kein signifikanter Unterschied zu den Kontrollwerten. Bei einer
Konzentrationserhöhung des Quinidin auf 500 µM und 1000 µM (s. Abb. 33) stiegen

101
D. Ergebnisse
die hypoosmotischen Volumen nach fünf Minuten signifikant um 98 % (500 µM) bzw.
46 % (1000 µM) an, bei der Konzentration von 500 µM war die Zunahme signifikant
(p≤ 0,006). Nach zwanzigminütiger Inkubation wurde die Volumenabnahme der
Zellen signifikant gehemmt, die Volumen stiegen weiter an (500 µM: p≤ 0,0007;
1000 µM: p≤ 0,01). Zugleich stieg der prozentuale Anteil der PI-positiven Spermien
bei hohen Quinidin-Konzentrationen fast um das dreifache signifikant an (p≤ 0,0002).
Vol. in fl
40
35
30
25
20
15
10
5
0
0 5 25 100 200 500
Konz. in µM
1000
V hypo, 5 min
V hypo, 5 min
V hypo, 20 min
Abb. 33: Einfluss von Quinidin auf das Spermienvolumen unter hypoosmotischen
Bedingungen (MW, n=6)
1.2.3. Hyperosmotische Bedingungen
Wurden die Spermatozoen hyperosmotischen Belastungen ausgesetzt, schrumpften
die Zellen zunächst. Beim zweiten Messpunkt hatten sie auf diese Veränderung ihrer
Umgebung mit einer regulativen Volumenvergrößerung (RVI) reagiert. Es wurden bei
den Kontrollen in hyperosmotischem Medium durchschnittliche Spermienvolumen
von 9,3-13,2 fl (fünf Minuten Inkubation) und 10,7-15,5 fl (20 Minuten Inkubation)
gemessen.

D. Ergebnisse
1.2.3.1. Einfluss der Proteinkinase-Inhibitoren
Unter dem Einfluss des Proteinkinase-Inhibitors Stauroporin (s. Abb. 34) war zu
beobachten, dass die Volumenabnahme der Zellen nach fünf Minuten signifikant
stärker war im Vergleich zu den Kontrollwerten, dabei bestand eine Konzentrations-
abhängigkeit (p≤ 0,03). Die Messwerte unter Stauroporin-Einfluss lagen zwischen
10,7-12,3 fl, während der Kontrollwert 13,2 fl betrug. Das RVI war vermindert.
Während der Vrhy 20 der Kontrolle mit 1,18 zu vermerken war, sank es mit
Stauroporin auf 0,84-0,60, das entsprach einer Abnahme um 29-49 %. Abbildung 35
stellt die Auswirkung der Manipulation der Tyrosinkinase durch Lavendustin A dar:
Dieser Inhibitor zog ab einer Konzentration von 5,0 µM eine dosisabhängige
20-130prozentige Vergrößerung des hyperosmotischen Zellvolumens (15,8 fl und
30,3 fl im vgl. zu 13,2 fl in der Kontrolle) nach fünf Minuten nach sich. Dieser Anstieg
war bei einer Konzentration von 5,0 µM signifikant (p≤ 0,02), bei 15 µM statistisch
auffällig (p≤ 0,06). Auch nach 20 Minuten nahmen die Werte von 16,8 fl (1,0 µM),
25,7 fl (5,0 µM) und 33,4 fl (15,0 µM) im Vergleich zum Durchschnittswert der
Kontrolle (15,5 fl) um 8-115 % zu. Bei einer Konzentration von 1,0 µM war der
Anstieg signifikant (p≤ 0,02).
H-89 entfaltete im Gegensatz dazu erst in sehr viel höheren Konzentrationen seine
Wirkung (s. Abb. 36). Erst ein Gehalt von 50,0 µM führte zu einer statistisch auf-
fälligen Volumenzunahme (p≤ 0,06) der Spermatozoen um 60 %. Die Kontrolle
betrug 13,15 fl, bei 50 µM H-89 lag der Wert bei 21,01 fl. Nach 20minütiger
Inkubation stieg die Volumenvergrößerung sogar mit 140 % auf das 2,4fache der
Kontrollwerte (Kontrolle 15,55 fl, 50 µM 37,29 fl) und wurde statistisch signifikant
(p≤ 0,04). Unter dem Einfluss von H-89 ist ein RVI vorhanden.
Die Hemmung der Proteinkinase C mit Hilfe von GF-109203X führte zu beiden
Messzeitpunkten zu einer konzentrationsabhängigen Steigerung des Volumens um
4-120 % (fünf Minuten) bzw. 10-108 % (20 Minuten) (s. Abb. 37). Bei einer
Konzentration von 5,0 µM war der Anstieg nach fünf Minuten signifikant (p≤ 0,04),
nach zwanzig Minuten statistisch auffällig (p≤ 0,08). Unter dem Einfluss von
102

103
D. Ergebnisse
GF-109203X ist zwar ein regulativer Volumenanstieg vorhanden, doch da die Werte
nach 20 Minuten über eins liegen, ist das RVI gestört.
Vol. in fl
16
14
12
10
8
6
4
2
0
0
0,1
Konz. in µM
1,0
5,0
V hyper, 5 min
V hyper, 20 min
V hyper, 20 min
V hyper, 5 min
Abb. 34: Einfluss von Stauroporin auf das Spermienvolumen unter
hyperosmotischen Bedingungen (MW, n=6)
Vol. in fl
35
30
25
20
15
10
5
0
0
1,0
5,0
Konz. in µM
15,0
V hyper, 5 min
V hyper, 20 min
V hyper, 20 min
V hyper, 5 min
Abb. 35: Einfluss von Lavendustin A auf das Spermienvolumen unter
hyperosmotischen Bedingungen (MW, n=6)

D. Ergebnisse
Vol. in fl
40
35
30
25
20
15
10
5
0
0
5,0
Konz. in µM
15,0
104
50,0
V hyper, 20 min
V hyper, 5 min
V hyper, 5 min
V hyper, 20 min
Abb. 36: Einfluss von H-89 auf das Spermienvolumen unter hyperosmotischen
Bedingungen (MW, n=6)
Vol. in fl
35
30
25
20
15
10
5
0
0
1,0
5,0
Konz. in µM
15,0
V hyper, 20 min
V hyper, 5 min
V hyper, 5 min
V hyper, 20 min
Abb. 37: Einfluss von GF-109203X auf das Spermienvolumen unter
hyperosmotischen Bedingungen (MW, n=6)
1.2.3.2. Einfluss der Proteinphosphatase-Inhibitoren und des Phosphodiesterase-
Inhibitors
Die Hemmung der Proteinphosphatase durch Okadainsäure (s. Abb. 38) ließ die
Spermien nach fünf Minuten um 21-28 % anschwellen (12,2 fl (10,0 nM), 11,5 fl
(100,0 nM), 9,6 fl (Kontrolle)). Dieser Volumenanstieg war bei einer Konzentration

105
D. Ergebnisse
von 10,0 nM signifikant (p≤ 0,03), bei 100 nM war er statistisch auffällig (p≤ 0,08).
Nach 20 Minuten war bei einer Konzentration von 100,0 nM kein RVI zu beobachten.
Fügte man den Proben gleichzeitig Papaverin zu (s. Abb. 38), vergrößerte sich das
Volumen der Zellen nach fünf Minuten um 4 % (10,0 nM: 10,0 fl) und 66 %
(100,0 nM: 15,9 fl), nach 20 Minuten vergrößere sich das Volumen ebenfalls und war
bei einer Konzentration von 10 nM (13,9 fl) 31 % größer als der Kontrollwert (10,7 fl),
bei 100 nM (27,2 fl) waren die Spermien dieser Proben zweieinhalb mal so groß wie
die Spermien der Kontrolle, so dass die Volumenantwort unter hyperosmotischen
Belastungen gestört war. Unter dem Einfluss der höheren Okadainsäure-
Konzentration und gleichzeitigem Einsatz von Papaverin waren die Volumen-
zunahmen zu beiden Messzeitpunkten signifikant (5 min: p≤ 0,04; 20 min: p≤ 0,01).
Ein RVI war bei beiden Konzentrationen vorhanden.
Calyculin A (s. Abb. 39) bewirkte zu beiden Messzeitpunkten eine konzentrationsabhängige
Zunahme des hyperosmotischen Volumens der Spermatozoen anstatt
einer Schrumpfung, zusammen mit Papaverin steigerte sich der Effekt: Bei 10 nM
Calyculin A stieg das Volumen nach fünf Minuten um 20 %, bei 100 nM um 31 %.
Beide Werte waren signifikant (10 nM: p≤ 0,01; 100 nM: p≤ 0,0009). Unter
gleichzeitiger Papaverin-Wirkung betrugen die signifikanten Zunahmen 41 % bzw.
68 % (10 nM: p≤ 0,04; 100 nM: p≤ 0,007). Nach zwanzigminütiger Inkubationszeit
lagen die Ergebnisse 9 % (10 nM) bzw. 42 % (100 nM) über denen der Kontrolle. Nur
die höhere Calyculin-Konzentration führte dabei zu einem signifikanten Volumen-
anstieg (p≤ 0,03). Mit Papaverin stiegen die Volumen der Spermien sogar um etwa
das Doppelte (10 nM: 108 %, 100 nM: 93 %), dabei war diese Zunahme bei einer
Konzentration von 10 nM signifikant (p≤ 0,05), bei 100 nM statistisch auffällig
(p≤ 0,07). Während der alleinige Einsatz von Calyculin A zu einem Ausbleiben des
RVI führte, war unter gleichzeitiger Einwirkung von Papaverin eine regulative
Volumenzunahme vorhanden.
Bei alleiniger Stimulation der Spermien durch Papaverin (s. Abb. 17) lagen die
Volumen nach fünfminütiger Einwirkungszeit mit einem durchschnittlichen Volumen
von 13,4 fl 43 % über dem Kontrollwert (9,4 fl), nach 20 Minuten waren die Zellen
noch 25 % größer. Das Volumen betrug 14,0 fl gegenüber dem Kontrollwert von

D. Ergebnisse
11,2 fl. Der Volumenanstieg nach zwanzigminütiger Inkubation fiel statistisch auf
(p≤ 0,09).
Vol. in fl
30
25
20
15
10
5
0
vhy 5
vhy 20
106
Kontrolle
Kontrolle
Okadainsäure 10 nM
Okadainsäure 100 nM
Okadainsäure
Okadainsäure
100 nM +
10 nM +
Papaverin
Papaverin
Okadainsäure 100 Okadainsäure nM 100 nM +
Papaverin
Abb. 38: Einfluss von Okadainsäure (+ Papaverin) auf das Spermienvolumen unter
hyperosmotischen Bedingungen (MW, n=3)
Vol. in fl
25
20
15
10
5
0
vhy 5 vhy 20
Kontrolle
Calyculin A 10 nM
Calycuin A 100 nM
Calyculin A 10 nM +
Calyculin A 10 nM +
Papaverin
Papaverin
Calyculin A 100 nM +
Kontrolle
Papaverin
Abb. 39: Einfluss von Calyculin A (+ Papaverin) auf das Spermienvolumen unter
hyperosmotischen Bedingungen (MW, n=3)
1.2.3.3. Einfluss der Inhibitoren des cAMP-Spiegels und verschiedener Ionenkanäle
Sowohl Forskolin (s. Abb. 40) als auch sein biologisch inaktives Analogon Dedoxy-
Forskolin (s. Abb. 41) resultierten unter hyperosmotischen Belastungen in einem
Verlust des RVI und einer absoluten Volumenvergrößerung. Dieser signifikante

107
D. Ergebnisse
Volumenanstieg (p≤ 0,02) war unter dem Einfluss des erst genannten Stoffes nur
nach fünf Minuten zu bemerken und betrug 45-125 %.
Unter dem Einfluss von Dedoxy-Forskolin war die Volumenzunahme dagegen
dosisabhängig zu beiden Messzeitpunkten vorhanden und signifikant (5 min:
p≤ 0,001; 20 min: p≤ 0,04). Bei fünfminütiger Einwirkzeit von Dedoxy-Forskolin
wurden die folgenden Volumina gemessen: 13,0 fl (1,0 µM), 14,4 fl (5,0 µM), 16,1 fl
(10,0 µM) und 19,6 fl (50,0 µM). Daraus ließ sich bei einem Kontrollwert von 9,3 fl
eine Volumenzunahme von 40-211 % berechnen. Nach zwanzig Minuten Inkubation
lag die Volumensteigerung zwischen 17 und 92 %.
Vol. in fl
25
20
15
10
5
0
0
1,0
5,0
10,0
Konz. in µM
50,0
V hyper, 5 min
V hyper, 20 min
V hyper, 20 min
V hyper, 5 min
Abb. 40: Einfluss von Forskolin auf das Spermienvolumen unter hyperosmotischen
Bedingungen (MW, n=3)
Vol. in fl
25
20
15
10
5
0
0
1,0
5,0
Konz. in µM
10,0
50,0
V hyper, 20 min
V hyper, 5 min
V hyper, 5 min
V hyper, 20 min
Abb. 41: Einfluss von Dedoxy-Forskolin auf das Spermienvolumen unter
hyperosmotischen Bedingungen (MW, n=3)

D. Ergebnisse
Abbildung 42 zeigt, dass die Manipulation Tamoxifen-sensitiver Kanäle unter
hyperosmotischen Bedingungen einen schwachen, konzentrationsabhängigen
Volumenanstieg nach fünf und 20 Minuten bewirkte. Zum ersten Messzeitpunkt
stiegen die Volumen um 12 % (1 µM) und 21 % (5 µM), nach 25 µM waren es sogar
142 %. Nach zwanzig Minuten führte eine Konzentration von 5 µM zu einer
20prozentigen Volumenzunahme (5 µM 12,8 fl, Kontrolle 10,7 fl), während bei 25 µM
eine fast dreifache Vergrößerung auf 31,7 fl zu registrieren war. Diese
Volumenzunahme wies zu beiden Messzeitpunkten nur bei der höchsten Tamoxifen-
Konzentration von 25 µM eine Signifikanz auf (5 min: p≤ 0,008; 20 min: p≤ 0,0001).
Ein RVI blieb unter dem Einfluss von Tamoxifen aus.
Konzentrationsabhängige Volumenzunahmen von 21-114 % (11,5 fl-20,4 fl) nach
fünf und 16-143 % (12,4 fl-31,2 fl) nach zwanzig Minuten Einwirkzeit wurden unter
dem Einfluss von Hydroxytamoxifen (s. Abb. 43) gegenüber den Kontrollwerten
(5 min 9,6 fl, 20 min 10,7 fl) vermerkt. Dieser Volumenanstieg war nach fünf Minuten
bei allen Konzentrationen signifikant (p≤ 0,05). Nach zwanzig Minuten Einwirkzeit
war die Volumenzunahme bei einer Konzentration von 1,0 µM auffällig (p≤ 0,1), bei
weiterer Erhöhung der Inhibitorkonzentration trat eine Signifikanz auf (5,0 µM:
p≤ 0,007; 10 µM: p≤ 0,0001). Ein RVI war unter der Einwirkung dieses Inhibitors
vorhanden, doch da die Werte über eins lagen, treten Störungen auf.
Vol. in fl
35
30
25
20
15
10
5
0
0
1,0
5,0
Konz. in µM
108
25,0
V Hyper, 20 min
V hyper, 5 min
V hyper, 5 min
V Hyper, 20 min
Abb. 42: Einfluss von Tamoxifen auf das Spermienvolumen unter hyperosmotischen
Bedingungen (MW, n=3)

Vol. in fl
35
30
25
20
15
10
5
0
0
0,5
1,0
Konz. in µM
5,0
109
10,0
V hyper, 5 min
V hyper, 20 min
V hyper, 20 min
V hyper, 5 min
Abb. 43: Einfluss von Hydroxytamoxifen auf das Spermienvolumen unter
hyperosmotischen Bedingungen (MW, n=3)
D. Ergebnisse
Unter hyperosmotischen Bedingungen (Abb. 44) führten die Quinidin-Konzentrationen
ab 200 µM nach fünf Minuten zu einem konzentrationsabhängigen
Volumenanstieg zwischen 37% und 135 %, der bei einer Konzentration von
1000 µM signifikant war (p≤ 0,0005). Nach zwanzig Minuten Inkubation führten
Konzentrationen von 200 und 500 µM zu einem ausbleibenden RVI. Der Wert wies
bei 200 µM eine Signifikanz auf (p≤ 0,03). Unter dem Einfluss der höchsten Quinidin-
Konzentration stieg das hyperosmotische Volumen dagegen signifikant (p≤ 0,0001)
um weitere 26 % an und betrug etwa das eineinhalbfache des Kontrollwertes. Die PI-
Werte stiegen parallel konzentrationsabhängig ab 200 µM zu beiden
Messzeitpunkten um 49 % bis zum Vierfachen an. Der Anstieg der toten Spermien
war bei 500 µM und 1000 µM signifikant (p≤ 0,0001).

D. Ergebnisse
Vol. in fl
35
30
25
20
15
10
5
0
0
5
25
100
200
Konz. in µM
500
110
1000
V hyper, 5 min
V hyper, 5 min
V hyper, 20 min
Abb. 44: Einfluss von Quinidin auf das Spermienvolumen unter hyperosmotischen
Bedingungen (MW, n=6)
1.2.4. Einfluss der Inhibitoren auf die Membranintegrität
Soweit nichts anderes vermerkt worden ist, stiegen die PI-Werte unter dem Einfluss
der verschiedenen Inhibitoren konzentrationsabhängig gegenüber den Kontrollwerten
an, zusätzlich waren Zunahmen des Anteils PI-positiver Spermien von fünf auf
zwanzig Minuten Inkubation zu beobachten. Unter isoosmotischen Bedingungen
waren die wenigsten toten Spermatozoen vorhanden. Im Vergleich zu den
isoosmotischen Werten war der Anteil PI-positiver Spermien unter hyperosmotischen
Bedingungen leicht erhöht, während unter hypoosmotischen Belastungen stets die
höchsten PI-Werte auftraten.
1.2.5. Ermittlung der optimalen Wirkstoffkonzentrationen der Inhibitoren
Dieser Versuchsabschnitt diente der Ermittlung der optimalen Wirkstoffkonzentrationen
der eingesetzten Inhibitoren, mit denen bei den sich anschließenden

111
D. Ergebnisse
weitergehenden Untersuchungen im Durchflusszytometer und in der 1D-SDS-Page
gearbeitet werden sollte. Unter dem optimalen Wirkungsgrad versteht man die
Konzentration eines Inhibitors, bei der eine Zellreaktion ausgelöst wird, ohne dass
der Zelltod eintritt. Zu seiner Ermittlung wurden das Schwellvermögen, der Rückbildungsgrad
und der Anteil der PI-positiven Spermien herangezogen. Folgende
Konzentrationen wurden ermittelt: Stauroporin 0,1 µM, Lavendustin A 5,0 µM, H-89
5,0 µM, GF-109203X 1,0 µM, Okadainsäure und Calyculin A 10,0 nM, Forskolin
1,0 µM, Dedoxy-Forskolin 1,0 µM, Tamoxifen 1,0 µM, Hydroxytamoxifen 0,5 µM.
2. Untersuchung der Tyrosinphosphorylierung unter verschiedenen
osmotischen Bedingungen im Durchflusszytometer
Die Tyrosinphosphorylierung wurde mit Hilfe des Durchflusszytometers untersucht,
um zu versuchen, ein objektives Messverfahren der Intensität der Tyrosinphosphorylierung
bezogenen Fluoreszenz zu etablieren.
Die ermittelte optimale Konzentration des Antikörpers P-Tyr (Ab-4) FITC conjugate
(Oncogene Research Products, Boston) betrug 2 µg/ml. Als Einwirkungszeit des
Antikörpers stellten sich fünf Minuten als ausreichend und geeignet heraus.
2.1. Überprüfung der Spezifität des bei der durchflusszytometrischen Methode
eingesetzten Antikörpers
Die Spezifität des Antikörpers P-Tyr (Ab-4) FITC conjugate wurde in drei Versuchen
analysiert. Die Inkubation der Proben mit präimmunem Serum der Maus (Maus-IgG,
Serum; Calbiochem®) in einer Konzentration im Überschuss von 15 µg/ml für
10 Minuten bei Raumtemperatur anstelle des Antikörpers und anschließendes
Hinzupipettieren des zweiten Antikörpers, FITC- konjugierter Anti-Maus-IgG (FITCconjugated
AffiniPure Goat Anti-Mouse IgG, Jackson Immuno Research
Laboratories, Baltimore) führte zu einer starken Abnahme der Fluoreszenzintensität.
Wurde den Proben nur FITC- konjugierter Anti-Maus-IgG hinzugefügt, sank die

D. Ergebnisse
Intensität der Tyrosinphosphorylierung bezogenen Fluoreszenz ebenfalls. Im
Gegensatz zu dem spezifischen Antikörper bewirkte die Zugabe des präimmunen
Serums in steigender Konzentration bei fixierter Konzentration des zweiten
Antikörpers keine Fluoreszenzintensitätssteigerung.
In dem zweiten Ansatz wurde der Antikörper P-Tyr (Ab-4) FITC conjugate mit
gesättigter Ortho-Phosphotyrosin-Lösung eine Stunde bei Raumtemperatur
vorinkubiert. Nach zehnminütiger Inkubationszeit bei Raumtemperatur war eine
deutliche Abnahme der Intensität der Tyrosinphosphorylierung bezogenen
Fluoreszenz im Vergleich zu der nur mit dem zu testenden Antikörper inkubierten
Probe auf 88,61 % zu beobachten (s. Abb. 45).
Die Spezifität konnte somit in drei Versuchen nachgewiesen werden. Für die
Versuche zeigte sich der Antikörper geeignet.
112

A.
B.
113
D. Ergebnisse
Abb. 45: Graphik des Durchflusszytometers: Überprüfung der Spezifität des bei der
durchflusszytometrischen Untersuchung der Tyrosinphosphorylierung
eingesetzten Antikörpers P-Tyr (Ab-4) FITC conjugate:
A. Inkubation der Kontrolle 5 min, 300 mosm/kg, Setzen und Speichern
der Messfenster, wie es bereits im Kapitel C. (Eigene Untersuchungen)
beschrieben worden ist.
B. Vorinkubation des Antikörpers P-Tyr (Ab-4) FITC conjugate mit Ortho-
Phosphotyrosin (1h bei Raumtemp.), dann Inkubation 5 min, 300
mosm/kg. Laden der gespeicherten Messfenster (s. Kapitel C. Eigene
Untersuchungen). Beim Vergleich der Graphiken von A. und B. wird die

D. Ergebnisse
Linksverschiebung der Populationen in dem Histogramm FL-1/ counts
und in dem Dot Plot Fl-1/ Fl-3 sehr deutlich. Die Linksverschiebung beruht
auf einer Abnahme der Tyrosinphosphorylierung, wenn der Antikörper mit
Ortho-Phosphotyrosin vorinkubiert worden ist.
2.2. Einfluss verschiedener Inhibitoren auf die Tyrosinphosphorylierung im
Durchflusszytometer
Der Einfluss auf die Tyrosinphosphorylierung wurde im Durchflusszytometer an allen
Inhibitoren untersucht, im Ergebnisteil soll jedoch nur auf die Stoffe eingegangen
werden, bei denen deutliche Effekte beobachtet werden konnten.
2.2.1. Isoosmotische Bedingungen
Wurden die Kontrollen in isoosmotischem HBS inkubiert, konnte im Vergleich zu der
fünfminütigen Inkubation bei einer Inkubation von 20 Minuten ein signifikanter
Anstieg der Fluoreszenzintensität von 15 % registriert werden (p≤ 0,016). Die
Intensität nahm von 14,7 auf 16,9 zu.
2.2.1.1. Einfluss der Proteinkinase-Inhibitoren
Bei der Untersuchung der Tyrosinphosphorylierung im Durchflusszytometer konnte
ein Effekt des Stauroporin in einer Konzentration von 0,1 µM unter isoosmotischen
Bedingungen vermerkt werden, die Intensität der Fluoreszenz bei einer fünfminütigen
Einwirkzeit sank um 11 % auf einen Wert von 13,2 (s. Abb. 46). Nach 20 Minuten
Inkubation trat gegenüber den Kontrollwerten eine signifikante Reduktion der
Fluoreszenzintensität um 30 % unter dem Einfluss von Stauroporin auf (p≤ 0,058),
der Wert betrug 13,0.
Unter dem Einfluss von GF-109203X (s. Abb. 46) trat nach fünfminütiger
Inkubationszeit eine statistisch auffällige Vergrößerung der Fluoreszenzintensität
114

115
D. Ergebnisse
(I iso, 5 min 22,0) auf (p≤ 0,15). Nach zwanzig Minuten nahm die Fluoreszenz-
intensität deutlich ab.
25
20
15
10
5
0
I iso, 5 min I iso, 20 min
Kontrolle
Stauroporin 0,1 µM
GF-109203X 1,0 µM
Abb. 46: Einfluss von Proteinkinase-Inhibitoren (Stauroporin und GF-109203X) auf
die Fluoreszenzintensität unter isoosmotischen Bedingungen (MW, n=4)
2.2.1.2. Einfluss der Proteinphosphatase-Inhibitoren und des Phosphodiesterase-
Inhibitors
Die Abbildung 47 stellt dar, dass die Proteinphosphatase-Inhibitoren ebenfalls eine
Abnahme der Phosphorylierung zu beiden Messzeitpunkten bewirkten. Mit
Okadainsäure nahm der Wert gegenüber der Kontrolle nach fünf Minuten um 3 % ab,
nach 20 Minuten lag eine signifikante Reduktion um 31 % vor (p≤ 0,002). Die Durch-
schnittswerte betrugen 14,3 bzw. 11,7. Vergleicht man die Messwerte nach fünf und
20 Minuten miteinander, lässt sich eine Intensitätsabnahme von 22 % feststellen.
Zusammen mit Papaverin reduzierten sich die Werte nach zwanzigminütiger
Inkubation auf 80 % der Kontrollwerte. Die gemessene Intensität lag bei 13,5. Dieser
Wert war statistisch auffällig (p≤ 0,067).
Unter der Einwirkung von Calyculin A sank die Intensität der Fluoreszenz zunächst
auf 92 % (I iso, 5 min 13,5), dann auf 82 % (I iso, 20 min 13,9) im Vergleich zu den
Kontrollwerten. Die Reduktion nach 20 Minuten war statistisch auffällig (p≤ 0,15).

D. Ergebnisse
18
16
14
12
10
8
6
4
2
0
I iso, 5 min I iso, 20 min
116
Kontrolle
Okadainsäure 10,0 nM
Okadainsäure 10 nM +
Papaverin
Calyculin A 10,0 nM
Abb. 47: Einfluss der Proteinphosphatase-Inhibitoren (Okadainsäure (+ Papaverin)
und Calyculin A) auf die Fluoreszenzintensität unter isoosmotischen
Bedingungen (MW, n=4-5)
2.2.1.3. Einfluss der Inhibitoren des cAMP-Spiegels und verschiedener Ionenkanäle
Dedoxy-Forskolin (s. Abb. 48) führte unter isoosmotischen Bedingungen zu einer
signifikanten Intensitätszunahme der Fluoreszenz bei fünfminütiger Inkubation
(p≤ 0,03). Im Vergleich zu den Kontrollwerten (I iso, 5 min 14,7) betrug der
Intensitätsanstieg unter der Einwirkung von Dedoxy-Forskolin (I iso, 5 min 19,7)
30 %. Nach zwanzig Minuten sank der Wert der Fluoreszenzintensität unter der
Einwirkung von Dedoxy-Forskolin (I iso, 20 min 14,7) im Vergleich zu dem Wert der
Kontrolle (I iso, 20 min 16,9).

25
20
15
10
5
0
I iso, 5 min I iso, 20 min
117
Kontrolle
Dedoxy-Forskolin 1,0 µM
Abb. 48: Einfluss von Dedoxy-Forskolin auf die Fluoreszenzintensität unter
isoosmotischen Bedingungen (MW, n=4)
D. Ergebnisse
Der Effekt von Tamoxifen (s. Abb. 49) bestätigte sich auch in diesem Versuchsabschnitt
in Form einer Intensitätsreduktion um 7 % (I iso, 5 min: 13,7), die sich
bezüglich der Kontrollwerte auf 30 % steigerte (I iso, 20 min: 11,8). Nach zwanzig
Minuten lag eine Signifikanz vor (p≤ 0,036). Beim Vergleich der mit Tamoxifen
versetzten Proben nach fünf- und zwanzigminütiger Inkubation, wurde eine
14prozentige Intensitätsreduktion nachweisbar.
Mit Hydroxytamoxifen waren ebenfalls prozentuale Intensitätsabnahmen zu
beobachten (s. Abb. 49). Die Tyrosinphosphorylierung sank zunächst auf 82 % der
Kontrolle, nach fünf Minuten lagen die Ergebnisse bei 12,0. Nach zwanzigminütiger
Inkubationszeit gelang mit diesem Inhibitor eine Reduktion auf 11,7, das entsprach
einer signifikanten Abnahme um 31 % (p≤ 0,018). Die Intensität ließ sich unter dem
Einfluss von Hydroxytamoxifen bei steigender Inkubationszeit um 3 % senken.
Beim Hinzufügen von Quinin (s. Abb. 49) wurde die Fluoreszenzintensität um 25 %
nach fünf bzw. 30 % nach 20 Minuten Inkubationszeit signifikant gesenkt (5 min:
p≤ 0,066; 20 min: p≤ 0,03). Es wurden Intensitäten von 11,0 bzw. 11,9 gemessen.

D. Ergebnisse
18
16
14
12
10
8
6
4
2
0
I iso, 5 min I iso, 20 min
118
Kontrolle
Tamoxifen 1,0 µM
Hydroxytamoxifen 0,5 µM
Quinin 1,0 mM
Abb. 49: Einfluss von Inhibitoren verschiedener Ionenkanäle (Tamoxifen, Hydroxytamoxifen
und Quinin) auf die Fluoreszenzintensität unter isoosmotischen
Bedingungen (MW, n=4-5)
2.2.2. Hypoosmotische Bedingungen
Die Intensität der Fluoreszenz stieg in der Kontrolle (s. Abb. 50, 51, 53) unter
hypoosmotischen Bedingungen im Vergleich zur Inkubation in isoosmotischem
Medium um 5 % (fünf Minuten) bzw. 7 % (20 Minuten). Die Durchschnittswerte
betrugen 15,5 bzw. 18,1. Aus diesen beiden Werten ließ sich eine signifikante
Intensitätssteigerung im hypoosmotischen Messmedium nach 20minütiger Inkubation
von 17 % berechnen (p≤ 0,011) berechnen.
2.2.2.1. Einfluss der Proteinkinase-Inhibitoren
Die Auswirkung von GF-109203X (s. Abb. 50) war nach fünf Minuten Inkubation in
Form einer statistisch auffälligen Intensitätszunahme von 51 % festzustellen (p≤ 0,1).
Der Wert für die Fluoreszenzintensität I hypo, 5 min betrug 23,4. Zum zweiten
Inkubationszeitpunkt sank die Fluoreszenzintensität.

25
20
15
10
5
0
I hypo, 5 min I hypo, 20 min
119
Kontrolle
GF-109203X 1,0 µM
Abb. 50: Einfluss von GF-109203X auf die Fluoreszenzintensität unter
isoosmotischen Bedingungen (MW, n=4)
2.2.2.2. Einfluss der Proteinphosphatase-Inhibitoren
D. Ergebnisse
Unter dem Einfluss von Okadainsäure (s. Abb. 51, 52) wurde die Fluoreszenzintensität
etwa 26 % gesenkt, zum zweiten Messpunkt reduzierte sich der Wert um
18 %. Nach fünfminütiger Inkubation (p≤ 0,058) und nach zwanzig Minuten (p≤ 0,16)
waren die Intensitätsabnahmen statistisch auffällig.
Unter gleichzeitiger Stimulation durch Okadainsäure und Papaverin sank die
Fluoreszenzintensität nach fünf Minuten statistisch auffällig (p≤ 0,08) auf 76 %
(I hypo, 5 min: 11,8). Nach 20 Minuten Inkubation verstärkte sich die Wirkung, die
signifikante Abnahme (p≤ 0,038) der Intensität betrug 29 % (I hypo, 20 min: 12,8).
Calyculin A zog nur nach zwanzigminütiger Einwirkzeit eine statistisch auffällige
Reduktion der Fluoreszenzintensität nach sich (p≤ 0,15). Im Vergleich zu dem
Kontrollwert (I iso, 20 min: 18,1) sank die Intensität unter dem Einfluss von Calyculin
A um 19 % auf einen Wert von 14,6 (s. Abb. 51).

D. Ergebnisse
20
18
16
14
12
10
8
6
4
2
0
I hypo, 5 min I hypo, 20 min
120
Kontrolle
Okadainsäure 10,0 nM
Okadainsäure 10,0 nM +
Papaverin
Calyculin A 10,0 nM
Abb. 51: Einfluss von Okadainsäure (+ Papaverin) und Calyculin A auf die
Fluoreszenzintensität unter hypoosmotischen Bedingungen (MW, n=4-5)

A.
B.
121
D. Ergebnisse
Abb. 52: Abnahme der Tyrosinphosphorylierung bei Inkubation mit Okadainsäure
(10 nM) unter hypoosmotischen Bedingungen: A. Inkubation der Kontrolle
5 min, 300 mosm/kg, dann Setzen und Speichern der Messfenster.
B. Inkubation mit Okadainsäure, 20 min, 180 mosm/kg. Laden der gespeicherten
Messfenster. Eine Linksverschiebung der Populationen und
somit Abnahme der Tyrosinphosphorylierung ist im Vergleich zur Kontrolle
bei der Inkubation mit Okadainsäure deutlich in den Graphiken zu
erkennen.

D. Ergebnisse
2.2.2.3. Einfluss der Inhibitoren des cAMP-Spiegels und verschiedener Ionenkanäle
Tamoxifen zog unter hypoosmotischer Belastung eine 18- bzw. 22%ige Intensitätsabnahme
(I hypo, 5 min: 12,7; I hypo, 20 min: 14,1) nach sich, dabei war aber nur
der Wert nach zwanzigminütiger Inkubation statistisch auffällig (p≤ 0,10). Das
Analogon Hydroxytamoxifen bewirkte dagegen ein stärkeres Absinken nach fünf
Minuten auf 75 % ( I hypo, 5 min: 11,7), nach 20 Minuten auf 70 % (I hypo, 20 min:
12,6) der Kontrollwerte. Während der Wert nach fünf Minuten statistisch auffällig war
(p≤ 0,099), lag nach zwanzig Minuten eine Signifikanz vor (p≤ 0,03). Die Ergebnisse
dieser zwei Inhibitoren sind der Abbildung 53 zu entnehmen.
Der Inhibitor Quinin (s. Abb. 53) führte zum Zeitpunkt beider Messungen zu einer
Abnahme der Intensität um 29 % bzw. 34 % im Vergleich zu den Kontrollwerten.
Diese Abnahme war aber statistisch nicht signifikant.
20
18
16
14
12
10
8
6
4
2
0
I hypo, 5 min I hypo, 20 min
122
Kontrolle
Tamoxifen 1,0 µM
Hydroxytamoxifen 0,5
µM
Quinin 1,0 mM
Abb. 53: Einfluss von Tamoxifen, Hydroxytamoxifen und Quinin auf die
Fluoreszenzintensität unter hypoosmotischen Bedingungen (MW, n=4-5)
2.2.3. Hyperosmotische Bedingungen
Unter hyperosmotischen Bedingungen reduzierte sich die Tyrosinphosphorylierung in
der Kontrolle im Vergleich zu der fünf Minuten inkubierten Probe (I hyper, 5 min:

123
D. Ergebnisse
14,8) nach 20 Minuten (I hyper, 20 min: 13,1) signifikant (p≤ 0,05) um 13 %
(s. Abb. 54).
2.2.3.1. Einfluss der Inhibitoren des cAMP-Spiegels und verschiedener Ionenkanäle
Wurden die Spermien einem hyperosmotischen Medium ausgesetzt, führte das
Hinzupipettieren von Hydroxytamoxifen (s. Abb. 54) zu einer statistisch auffälligen
(p≤ 0,056) Fluoreszenzreduktion um 15% auf eine Intensität von 12,6.
16
14
12
10
8
6
4
2
0
I hyper, 5 min I hyper, 20 min
Kontrolle
Hydroxytamoxifen 0,5
µM
Abb. 54: Einfluss von Hydroxytamoxifen auf die Fluoreszenzintensität unter
hyperosmotischen Bedingungen (MW, n=3)

D. Ergebnisse
3. Immunfluoreszenzmikroskopischer Nachweis der Tyrosinphosphorylierung
Bei dem Nachweis der Tyrosinphosphorylierung im Fluoreszenzmikroskop konnte
keine Fluoreszenz nachgewiesen werden, wie die nachfolgende Abbildung 55 zeigt.
Dieses Ergebnis muss nicht zwangsweise negativ gewertet werden, da es möglich
ist, dass das Signal unterhalb der Sensibilitätsgrenze dieses Verfahrens lag.
A. B.
Abb. 55: Immunfluoreszenzmikroskopische Untersuchung der Tyrosinphosphorylierung
A. Fotografie eines porcinen Spermium im Hellfeld, 1000er Vergrößerung,
Ölimmersion
B. Immunfluoreszenzmikroskopischer Nachweis der Tyrosinphosphorylierung,
1000er Vergrößerung, Ölimmersion, 546 nm (Aufnahme
desselben Spermiums wie in Abb. A)
124

125
D. Ergebnisse
4. Tyrosinphosphorylierung unter verschiedenen osmotischen Bedingungen
bei der elektrophoretischen Auftrennung
Die Tyrosinphosphorylierung wurde mit Hilfe der elektrophoretischen Auftrennung
untersucht, um die Molekulargewichte der tyrosinphosphorylierten Spermienproteine
zu ermitteln.
Um sicherzugehen, dass eine ausreichend große Probenmenge zur Auftrennung zur
Verfügung steht, wurde eine Spermienmenge von 5x10 6 aufgetragen. Bei der
Immunreaktion wurde der Antikörper Anti-Phosphotyrosine PY 20 (mouse) biotin
conjugate in einer Konzentration von 3 µg/ml verwendet, da unterhalb dieser
Antikörperkonzentration die Banden nur schwach zu erkennen waren und bei
höheren Konzentrationen keine bessere Darstellung zu erzielen war.
Die Molekulargewichte wurden über die Rf – Werte kalkuliert.
4.1. Überprüfung der Spezifität des für die Immunreaktion verwendeten
Antikörpers
Die Spezifität des Antikörpers Anti-Phosphotyrosine PY 20 (mouse) biotin conjugate
und der Alkalische Phosphatase conj. Strept. wurden zunächst untersucht, um zu
gewährleisten, spezifische tyrosinphosphorylierte Proteine zu erfassen.
Bei der Inkubation der Membranen mit dem Antikörper Anti-Phosphotyrosine PY 20
(mouse) biotin conjugate und Alkalische Phosphatase conj. Strept. erschienen
Banden im Bereich von 84 kDa, 68 kDa, 40 kDa, bei 33 kDa, 27 kDa und 14,5 kDa.
Mit verschiedenen Inkubationsschemata, die bereits im Kapitel C. (Eigene Untersuchungen)
erläutert worden sind, sollte daraufhin die Spezifität und die Anwendbarkeit
des ausgewählten Antikörpers PY 20 getestet werden. Dabei ergab sich
folgendes: Wurde die Membran nur mit Alkalischer Phosphatase conj. Strept. (Verd.
1:5000) eine Stunde bei Raumtemperatur inkubiert, traten weder Banden bei
33,0 kDa und 27,0 kDa noch bei 14,5 kDa auf. Dieses Ergebnis beruht darauf, dass
Alkalische Phosphatase Streptavidin nicht an die Proteine in diesem Bereich binden
kann und somit beim Waschvorgang entfernt wird. Diese Proteinbanden können

D. Ergebnisse
daher bei der Inkubation mit Anti-Phosphotyrosine PY 20 (mouse) biotin conjugate
und anschließender Behandlung mit Alkalischer Phosphatase conj. Strept. nur von
dem Antikörper Anti-Phosphotyrosine PY 20 (mouse) biotin conjugate stammen, da
dieser an die Proteine andockt und die Alkalische Phosphatase conj. Strept. dann im
zweiten Inkubationsschritt an den Antikörper PY20 bindet. Dieser Versuch spricht
damit für eine Spezifität des Antikörpers PY 20 im Bereich der drei genannten
Banden.
Bei einer Vorinkubation von PY20 (10 µg/ml) mit Ortho-Phosphotyrosin und
anschließender Inkubation von einer Stunde im Wärmeschrank sowie einer weiteren
Inkubation mit Alkalischer Phosphatase conj. Strept. (Verd. 1:5000) eine Stunde bei
Raumtemperatur fehlte die Bande sowohl zwischen 40 kDa als auch bei 33 kDa,
doch es traten zwei neue Banden im Bereich von 62 kDa und 54 kDa auf. Die
fehlenden Banden sprechen für die Spezifität des Antikörpers für Proteine dieses
Bereiches, da Ortho-Phospotyrosin bei der Vorinkubation an PY 20 bindet und
diesen Antikörper in seiner Bindungsfähigkeit hemmt.
Im Gegensatz zu einer Behandlung der Membran mit PY 20 (Inkubation 1h im
Wärmeschrank bei 38°C) und Anti-Maus-Alkalische Phosphatase (Verd. 1: 5000,1h
Raumtemperatur, s. Abb. 56.a) färbten sich bei alleiniger Inkubation mit Anti-Maus-
Alkalische Phosphatase (s. Abb. 56.b) keine Banden im Bereich von 33,0 kDa,
27,0 kDa und 14,5 kDa an. Zu dem Ergebnis der ausbleibenden Banden im Bereich
von 33,0 kDa, 27,0 kDa und 14,5 kDa führte auch eine Inkubation von mit Ortho-
Phosphotyrosin vorinkubiertem PY 20 und anschließende Inkubation der Membranen
mit Anti-Maus-Alkalische Phosphatase (Verd. 1: 5000) eine Stunde bei Raumtemperatur.
Wurde die Membran zunächst mit Maus-Serum (15 µg/ml) für eine Stunde im
Wärmeschrank (38°C) inkubiert und anschließend eine Stunde mit Anti-Maus-
Alkalische Phosphatase (Verd. 1:1000) für den gleichen Zeitraum bei Raumtemperatur,
waren die Banden bei 33,0 kDa stark geschwächt und fehlten im Bereich
von 27,0 kDa und 14,5 kDa (s. Abb. 56 c).
126

Probentaschen: 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
97,4 kDa
66,0 kDa
45,0 kDa
31,0 kDa
21,5 kDa
14,5 kDa
127
D. Ergebnisse
a b c
Abb. 56: SDS-Gelelektrophorese und Immunoblot: Überprüfung der Spezifität des
eingesetzten Antikörpers Anti-Phosphotyrosine PY 20 (mouse) biotin
conjugate an Eberspermien, die unter verschiedenen osmotischen
Bedingungen inkubiert wurden
a. Anti-Phosphotyrosine PY 20 (mouse) biotin conjugate 3 µg/ml +
Alkalische Phospatase conj. Streptavidine
b. Alkalische Phospatase conj. Streptavidine
c. Maus-Serum 15 mg/ml + Anti-Maus-AP
(in die Probentaschen aufgetragene Proben von je 5x10 6 Spermien 1: BMW
biotinyliert; 2, 5, 8: isoosmotisch, Inkub. 20 min; 3, 6, 9: hypoosmotisch,
Inkub. 20 min; 4, 7, 10: hyperosmotisch, 20 min)
Zusammenfassend lässt sich sagen, dass mit diesen Versuchen die Spezifität des
Antikörpers Anti-Phosphotyrosine PY 20 (mouse) biotin conjugate im niedermolekularen
Bereich für die Proteinbanden bei 33,0 kDa, 27,0 kDa und 14,5 kDa
nachgewiesen werden konnte.
4.2. Einfluss verschiedener Inhibitoren auf die Tyrosinphosphorylierung in
der Elektrophorese
33,0 kDa
27,0 kDa
14,5 kDa
Der Einfluss auf die Tyrosinphosphorylierung wurde in der Gelelektrophorese an
allen Inhibitoren untersucht, im Ergebnisteil werden jedoch nur die Stoffe erwähnt,
bei denen deutliche Effekte auftraten.

D. Ergebnisse
4.2.1. Isoosmotische Bedingungen
Unter isoosmotischen Bedingungen war eine spezifische Phosphorylierung der
Proteinbanden im niedermolekularen Bereich von 33,0 kDa, 27,0 kDa und 14,5 kDa
zu beobachten, wobei die Verlängerung der Inkubationszeit von fünf auf 20 Minuten
zu einer stärkeren Ausprägung der genannten Banden führte (s. Abb. 57).
4.2.1.1. Einfluss der Proteinkinase-Inhibitoren
Der im vorangegangenen Abschnitt beschriebene Einfluss des Proteinkinase-
Inhibitors Stauroporin (0,1 µM) auf die isoosmotische Volumenregulation ging in der
1D-Elektrophorese mit einer Schwächung der Proteinbanden des Molekulargewichtes
33,0 kDa, 27,0 kDa und 14,5 kDa einher (s. Abb. 58).
4.2.1.2. Einfluss der Proteinphosphatase-Inhibitoren und des Phosphodiesterase-
Inhibitors
Der Einfluss von Okadainsäure (10,0 nM) bestätigte sich in einer geringer
ausgeprägten Anfärbung der Proteinbanden bei 33,0 kDa und 27,0 kDa.
4.2.1.3. Einfluss der Inhibitoren des cAMP-Spiegels und verschiedener Ionenkanäle
Eine schwächere Darstellung der Proteine im Bereich von 27,0 kDa und 14,5 kDa
war auch die Folge des Einsetzens von Tamoxifen in einer Konzentration von 1,0 µM
(s. Abb. 58).
128

Probentasche: 1 2 3 4 5 6 7
97,4 kDa
66,0 kDa
45,0 kDa
31,0 kDa
21,5 kDa
14,5 kDa
129
D. Ergebnisse
Abb. 57: SDS-Gelelektrophorese und Immunoblot: Vergleich des Einflusses der
Inkubation unter verschiedenen osmotischen Bedingungen auf die Tyrosinphosphorylierung
porciner Spermien
(in die Taschen aufgetragene Proben: 1: BMW biot., 2: isoosmotisch, 5 min,
3: isoosmotisch, 20 min, 4: hypoosmotisch, 5 min, 5: hypoosmotisch,
20 min, 6: hyperosmotisch, 5 min, 7: hyperosmotisch, 20 min)
Probentaschen: 1 2 3 4
97,4 kDa
66,0 kDa
45,0 kDa
31,0 kDa
21,5 kDa
14,5 kDa
33,0 kDa
27,0 kDa
14,5 kDa
33,0 kDa
27,0 kDa
14,5 kDa
Abb. 58: SDS-Gelelektrophorese und Immunoblot: Einfluss verschiedener
Inhibitoren auf die Tyrosinphosphorylierung während der Inkubation unter
isoosmotischen Bedingungen
(in die Taschen aufgetragene Proben: 1: BMW biot., 2: Kontrolle 20 min,
3:Stauroporin 0,1 µM, 20 min, 4: Tamoxifen 1,0 µM, 20 min)

D. Ergebnisse
4.2.2. Hypoosmotische Bedingungen
Unter hypoosmotischen Belastungen fand ebenfalls eine Phosphorylierung der
Proteinbanden mit einem Molekulargewicht von 33,0 kDa, 27,0 kDa und 14,5 kDa
statt. Nach einer zwanzigminütigen Inkubation waren die genannten Banden stärker
angefärbt im Vergleich zu den fünf Minuten inkubierten Proben (s. Abb. 57).
Sowohl Okadainsäure in einer Konzentration von 10,0 nM (ohne und mit Papaverin)
als auch Tamoxifen (1,0 µM) bewirkten eine weniger starke Färbung der
Proteinbanden bei 27,0 kDa und 14,5 kDa im Vergleich zu den Kontrollen
(s. Abb. 59).
Probentaschen: 1 2 3
97,4 kDa
66,0 kDa
45,0 kDa
31,0 kDa
21,5 kDa
14,5 kDa
Abb. 59: SDS-Gelelektrophorese und Immunoblot: Einfluss verschiedener
Inhibitoren auf die Tyrosinphosphorylierung während der Inkubation unter
hypoosmotischen Bedingungen
(in die Taschen aufgetragene Proben: 1: BMW biot., 2: Kontrolle 20 min,
3: Tamoxifen 1,0 µM, 20 min)
4.2.3. Hyperosmotische Bedingungen
Unter hyperosmotischen Belastungen war eine Phosphorylierung der Proteinbanden
im niedermolekularen Bereich (33,0 kDa, 27,0 kDa und 14,5 kDa) zu beobachten.
Nach einer zwanzigminütigen Inkubation waren die genannten Banden jedoch
schwächer ausgeprägt als nach fünf Minuten (s. Abb. 57).
130
33,0 kDa
27,0 kDa
14,5 kDa

131
D. Ergebnisse
Unter der Einwirkung der verschiedenen Inhibitoren war keine Hemmung der
Tyrosinphosphorylierung festzustellen.

E. Diskussion
E. Diskussion
1. Erfassung der in der Volumenregulation etablierten Mechanismen
1.1. Signalübertragung bei der Volumenregulation von Spermien
Signalübertragungsmechanismen ermöglichen dem Spermium die Anpassung an die
sich vom Verlassen des Hodens bis zur Befruchtung der Eizelle in der Eileiterampulle
ständig verändernden Bedingungen seiner Umgebung. Spermatozoen reagieren
sehr schnell auf osmotische Veränderungen des extrazellulären Milieus. Die
Signalübertragung weist zell- und speziesspezifische Unterschiede auf, so dass
gewonnenes Wissen nicht ohne weiteres auf andere Tierarten übertragbar ist
(TARDIF et al. 2003).
Die Fähigkeit zur Regulation des Volumens entwickelt sich bei Spermien während
der Nebenhodenreifung (YEUNG et al. 2002). Einige Studien vermuten die
Involvierung von Ionenkanälen. Eine Beteiligung von K + -Kanälen wird diskutiert
(KULKARNI et al. 1997). Bei den Spermien von Schweinen und Bullen ist der
Einfluss schwellungsaktivierter Quinin-sensitiver K + -Kanäle auf die Volumenrückregulation
nachgewiesen worden, wobei auch vermutet worden ist, dass die
Spermatozoen des Ebers über weniger schwellungsaktivierte Chloridkanäle verfügen
im Vergleich zu denen des Bullen (PETROUNKINA et al. 1999, 2001a). Die
Beteiligung der Na + -/K + -Pumpe ist ebenfalls noch unklar. Hundespermien reagieren
auf Veränderungen der osmotischen Bedingungen mit Hilfe einer Ouabain-sensitiven
Na + -/K + -ATPase, während bei Eberspermien diese ausgeschlossen werden
(RODRIGUEZ-GIL et al. 1996). PÉREZ-LLANO et al. (2001) vermuten, dass bei
Eberspermien, die einem hypoosmotischen Milieu ausgesetzt sind, das schnelle
Anschwellen innerhalb von 30 Sekunden mit Hilfe von wassertransportierenden
Proteinkanälen zu erklären ist.
132

1.2. Phosphorylierungen bei der Signaltransduktion
133
E. Diskussion
Proteinphosphorylierung und -dephosphorylierung gehören zu den wichtigsten
Regulationsprozessen, über die die Zelle verfügt. Die Phosphorylierungsreaktionen
von Proteinen sind an der Regulation verschiedener Spermienfunktionen wie
Motilität, Erkennung der Zona pellucida beteiligt und gelten als ein Charakteristikum
des Kapazitationsvorganges (TARDIF et al. 2001). Kapazitation ist mit einem
PKA-abhängigen Anstieg der Proteinphosphorylierung verbunden. Beim Hamster
werden zwei Hauptproteine von 97 und 83 kDa phosphoryliert (JHA u. SHIVAJI
2002). Im Gegensatz dazu ist bei Spermien des Mannes eine doppelte
Phosphorylierung des Threonin-Glutamin-Tyrosin-Motives (P-Thr-Glu-Tyr-P) bei
Proteinen von 80 und 105 kDa während der Kapazitation beobachtet worden. An der
Regulation der Phosphorylierung sind Stickoxide sowie Proteinkinase C beteiligt,
cAMP und Proteinkinase A sind hingegen nicht involviert (THUNDATHIL et al. 2003).
Kapazitation porciner Spermatozoen induziert Tyrosinphosphorylierung von drei
Proteinen mit 27, 37 und 40 kDa (FLESCH et al. 1999). BERRUTI u. MARTEGANI
(1989) haben dagegen bei Eberspermien Tyrosinphosphorylierung dreier
Polypeptide im Westernblot nachgewiesen, p43, p40 und p36.
Beim Eber ist Tyrosinphosphorylierung eines Proteins mit dem Molekulargewicht von
34 kDa bei der Kapazitation gezeigt worden (FLESCH et al. 1999). Weiterhin haben
TARDIF et al. (2001) die Phosphorylierung eines über Tyrosinkinase-ähnliche
Aktivitäten verfügendes Protein mit Mr 32000 (p32) während der Kapazitation bei
Schweinespermien festgestellt. Vermutlich berichten beide Berichte über das gleiche
Protein. Es ist außerdem nachgewiesen worden, dass p32 nicht mit dem Zytoskelett
verbunden ist; es lässt sich leicht mit Triton extrahieren. Auch KALAB et al. (1998)
berichten von der Phosphorylierung eines 34 kDa-Proteins (p34), bei dem es sich
wahrscheinlich um das von FLESCH et al. (1999) und TARDIF et al. (2001) erwähnte
Protein handelt, daneben ist unter Kapazitationsbedingungen diese Modulation
zusätzlich bei p38, p40 und p44 und unter Zugabe von Reagenzien, die den cAMP-
Spiegel erhöhen, außerdem Tyrosinphosphorylierung von p93, p175 und p220/230
zu beobachten.

E. Diskussion
Aufgrund der durchgeführten Untersuchungen an porcinen Spermien konnte gezeigt
werden, dass Tyrosinphosphorylierungen auch in der osmotisch induzierten
Volumenregulation involviert sind. Phosphorylierte Proteine konnten im niedermolekularen
Bereich bei 33,0 kDa, 27,0 kDa und 14,5 kDa nachgewiesen werden. Es
ist anzunehmen, dass das 33,0 kDa-Protein das gleiche ist, das von KALAB et al.
(1998), FLESCH et al. (1999) und TARDIF et al. (2001) bei der Kapazitation
beschrieben worden ist. Das 33,0 kDa-Protein gibt somit den Hinweis, dass während
der Kapazitation und Volumenregulation Gemeinsamkeiten in der Signaltransduktionskette
vorliegen können.
1.3. Wirkungsmechanismen der Signalübertragung unter isoosmotischen
Bedingungen
Unter isoosmotischen Bedingungen war bei zunehmender Inkubationszeit ein
gleichbleibendes Volumen der Spermatozoen zu beobachten, ständige Regulationsprozesse
hielten das isoosmotische Spermienvolumen konstant. Unter dem Einfluss
von Inhibitoren wurden diese Volumenregulationsprozesse unterbrochen, das
resultierte in einer Volumenzunahme der Spermien. Aus den eine Wirkung
erzielenden Inhibitoren konnte auf die beteiligten Signalwege geschlossen werden.
Unter dem Einfluss der Proteinkinase-Inhibitoren war ein dosisabhängiger Volumenanstieg
der isoosmotischen Spermienvolumen zu beobachten. Besonders wirksam
war der Inhibitor der Proteinkinase C GF-109203X. Er zog zu beiden Messzeitpunkten
signifikante Volumenzunahmen nach sich, während Lavendustin A als
Hemmer der Tyrosinkinase geringere Effekte erzielte, und bei dem Inhibitor der
Proteinkinase A (H-89) erst in höheren Konzentrationen deutliche Volumenanstiege
auftraten. Daraus lässt sich folgern, dass in die Mechanismen der Volumenregulation
Proteinkinase C, in geringerer Wirkung Proteinkinase A und Tyrosinkinase etabliert
sein müssen. Vergleichbare Effekte der Volumenzunahme waren auch unter der
Einwirkung der Proteinphosphatase-Inhibitoren Okadainsäure und Calyculin A zu
erzielen, so dass zusätzlich von der Beteiligung der Proteinphosphatasen PP1 und
PP2A auszugehen ist. In Übereinstimmung mit den Mechanismen der Kapazitation,
134

135
E. Diskussion
mit der ein cAMP-abhängiger Anstieg der Tyrosinphosphorylierung verbunden ist
(FICARRO et al. 2003), scheint auch die Volumenregulation der Spermien
cAMP-abhängige Wege zu nutzen. Darauf lässt die Volumenzunahme unter der
Einwirkung von Forskolin, das Einfluss auf den IZ cAMP-Spiegel besitzt, schließen.
Aufgrund der isoosmotischen Volumenzunahme unter dem Einfluss von Tamoxifen,
einem Inhibitor von Chlorid-Kanälen, scheinen auch für diesen Inhibitoren sensitive
Chloridkanäle involviert zu sein. Da Quinidin durch die Hemmung von K + - und Na + -
Kanälen zu dem gleichen Resultat führt, könnten auch diese Ionenkanäle an der
Volumenregulation beteiligt sein. Bei der Regulation des isoosmotischen Volumens
werden auch noch andere Mechanismen vermutet, beispielsweise Steroidhormone,
Progesteron und Estradiol (HEBEL 2001).
Unter isoosmotischen Bedingungen war Fluoreszenz der Tyrosinphosphorylierung
bei der durchflusszytometerischen Untersuchung zu beobachten, die sich bei
zunehmender Inkubation signifikant verstärkte. In der SDS-Elektrophorese und
Immunoblotting wurden Tyrosinphosphorylierungen von Proteinen mit 33,0 kDa,
27,0 kDa und 14,5 kDa nachgewiesen. Die Zunahme der Tyrosinphosphorylierung
bei Erhöhung der Inkubationszeit bestätigte sich auch bei dieser
Untersuchungsmethode.
Mit Hilfe von Inhibitoren, die sich wirksam auf die Volumenregulation zeigten, gelang
sowohl im Durchflusszytometer eine Reduktion des Grades der Fluoreszenzintensität
als auch bei der elektrophoretischen Untersuchung. Die Hemmung der
Phosphorylierung der beschriebenen Proteinbanden bei 33,0 kDa, 27,0 kDa und
14,5 kDa unter isoosmotischen Bedingungen bestätigte die vermutete Involvierung
der entsprechenden Mechanismen in die Signalübertragung. Bei der durchflusszytometrischen
Analyse führten die Proteinkinase-Inhibitoren Stauroporin und als
Hemmer der Proteinkinase C GF-109203X v.a. nach zwanzigminütiger Inkubationszeit
zur Reduktion der Fluoreszenzintensität. Diese Wirkung des Stauroporins war
auch bei der SDS-Elektrophorese zu beobachten. Die gleichen Effekte erzielten die
Proteinphosphatase-Inhibitoren zu beiden Inkubationszeitpunkten. Unter gleichzeitiger
Beeinflussung der Spermien durch Okadainsäure und Papaverin nahm die
Fluoreszenzintensität ebenfalls auffällig ab. Die Wirkung von Okadainsäure

E. Diskussion
bestätigte sich in den Ergebnissen des Immunoblots. Die Inhibitoren der Cl - -Kanäle
Tamoxifen und Hydroxytamoxifen bewirkten nach fünf und zwanzig Minuten
Intensitätsabnahmen, die zum zweiten Messzeitpunkt Signifikanz aufwiesen. Unter
dem Einfluss von Hydroxytamoxifen zeigte sich die Reduktion der Tyrosinphosphorylierung
der Proteine des niedermolekularen Bereiches auch bei der SDS-
Elektrophorese und nachfolgendem Immunoblot. Die Hemmung der K + -Kanäle durch
Quinin zeigte die gleiche Wirkung.
1.4. Wirkungsmechanismen der Signalübertragung unter hypooosmotischen
Bedingungen
Unter hypoosmotischen Belastungen trat nach anfänglicher Volumensteigerung bei
Spermien eine regulative Volumenabnahme auf. Dieses Phänomen wird als
Regulatory Volume Decrease (RVD) bezeichnet und war in den Inhibitor-freien
Kontrollproben gut zu beobachten.
Unter der Einwirkung von Inhibitoren konnte Einfluss auf das hypoosmotische
Spermienvolumen und z.T. auf das RVD genommen werden. Als Inhibitoren der
Proteinphosphatasen PP2A und PP1 führten Ocadaic acid und Calyculin A zu einer
signifikanten Unterdrückung der regulativen Volumenreduktion. Proteinphosphatasen
PP1 und PP2A scheinen somit für das RVD eine besondere Bedeutung zu haben.
Auf die Bedeutung der Proteinphosphatasen in der Volumenregulation wiesen auch
die durchflusszytometrischen Untersuchungen hin, bei denen sowohl Calyculin A als
auch Okadainsäure (mit/ ohne Papaverin) zu beiden Messzeitpunkten zu statistisch
auffälligen Abnahmen der Fluoreszenzintensität führten. Neben den Proteinphosphatasen
sind vermutlich auch andere, beispielsweise cAMP-abhängige
Mechanismen beteiligt, da sich Forskolin günstig auf die Volumenregulation auswirkt.
Wahrscheinlich handelt es sich um cAMP-abhängige Chloridkanäle. Wie unter
isoosmotischen Bedingungen scheinen auch unter hypoosmotischen Belastungen
Tamoxifen- und Dedoxy-Forskolin/ Forskolin-sensitive Chloridkanäle eine Rolle zu
spielen. Darauf lässt die Wirkung der Inhibitoren der Cl - -Kanäle, Tamoxifen und
Hydroxytamoxifen schließen: Bei geringeren Konzentrationen ist das RVD statistisch
136

137
E. Diskussion
auffällig gehemmt, hohe Konzentrationen bewirken eine Verbesserung des RVD.
Auch bei der durchflusszytometrischen Untersuchung erzielten die Ionenkanalblocker
Tamoxifen und Hydroxytamoxifen Effekte, es waren zu beiden Messzeitpunkten
statistisch auffällige Fluoreszenzintensitätsabnahmen nachzuweisen.
Unter der Einwirkung von Proteinkinase-Inhibitoren verbesserte sich die regulative
Volumenreduktion, v.a. GF-109203X wirkte sich positiv auf die Rückregulation aus.
Proteinkinasen scheinen somit einige Signalübertragungswege der Volumenregulation
unter hypoosmotischen Bedingungen negativ zu beeinflussen, indem sie
entweder Kanäle inaktivieren oder am RVD beteiligte Proteinphosphatasen hemmen.
Während bei der Kapazitation immer noch unklar ist, ob der durch die PKA
vermittelte Anstieg der Proteintyrosinphosphorylierung auf einer (in)direkten
Stimulation der PTKase oder Hemmung der PTPase beruht (VISCONTI et al. 1998,
2002), wird Tyrosinphosphorylierung im Laufe der hypoosmotischen Regulation eher
durch Deaktivierung der Tyrosinphosphatase vermittelt als durch Tyrosinkinaseaktivierung.
Die unter Quinidin als Inhibitor von K + - und Na + - Kanälen aufgetretene signifikante
Volumenzunahme nach fünfminütiger und das unter hohen Konzentrationen
gehemmte RVD nach zwanzigminütiger Inkubation lässt unter hypoosmotischen
Belastungen der Spermien auf eine Beteiligung von Quinidin-sensitiven
Ionenkanälen schließen. Bei Eberspermien ist auch die Beteiligung von Quininempfindlichen
Kanälen (K + -Transport) am RVD nachgewiesen worden
(PETROUNKINA et al. 2001 a), deren Involvierung auch während der Kapazitation
festgestellt werden konnte (HEBEL 2001).
Unter hypoosmotischen Belastungen fand ebenfalls eine Tyrosinphosphorylierung
der Proteinbanden bei 33,0 kDa, 27,0 kDa und 14,5 kDa statt. Unter Zugabe von
Inhibitoren mit Wirkung auf die Volumenregulation war eine teilweise Hemmung der
Tyrosinphosphorylierung dieser Proteine zu beobachten. Die Effekte traten
besonders deutlich unter dem Einfluss von Okadainsäure (und gleichzeitiger
Stimulation durch Papaverin) bei den Proteinen von 27,0 kDa und 14,5 kDa auf. Die
Dephosphorylierung durch die Proteinphosphatasen PP1 und PP2A scheint für das
RVD essentiell zu sein. Auch ein Inhibitor von Cl - -Kanälen, Tamoxifen, führte zu

E. Diskussion
einer deutlichen Reduktion der Phosphorylierungsreaktionen im niedermolekularen
Bereich bei Proteinen von 27,0 kDa und 14,5 kDa, das weist ebenfalls auf eine
Beteiligung von Tamoxifen-sensitiven Kanälen an den Signalübertragungsmechanismen
hin.
1.5. Wirkungsmechanismen der Signalübertragung unter hyperosmotischen
Bedingungen
Wurden Spermatozoen hyperosmotischen Belastungen ausgesetzt, reagierten die
Spermien nach anfänglicher Schrumpfung mit einer regulativen Volumenzunahme,
die als Regulatory Volume Increase (RVI) bezeichnet wird.
Hemmstoffe der Volumenregulation nehmen unter hyperosmotischen Bedingungen
kaum signifikanten Einfluss auf die Volumen der Spermien und die Phosphorylierung.
Das kann als Hinweis interpretiert werden, dass andere Signaltransduktionswege für
den Transport anderer Ionen unter diesen Umständen entscheidend sein können.
Vor allem der Transport von Natriumionen ist anzunehmen, da mit Hilfe der
NaCl-Lösung die Osmolarität des Mediums eingestellt worden ist und sie verstärkt in
der hyperosmotischen Lösung vorkommen. Der konzentrationsabhängige Volumenanstieg
und das nach zwanzig Minuten ausbleibende RVI durch Quinidin, einem
Inhibitor von K + - und Na + -Kanälen, weist ebenfalls auf die Bedeutung der Na + -Ionen
hin. Die Involvierung der Na + -Ionen wäre somit ein weiterer wichtiger, noch zu
untersuchender Aspekt, der v.a. bezüglich der Volumenregulation unter hyperosmotischen
Bedingungen interessant wäre.
Auch unter hyperosmotischen Bedingungen sind im niedermolekularen
Proteinbereich (33,0 kDa, 27,0 kDa, 14,5 kDa) Tyrosinphosphorylierungen zu
beobachten, doch bei Erhöhung der Inkubationszeit findet zunehmend eine
Dephosphorylierung der genannten Proteine statt, die sich auch im Durchflusszytometer
als signifikante Abnahme der Fluoreszenzintensität zeigte. Nur unter dem
Einfluss von Hydroxytamoxifen konnte eine statistisch auffällige Reduktion der
Fluoreszenzintensität im Durchflusszytometer beobachtet werden.
138

139
E. Diskussion
2. Entwicklung eines Modells der Signalübertragungsmechanismen bei der
Osmoregulation unter verschiedenen osmotischen Bedingungen unter
Einbeziehung der Phosphorylierung
Die zuvor diskutierten Ergebnisse lassen sich zu einem Arbeitsmodell
zusammenfassen.
EZ
IZ
K +
PP2A
Cl -
Dedoxy-
Forskolininsensitiv
AMP
Abb. 60: Schematische Darstellung der Arbeitshypothese zur Signaltransduktion bei
der Osmoregulation porciner Spermatozoen unter Einbeziehung der
Ionenkanäle, Teil A (PP: Phosphatase, Erläuterungen im Text)
Durch den Zusatz von Kanalblockern kann bei Eberspermien der Chloridstrom um
60-80% gesenkt werden. Das ist als Hinweis auf das Vorkommen entsprechender
Kanäle zu werten (FORSTREUTER 1997). MORALES et al. (1993) haben bei
Spermien des Seeigels das Vorkommen von Ionenkanälen gezeigt, die für den
Transport von Cl - -Ionen zuständig sind.
K +
Cl -
Dedoxy-
Forsklinsensitiv
PP1
Cl -
Tamoxifensensitiv

E. Diskussion
Aus den diskutierten Versuchsergebnissen ist zu schließen, dass an der
Volumenregulation verschiedene Arten von Tamoxifen- und Dedoxy-Forskolinsensitiven
Mechanismen beteiligt sind, bei denen es sich wahrscheinlich ebenfalls
um Chloridkanäle handelt, doch auch das Vorkommen von Kaliumkanälen wäre
möglich. In die Regulation der Dedoxy-Forskolin-empfindlichen Kanäle ist vermutlich
PP1 involviert, dieser Signalweg scheint nicht direkt auf cAMP angewiesen zu sein.
Zusätzlich ist das Vorhandensein Dedoxy-Forskolin-unempfindlicher Cl - - und
K + -Kanäle nicht auszuschließen. Dieser Regulationsmechanismus könnte von cAMPabhängiger
PP2A beeinflusst zu werden oder direkt durch Forskolin-bedingte cAMP-
Aktivierung stimuliert werden (s. Abb. 60). Innerhalb dieser Versuche war keine
genaue Identifizierung der Chlorid- und Kaliumkanäle vorgenommen worden.
Bei anderen Zelltypen sind verschiedene, an der Volumenregulation beteiligte
Ionentransportmechanismen nachgewiesen worden, bei Kardiomyozyten neugeborener
Ratten sind K + -und Cl - -Kanäle, K + -Cl - -Cotransporter und Na + -K + -Cl - -
Cotransporter involviert (TAQUIL u. HANNAERT 1999).
SATO et al. (2000) haben bei der Membran von Mäusespermien die elementare
Rolle eines Glyzin Rezeptor/ Cl - -Kanals im Rahmen der zonainitiierten Akrosomreaktion
mit Hilfe von Mutanten des Rezeptors herausgefunden.
Diese verschiedenen Transportsysteme für Cl - -Ionen zeigen, dass es wünschenswert
wäre, die genauen Mechanismen des Cl - -Transportes bei Eberspermien zu
analysieren.
Die vermutete Involvierung von K + -Kanälen (KULKARNI et al. 1997) wäre auch in der
Volumenregulation der Eberspermien zu klären, da die Effekte von Quinidin und
Quinin auf eine eventuelle Beteiligung dieser Ionenkanäle hinweisen. Als Regulator
des intrazellulären Kaliumionengehaltes wird v.a. eine Na + -/K + -ATPase im Rahmen
der Kapazitation diskutiert (FRASER 1995), ihre Rolle in der Volumenregulation ist
nicht auszuschließen und bedarf der Klärung.
Der in der elektrophoretischen Auftrennung und anschließendem Immunoblot sowie
der Durchflusszytometrie erfolgte Nachweis der Tyrosinphosphorylierung und die
beschriebenen Einflüsse der Inhibitoren mit Wirkung auf die Volumenregulationsmechanismen
auf die Phosphorylierungsreaktionen führen zu der
140

141
E. Diskussion
Annahme, dass die In-/ Aktivierung der beschriebenen Ionenkanäle von
Phosphorylierungs- und Dephosphorylierungsreaktionen gesteuert wird. Die nachfolgende
Abb. 61 verdeutlicht diesen zweiten Teil der Arbeitshypothese.
aktivierte
Kanäle
PP
PKC
aktivierte
Phosphatase
inaktivierte
Phosphatase
inaktivierte
Kanäle
TK, PKA
Abb. 61: Schematische Darstellung der Arbeitshypothese zur Signaltransduktion bei
der Osmoregulation porciner Spermatozoen unter Einbeziehung der De-/
Phosphorylierungsreaktionen, Teil B (PP: Phosphatase, PKA: Proteinkinase
A, PKC: Proteinkinase C, TK: Tyrosinkinase, Erläuterungen im Text)
Es wird nach diesem Teil B des Modells angenommen, dass die Proteinphosphatasen
PP2A und PP1 ein oder mehrere Transportkanäle aktivieren, da ihre
Hemmung zum Verlust des RVD führt. Eventuell könnte es sich dabei um die
beschriebenen K + - oder Cl - -Kanäle handeln. Bei der Aktivierung der Kanäle durch die
PP2A-bedingte Dephosphorylierung scheint eine cAMP-Abhängigkeit vorzuliegen, da
die Zugabe von Papaverin diesen Prozess beeinflusst.
P

E. Diskussion
Da die Hemmung der Proteinkinase C (PKC) zu einem verstärkten Grad des RVD
führt, lässt sich annehmen, dass durch die Hemmung die Kanäle länger geöffnet
sind. Deshalb scheint PKC in dieses System involviert zu sein, wahrscheinlich
schließt sie die durch Proteinphosphatasen aktivierten Kanäle. Die Einschränkung
der Volumenregulation könnte auf die Inaktivierung der Proteinphosphatasen durch
Tyrosinkinase (TK) und Proteinkinase A (PKA) zurückzuführen sein. Diese Annahme
wird durch die Beobachtung bestätigt, dass unter der Hemmung der Kinasen, eine
Tendenz zur Beschleunigung des RVD zu beobachten ist. Die Aktivität von PKA wird
durch cAMP reguliert, das von der Adenylatcyclase und Phosphodiesterasen
beeinflusst wird (URNER u. SAKKAS 2003), ob diese Wechselwirkungen genauso
bei der Volumenregulation vorliegen, wäre zu prüfen.
Unter Kapazitationsbedingungen resultiert ein Anstieg des intrazellularen
Ca 2+ -Gehaltes in einer Zunahme der Proteintyrosinphosphorylierung (DORVAL et al.
2002). Der Einfluss von Ca 2+ -Ionen wäre somit auch hinsichtlich der Signaltransduktion
während der Volumenregulation unter verschiedenen osmotischen
Bedingungen interessant. DORVAL et al. (2003) haben bei kapazitierten Spermien
des Mannes den Zusammenhang dieser zwei Ereignisse unter dem Einfluss von
Thapsigargin untersucht. Es sind dabei zwei Populationen entdeckt worden: Die eine
weist eine hohe Empfindlichkeit auf, die Ca 2+ -Konzentration ist höher, eine stärkere
Proteinphosphorylierung ist zu beobachten, es kommen mehr Akrosomreaktionen
vor. Diese Population ist als LR (low responsive) bezeichnet worden und von der
zweiten Population mit niedriger Ansprechbarkeit unterschieden worden. Unter der
Einwirkung eines Tyrosinkinase-Inhibitors wird die Thapsigargin-induzierte Zunahme
der Proteintyrosinphosphorylierung verhindert, doch sowohl die intrazelluläre
Ca 2+ -Konzentration als auch die akrosomreagierten Spermien bleiben davon
unbeeinflußt.
Während der epididymalen Reifung der Spermien spielen Kalzium und HCO3 - bei der
Modulation der Tyrosinphosphorylierung eine wichtige Rolle. Unter Abwesenheit von
Ca 2+ -Ionen im Versuchsmedium zeigen sowohl Spermatozoen des Nebenhodenkopfes
als auch des -schwanzes eine Tyrosinphosphorylierung im Bereich der Geißel
als Antwort auf zugefügtes cAMP. In Gegenwart von Ca 2+ -Ionen im umgebenden
142

143
E. Diskussion
Medium ist dagegen nur bei Spermien aus dem Nebenhodenschwanz beim Anstieg
der extrazellulären cAMP-Konzentration eine Tyrosinphosphorylierung zu beobachten
(BAKER et al. 2003).
TARDIF et al. (2003) haben gezeigt, dass Ca 2+ -Ionen für die Tyrosinphosphorylierung
von p32 während der Kapazitation von elementarer Bedeutung ist. Da
das in diesen Studien verwendete HBS-Medium kein Ca 2+ zur Verfügung stellt, ist
anzunehmen, dass die Regulationsmechanismen der Tyrosinphosphorylierung bei
osmotisch stimulierten Eberspermien sich von denen während der Kapazitation
unterscheiden. Der externe Ca 2+ -Gehalt scheint für das RVD nicht notwendig zu sein.
Die Rolle intrazellulärer Ca 2+ -Lager ist damit aber nicht ausgeschlossen und sollte in
weiterführenden Studien untersucht werden. Da es sein könnte, dass extrazelluläres
Ca 2+ die Regulation verstärkt, wäre auch dieses noch zu prüfen. Die Rolle von
Bikarbonat und Ca 2+ ist im Rahmen der Regulationsvorgänge der Kapazitationsprozesse
schwer zu trennen und möglicherweise besteht ein Zusammenhang
zwischen ihnen (TARDIF et al. 2003). Dieser Zusammenhang wäre ein weiterer
interessanter Aspekt, der zudem in Bezug auf die involvierten Mechanismen der
osmotisch stimulierten Volumenregulation zu beleuchten wäre.
3. Anwendbarkeit der durchflusszytometrischen Untersuchung für Tyrosin-
phosphorylierung
Die simultane Anwendbarkeit verschiedener Fluoreszenzfarbstoffe im Durchflusszytometer,
wie sie auch von anderen Autoren belegt worden ist (z.B. MAXWELL u.
JOHNSON 1997, PENA et al. 1999), ist ausgenutzt worden. Ein weiterer großer
Vorteil ist, dass nur partikel-assoziierte Fluoreszenz von dem Gerät registriert wird,
so dass das Waschen der Spermien zum Entfernen freier Fluoreszenz entfällt. Auf
diese Weise wird die Vorgehensweise vereinfacht.
Das Durchflusszytometer ist geeignet, Veränderungen der Spermienpopulationen zu
erfassen (HARKEMA et al. 1998, PETROUNKINA et al. 2000 b). Diese Feststellung

E. Diskussion
konnte im Rahmen dieser Studien hinsichtlich der durchflusszytometrischen Analyse
der Tyrosinphosphorylierung bestätigt werden.
Das Zufügen der Inhibitorlösung soll zu einer Blockierung der Reaktion der Zellen
führen. Das enthaltene Vanadate hemmt die Tyrosinphosphatase und verhindert die
Reduktion des Grades der bis dahin tyrosinphosphorylierten Proteine. Da keine
Proteinkinasen gehemmt werden, kann die Tyrosinphosphorylierung bis zur Messung
noch ansteigen. Dieser Aspekt scheint vernachlässigbar zu sein, da zum einen nur
ein kurzer Zeitraum vergeht, bis die Messung durchgeführt wird, zum anderen
werden alle Proben gleich behandelt, so dass diese eventuell weiterlaufende
Tyrosinphosphorylierung bei allen Messungen auftritt. Die Durchführung der
durchflusszytometrischen Erfassung der Tyrosinphosphorylierung könnte optimiert
werden, indem der Inhibitorlösung zusätzlich ein Tyrosinkinase-Inhibitor zugefügt
wird, so dass eine sich fortsetzende Tyrosinphosphorylierung unterbunden wird.
Dieses Vorgehen wäre bei Untersuchungen unter Kapazitationsbedingungen, bei
denen eine vermehrte Tyrosinphosphorylierung stattfindet, ratsam. Eine zweite
Möglichkeit wäre, auf den Einsatz der Inhibitorlösung zu verzichten und statt dessen
die Proben nach Ablauf der Inkubationszeit sofort zu analysieren, da bei der kurzen,
einheitlich definierten Messdauer davon auszugehen ist, dass in diesem Zeitraum
keine gravierenden Veränderungen auftreten.
Die Analysen sind an lebenden, nicht permeabilisierten Zellen vorgenommen
worden. Daher muss die Tyrosinphosphorylierung an der Spermienoberfläche
stattfinden, oder der eingesetzte Antikörper ist membrangängig. In dem vorliegenden
Fall ist davon auszugehen, dass der Antikörper die Membran passieren kann. Es hat
nachgewiesen werden können, dass sein Signal spezifisch ist. Da die Spermatozoen
nicht speziell permeabilisiert worden sind, besteht die theoretische Möglichkeit, dass
das Signal nicht vollständig erfasst wird, wenn es im Zellinneren abläuft. Bei
Versuchen mit nicht kapazitierten Spermatozoen scheint dieses aber vernachlässigbar
zu sein, weil die PI-positiven und somit toten Spermien, deren Membran
permeabel ist, keine zusätzliche Fluoreszenz aufweisen. In den Graphiken des
Durchflusszytometers befinden sich die Populationen der lebenden und toten Zellen
stets übereinander, es wird keine Rechtsverschiebung der toten Spermatozoen
144

145
E. Diskussion
beobachtet. Bei Untersuchungen der Tyrosinphosphorylierung unter Kapazitationsbedingungen
sollte über eine Permeabilisierung der Membran nachgedacht werden.
YEUNG u. COOPER (2001) haben bei Untersuchungen der Volumen humaner
Spermien herausgefunden, dass das Durchflusszytometer eine geeignete und
sensitive Methode zur Messung von Spermienvolumen darstellt. Bei Versuchen an
Mäusespermien ist die Anwendbarkeit des Durchflusszytometers für Volumenanalysen
bestätigt worden (YEUNG et al. 2002b). Es wäre zu überprüfen, ob die
durchflusszytometrische Volumenerfassung bei porcinen Spermien anwendbar ist,
da dann eine weitere Vereinfachung des Verfahrens möglich wäre. Parallel könnten
die Tyrosinphosphorylierung, die Membranintegrität und die Volumenveränderung an
nur einer einzigen Probe im Durchflusszytometer analysiert werden. Das wäre von
großem Vorteil, da viel Zeit und Kosten aufgrund des Wegfallens der relativ großen
Probenvolumen, die bei Untersuchungen der Spermienvolumen mit dem elektrischen
Partikelzähler nötig sind, gespart werden könnten.
Die durchflusszytometrische Analyse der Tyrosinphosphorylierung erfüllt alle
Anforderungen einer modernen spermatologischen Untersuchungsmethode: Der
Einsatz in der Routinediagnostik ist möglich, das Verfahren ist preiswert,
verschiedene Parameter können in einer Probe bei geringem Zeitaufwand analysiert
werden. Auf zellbiologischer Ebene ist die Erfassung großer, repräsentativer
Zellzahlen möglich. Eine Differenzierung verschiedener Zellpopulationen, die
unterschiedliche physiologische Eigenschaften aufweisen, innerhalb eines Ejakulates
kann erfolgen.
HORTAS et al. (2001) haben über einen D-Mannose-Rezeptor die Tyrosinphosphorylierung
und den Effekt von Calyculin A (Proteinphosphatase-Inhibitor) im
Durchflusszytometer an humanen Spermatozoen studiert. Sie haben herausgefunden,
dass signifikante Unterschiede zwischen den Spermien von Männern mit
ungeklärter Infertilität zu denen fertiler Männer bestehen. Sie gehen daher davon
aus, dass die Behandlung von Spermien mit PP-Inhibitoren von großem Wert in der
Diagnosik ungeklärter Infertilität sein könnte. Es wäre interessant, ob diese
Beobachtung auch bei Ebern zutrifft und mit Hilfe des in diesen Untersuchungen

E. Diskussion
angewendeten Verfahrens festzustellen ist. Die Methode könnte helfen, die
Fertilitätsdiagnose zu verfeinern und zu objektivieren.
4. Zusammenfassende Abschlussbetrachtung
Im Rahmen dieser Studie konnte erstmals am Modell von Eberspermien eine noch
unvollständige Arbeitshypothese zur Osmoregulation aufgestellt werden. Dies leistet
einen Beitrag zur Klärung der in der Volumenregulation involvierten Mechanismen
der transmembranen und intrazellulären Signalübertragung porciner Spermien. Da
es sich bei dieser Arbeitshypothese um ein Denkgerüst handelt, sind Details des
Modells in weiterführenden Untersuchungen herauszuarbeiten. Es wäre interessant
zu überprüfen, welche weiteren Mechanismen (z.B. Ca 2+ ) involviert sind, und wie sich
die Volumenregulationsmechanismen während der Kapazitation verhalten. Da aus
In-vitro-Versuchen gewonnene Erkenntnisse nicht ohne weiteres auf die In-vivo-
Situation übertragen werden können, müsste die Übereinstimmung der
Mechanismen auch in vivo überprüft werden.
146

F. Zusammenfassung
147
F. Zusammenfassung
Eyke Christina Jebe:
Charakterisierung der Signaltransduktionsmechanismen bei osmotisch
induzierter Volumenregulation von Spermatozoen am Ebermodell
Mit der vorliegenden Arbeit wurde das Ziel verfolgt, die an der Volumenregulation der
Spermatozoen involvierten Signalübertragungsmechanismen und eine Beteiligung
von Tyrosinphosphorylierungen näher zu untersuchen und damit einen Beitrag zum
Verständnis der Zellphysiologie zu leisten.
Im Rahmen der Studien wurden an den in Beltsville Thawing Solution (BTS)
verdünnten Ejakulaten vier verschiedener institutseigener Eber die Volumenveränderungen
mit Hilfe eines auf dem Widerstandsprinzip beruhenden elektrischen
Partikelzählers gemessen. Dabei wurde der Einfluss von Proteinphosphatase- und
Proteinkinase-Inhibitoren und verschiedenen Stoffen, die den intrazellulären cAMP-
Spiegel beeinflussen, sowie Inhibitoren der Chloridkanäle unter verschiedenen
osmotischen Belastungen getestet. Die Effekte dieser Inhibitoren auf die
Tyrosinphosphorylierung wurden unter iso-, hypo- und hyperosmotischen
Bedingungen untersucht. Nach der Auftrennung der Proteine mittels eindimensionaler
SDS-Polyarylamid-Gelelektrophorese wurden die Muster der tyrosinphosphorylierten
Proteine im Immunoblot analysiert. Eine Quantifizierung der
Tyrosinphosphorylierungsintensität erfolgte im Durchflusszytometer.
Folgende Ergebnisse ergaben sich:
1. Proteinkinase C, in geringerem Umfang Proteinkinase A und Tyrosinkinase
sind in die Volumenregulation in isoosmotischer Umgebung involviert. Einige
cAMP-abhängigen Mechanismen wie die Aktivität der Proteinphosphatasen
PP2A und PP1 scheinen ebenfalls beteiligt zu sein. Die Einbeziehung von

F. Zusammenfassung
Tamoxifenworden.
und Forskolin-sensitiven Chloridkanälen ist nachgewiesen
2. Unter hypoosmotischen Belastungen scheint die durch PP2A und PP1
vermittelte Dephosphorylierung essentiell für das RVD (regulative
Volumenabnahme) zu sein. Eine cAMP-Abhängigkeit von Chloridkanälen oder
PP2A- und PP1- abhängigen Mechanismen kommt vor. Wie unter
isoosmotischen sind auch unter hypoosmotischen Bedingungen Tamoxifenund
Forskolin-sensitive Chloridkanäle in die Volumenregulation involviert.
Proteinkinasen deaktivieren vermutlich die Volumenregulation, indem sie
Kanäle inaktivieren oder am RVD beteiligte Proteinphosphatasen hemmen.
3. Der ausbleibende Effekt der Inhibitoren auf das hyperosmotische Volumen
lässt darauf schließen, dass der Transport anderer Ionen unter diesen
Bedingungen eine Rolle spielt. Der im Vergleich zu dem iso- und
hypoosmotischen Medium erhöhte Natriumgehalt deutet auf die Bedeutung
dieser Ionen hin.
4. Bei der Volumenregulation finden Tyrosinphosphorylierungen von Proteinen
im niedermolekularen Bereich statt. Proteine des Molekulargewichtes
14,5 kDa, 27,0 kDa und 33,0 kDa werden phosphoryliert.
5. Unter isoosmotischen und hypoosmotischen Bedingungen wird bei
verlängerter Inkubation von 20 Minuten eine zunehmende Tyrosinphosphorylierung
der genannten Proteine beobachtet, unter hyperosmotischen
Belastungen führt dies zu einer vermehrten Dephosphorylierung.
6. Sowohl im isoosmotischen als auch im hypoosmotischen Versuchsmedium
gelingt die Hemmung der Tyrosinphosphorylierung mit einigen der Inhibitoren,
die die Volumenregulation beeinflussen. Im Gegensatz dazu treten diese
Effekte nicht unter hyperosmotischen Bedingungen auf.
148

149
F. Zusammenfassung
Aus diesen aufgeführten Ergebnissen konnte eine Arbeitshypothese der an der
Volumenregulation beteiligten Signaltransduktionsmechanismen bei porcinen
Spermatozoen erstellt werden: An der Volumenregulation sind verschiedene Arten
von Tamoxifen- und Dedoxy-Forskolin/ Forskolin–sensitiven Chlorid- und Kaliumkanälen
beteiligt. Proteinphosphatasen PP1 und PP2A aktivieren die Transportkanäle.
Die PP2A-bedingte Dephosphorylierung scheint cAMP-abhängig zu sein.
Tyrosinkinase und Proteinkinase A inaktivieren wahrscheinlich die Proteinphosphatasen
und ziehen eine Einschränkung der Volumenregulation nach sich. Den
„Gegenspieler“ zu den Phosphatasen stellt eventuell Proteinkinase C dar. Man geht
davon aus, dass PKC vermutlich die durch die Dephosphorylierung aktivierten
Kanäle schließt.
Erstmalig gelang es, ein Modell für die an der Osmoregulation bei Eberspemien
beteiligten Mechanismen aufzustellen, das eine Grundlage für die Klärung weiterer
Details in weiterführenden, zielgerichteten Untersuchungen bietet.

G. Summary
G. Summary
Eyke Christina Jebe:
Characterization of mechanisms of the signaltransduction in osmotic induced
volume regulation in spermatozoa in the model of the boar
The signaling mechanisms and the possible involvement of the tyrosine
phosphorylation in volume regulation were investigated. This study was a
contribution to sperm cell physiology.
Beltsville Thawing Solution (BTS) diluted ejaculates of four different boars were
examined in this study. The volume changes were measured with a computercontrolled
cell analyzer (based on electrical resistance measurement) under different
osmotic conditions. Moreover, the influence of different inhibitors of protein
phosphatases, protein kinases, Cl - channels and the cAMP-dependency was tested.
The effect of these inhibitors on the tyrosine phosphorylation was investigated in
iso-, hypo- and hypertonic saline solutions. Tyrosine phosporylation pattern were
analyzed by 1-dimensional polyacrylamid-gelelectrophorese and immunoblotting.
The phosphorylation rates were determinated by flow cytometer.
The following results were obtained:
1. Protein kinase C, and to a smaller extent protein kinase A and tyrosine kinase
are involved in volume regulation under isoosmotic conditions. Further
dephosphorylation by protein phosphatases PP2A and PP1 seems to
participate in volume regulation. Additionally to protein phosphatase activated
mechanisms, cAMP-dependent signaling appears to be involved in volume
regulation.The involvement of Tamoxifen- und Forskolin-sensitive Cl - channels
has been demonstrated.
150

151
G. Summary
2. Under hypoosmotic stress PP2A and PP1 dependent channels are involved.
Dephosphorylation mediated by PP2A and PP1 seems to be essential for
regulative volume decrease (RVD). cAMP-dependent signaling seems to
count for regulation occuring after blocking PP-dependent mechanisms and
possibly Cl - channels. Tamoxifen and Forskolin-sensitive Cl - channels are
involved in volume regulation under hypoosmotic conditions, too. Protein
kinases may deactivate volume regulation mechanisms by closing channels or
by inhibiting protein phosphatases involved in RVD.
3. The missing effect of the inhibitors on mechanisms of volume regulation under
hyperosmotic conditions points to the pivotal role of other transport
mechanisms and ions, especially Na + ions. Thus, sodium transport can be
essential for regulation under hypertonic stress.
4. Specific tyrosine phosphorylation sensitive to volume regulation was observed
in proteins of 14,5 kDa, 27,0 kDa und 33,0 kDa.
5. Under isoosmotic and hypoosmotic conditions an incubation of 20 minutes
leads to an increasing tyrosine phosphorylation while under hyperosmotic
conditions dephosphorylation takes place.
6. The inhibitors effecting volume regulation inhibit tyrosine phosphorylation in
either isoosmotic and hypoosmotic medium. In contrast, these effects do not
occur under hyperosmotic conditions.
A hypothesis about signal transduction mechanisms of volume regulation in boar
sperms was developed on the basis of these results: Different Tamoxifen- and
Dedoxy-Forskolin/ Forsklin-sensitive Cl - and K + channels are involved in volume
regulation. Protein phosphatases PP1 and PP2A may activate these transport
channels. Activation of volume-regulatory mechanisms seems to be dependent on
cAMP (by control of PP2A/PP1-dependent or other mechanisms). Tyrosine kinase

G. Summary
and protein kinase A could inactivate protein phosphatases and lead to a restriction
of volume regulation. Protein kinase C probably closes the channels activated by
dephosphorylation.
Here the first time a hypothesis about volume-regulatory mechanisms in mammalian
sperms has been presented rendering the basis for extendered investigations.
152

H. Literaturverzeichnis
153
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176

J. Anhang
1. Rezepturverzeichnis
177
J. Anhang
Alle Chemikalien stammen, soweit nichts anderes angegeben ist, von Sigma-Aldrich
Chemie GmbH, Steinheim.
1. Medien
1.1. BTS ( Beltsville Thawing Solution)
Glukose 204,9 mMol 37,0 g
Natriumzitrat 20,4 mMol 6,0 g
Natriumbikarbonat 15,5 mMol 1,3 g
EDTA 3,5 mMol 1,3 g
Kaliumchlorid 10,7 mMol 0,8 g
A. dest. 1000 ml
pH=7,2 (einstellen mit NaOH/ HCl)
Osmolarität 300 ± 5 mosm/kg
1.2. Waschmedium Percoll (Amersham Biosciences AB, Schweden)
a. 10fach salines Hepes-Medium
NaCl 8,00 g
Hepes 4,77 g
Glukose 1,80 g
KOH 1M 2,50 ml
A.dest. 100,00 ml
pH= 7,6 (einstellen mit NaOH/ HCl)

J. Anhang
b. Lösung M
10fach salines Hepes-Medium 10,80 g
A. dest. 100,00 ml
pH= 7,4 (einstellen mit NaOH/ HCl)
Osmolarität m ~ 295 mosm/kg
c. Lösung 1+ 9 P
10fach salines Hepes-Medium 5,40 g
Percoll, unverdünnt 50,90 g
A. dest. 100,00 ml
pH= 7,4 (einstellen mit NaOH/ HCl)
Osmolarität dp ~ 350 mosm/kg
d. Percoll, unverdünnt
Osmolarität p ~ 15 mosm/kg
Rechnung: Oa = (10m + 9p)
R = Oa ( 0,1 x dp) / 0,9 x dp (~ 0,85)
Vp = 10m – 295 / R (295 – p) (~ 11)
e. 100%iges Percoll
Lösung 1 + 9 P
Percoll, unverdünnt [(Vp – 9) x 1,130 x 5] g
Osmolarität ~ 295 mosm/kg
178

f. 70%iges Percoll
1
/2 100%iges Percoll = V
Lösung M ad V x 100 / 70
Gentamycin (70%iges Percoll / 500) ml
g. 35%iges Percoll
1
/2 100%iges Percoll = V
Lösung M ad V x 100 / 35
Gentamycin (35%iges Percoll / 500) ml
1.3. HBS (Hepes gepuffertes salines Medium) isoosmotisch
NaCl 137,0 mMol 27,4 ml 0,5 M NaCl
Glukose 10,0 mMol 1,80 g
Hepes 20,0 mMol 4,77 g
KOH 2,5 mMol 2,50 ml 1,0 M KOH
A. dest. 1000 ml
pH=7,5 (einstellen mit NaOH)
Osmolarität 300 ± 5 mosm/kg
1.4. HBS (Hepes gepuffertes salines Medium) hypoosmotisch
179
J. Anhang
Die Zusammensetzung entspricht der isotonen HBS-Lösung, die Osmolarität wird
durch die Veränderung des NaCl-Gehaltes variiert. Von einer NaCl-Lösung 5,30 g/
300 ml wurden 27,4 ml eingesetzt.
pH=7,5 (einstellen mit NaOH)
Osmolarität 180 ± 5 mosm/kg

J. Anhang
1.5. HBS (Hepes gepuffertes salines Medium) hyperosmotisch
Die Zusammensetzung entspricht der isotonen HBS-Lösung, die Osmolarität wird
durch die Veränderung des NaCl-Gehaltes variiert. Von einer NaCl-Lösung 13,20 g/
300 ml wurden 27,4 ml eingesetzt.
pH=7,5 (einstellen mit NaOH)
Osmolarität 450 ± 5 mosm/kg
1.6. Inhibitor-Lösung I
NaF 200 mM 7,50 ml
Hepes 200 mM 0,75 ml
EDTA 200 mM 0,75 ml
PPi 100 mM 1,50 ml
NaCl 500 mM 0,30 ml
A. dest. 2,37 ml
Vanadate 20 mM 1,50 ml
AEBSF 200 mM 150 µl
pAB 200 mM 150 µl
E64 10 mM 30 µl
Die Stammlösungen werden alle mit DMSO hergestellt und in mit Silica-Gel gefüllten
Plastiktüten bei –20°C eingefroren. Ausnahme bilden E64, das in A. dest. gelöst wird
und Vanadate, das am Tag des Versuches frisch mit A. dest. angesetzt wird.
Die Inhibitor-Lösung wird stets erst am Tag des Versuches angefertigt, AEBSF, pAB
und E64 werden erst eine halbe Stunde vor Gebrauch der Inhibitor-Lösung
zugesetzt.
Die Inhibitor-Lösung I dient der Blockierung der Reaktion in isoosmotischen und
hypoosmotischen Medien.
180

1.6. Inhibitor-Lösung II
181
J. Anhang
Die Inhibitor-Lösung II dient der Blockierung der Reaktion in hyperosmotischen
Medien.
Die Herstellung der Inhibitor-Lösung II entspricht daher der Anfertigung der Inhibitor-
Lösung I, außer das zum Anpassen der Osmolarität 750 mM NaCl in einer Menge
von 2,67 ml zugesetzt und kein A.dest. zugegeben wird.
1.7. Stacking buffer
HCl 5 M 4,80 ml
Tris 2,80 g
TEMED 0,23 ml
A.dest. ad 50,00 ml
pH-Wert = 6,7- 6,9 (einstellen mit NaOH/ HCl)
1.8. NRconc.-Lösung
SDS (w/v) 10,0 % 90 µl
Stacking buffer 90 µl
Bromphenolblau 0,5 % 3 µl
Saccarose 70,0 % 117 µl
1.9. reduzierter LAP-Puffer
Tris pH 6,8 50 mM
SDS (w/v) 2,0 %
Glyzerin 10,0 %
Bromphenolblau eine Spatelspitze
β-Mercaptoethanol
1.10. BMW-Standard
Stock sample buffer
A. dest. 4,8 ml
Tris 0,5 M pH 6,8 1,2 ml

J. Anhang
Glyzerin 1,0 ml
SDS (w/v) 2,0 ml
Bromphenolblau (w/v) 0,5 ml
SDS (reduzierender sample buffer)
Stock sample buffer 500 µl
β-Mercaptoethanol 25 µl
Stock sample buffer für biotinylierte Standards
A. dest. 4,0 ml
Tris 0,5 M pH 6,8 1,0 ml
Glyzerin 0,8 ml
SDS (w/v) 1,6 ml
Bromphenolblau (w/v) 0,2 ml
β-Mercaptoethanol 0,4 ml
Der Standard BMW (nicht biotinyliert oder biotinyliert) wird 1:20 in dem gewünschten
Sample buffer verdünnt und bei -20°C eingefroren.
1.11. Elektrodenlauf-Puffer
Tris 25 mM
Glyzin 192 mM
SDS (w/v) 0,1 %
1.12. Blotting-Puffer
Glyzin 39 mM
Tris 48 mM
SDS (w/v) 0,0375 %
Methanol (v/v) 20,000 %
182

1.13. Ponceaurotfärbelösung
Ponceau Rot (Roth, Karlsruhe) 0,5 %
Essigsäure 1,0 %
1.14. Maleinsäurepuffer
Maleinsäure 100 mM 5,8 g
NaCl 150 mM 4,3 g
A. dest. ad 500 ml
pH-Wert = 7,5 ( einstellen mit konz. NaOH)
Pufferlösung anschließend autoklavieren.
1.15. Blocking-Stammlösung
Blockingreagenz (Boehringer, Mannheim) 10 g
Maleinsäurepuffer 100 ml
183
J. Anhang
Vor dem Gebrauch werden 10 ml der Stammlösung mit einfacher TBS-Lösung auf
100 ml aufgefüllt. Nachdem die Reagenzien bei 50°C im Wasserbad gelöst worden
sind, wird die Lösung autoklaviert und dann bei 4°C im Kühlschrank gelagert.
1.16. Coomassie-Färbelösung
Coomassie Brillant Blue R 0,25 %
Methanol 40,00 %
Eisessig 10,00 %
1.17. Entfärbelösung für Coomassie-Färbung
Methanol 20,00 %
Eisessig 10,00 %

J. Anhang
1.18. TBS (Tris buffered saline) (10fach konz.)
Tris 50 mM
NaCl 150 mM
A. dest. 1000 ml
pH-Wert 7,5 (einstellen mit HCl)
Zur Herstellung von einfacher TBS-Lösung werden 100 ml 10fach konz. TBS mit
A. dest. auf 1000ml aufgefüllt.
1.19. TBS + 1%Tween
TBS (1fach) 990,0 ml
Tween 10,0 ml
1.20. Detektionslösung
Tris 100 mM 12,114 g
NaCl 100 mM 5,844 g
A. dest. 1000 ml
1.21. NBT
NBT (Appli Chem GmbH, Darmstadt) 75 mg
DMF 700 µl
A. dest. 300 µl
1.22. BCIP
BCIP (Appli Chem GmbH, Darmstadt) 50 mg
DMF 100 % 1,0 ml
1.23. Detektionslösung + NBT/BCIP
Detektionslösung 20 ml
NBT 40 µl
BCIP 50 µl
184

1.24. Propidiumjodid-Stammlösung
Propidiumjodid (Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Steinheim) 0,5 mg
A. bidest. 1,0 ml
185
J. Anhang
Die hergestellte PI-Stammlösung wird bis zum Gebrauch in Eppendorfgefäßen bei
–20°C lichtgeschützt eingefroren (HARRISON u. VICKERS 1990).
1.25. PBS (Phosphat buffered saline)
NaCl 154,00 mM
Na2HPO4 9,10 mM
KH2PO4 2,71 mM
pH-Wert = 7,4 (einstellen mit NaOH / HCl)
1.26. Blockierungslösung
BSA 50,0 %
PBS 50,0 %
Triton 0,1 %
2. Polyacrylamidgele
2.1. 15%iges Trenngel (10 ml)
A. bidest 2,300 ml
30% Acrylamidlösung (Roth, Karlsruhe) 5,000 ml
1,5 M Tris/HCl pH 8,8 2,500 ml
10% SDS Ultrapure (Roth, Karlsruhe) 0,100 ml
10% APS ( Serva, Heidelberg) 0,100 ml
TEMED (Serva, Heidelberg) 0,004 ml

J. Anhang
2.2. 4,5%iges Sammelgel (3 ml)
A. bidest. 2,100 ml
30% Acrylamidlösung (Roth, Karlsruhe) 0,500 ml
1,0 M Tris/HCl pH 6,8 0,380 ml
10% SDS Ultrapure (Roth, Karlsruhe) 0,030 ml
10% APS ( Serva, Heidelberg) 0,030 ml
TEMED (Serva, Heidelberg) 0,003 ml
Ammoniumpersulfat und TEMED werden erst nach vierminütiger Behandlung im
Ultraschallbad zugefügt, kurz bevor das jeweilige Gel gegossen wird.
186

2. Messung des pH-Wertes und der Osmolarität
1. Messung des pH-Wertes
187
J. Anhang
Die Messung und Einstellung des pH-Wertes der verwendeten Medien, der definiert
ist als der negative dekadische Logarithmus der Wasserstoffionenkonzentration,
erfolgte mit Hilfe des pH-Meters (microprocessor pH/ION Meter pMX 3000 WTW
GmbH) bei gleichzeitiger Überprüfung der Temperatur. Das Gerät muss täglich
geeicht werden, dazu werden zwei Pufferlösungen nach DIN 19266 verwendet, z.B.
pH = 9,180 (25°C) und pH = 4,006 (25°C).
2. Messung der Osmolarität
Für die Messung und Einstellung der Osmolarität der verwendeten Medien wurde ein
Kryoosmometer (Osmomat 030, Gonotec GmbH) eingesetzt, das nach dem Prinzip
der Gefrierpunktserniedrigung funktioniert. Das Gerät verfügt über ein Kühlsystem, in
das die Proben mit einem Volumen von 50 µl abgesenkt und auf -6,8°C gekühlt
werden. Eine mit Eiskristallen behaftete Edelstahlnadel bewirkt die Kristallisation der
Probe. Das Gerät berechnet dann automatisch aus der Kristallisationstemperatur die
Osmolarität, da Lösungen mit verschiedenen Salzkonzentrationen verschiedene
Gefrierpunkte aufweisen. Die Digitalanzeige zeigt die berechnete Osmolarität in der
Einheit osmol/kg an. Vor jedem Gebrauch wird das Gerät mit Hilfe einer NaCl-
Eichlösung (Gonotec GmbH) der Osmolarität 300 mosm/kg und A. dest. (0 mosm/kg)
kalibriert.

J. Anhang
3. Inhibitoren
Stauroporin
Das Alkaloid Stauroporin (Alexis® Deutschland, Grünberg) wird aus dem
Streptomyces staurosporeus isoliert und stellt einen wirksamen Inhibitor
verschiedener Proteinkinasen dar. Besonders stark werden CDK2 und Cyclin A
gehemmt.
Summen- und Strukturformel: C28H26N4O3 -
Lavendustin A
Lavendustin A (Alexis® Deutschland, Grünberg) kann sowohl synthetisch als auch
natürlich aus dem Streptomyces griseolavendus gewonnen werden. Es handelt sich
bei diesem Stoff v.a. um einen Inhibitor der Tyrosinkinase, außerdem ist ein geringer
Einfluss auf die cAMP-abhängige Proteinkinase (PKA) und Proteinkinase C (PKC)
festzustellen.
Summen- und Strukturformel: C21H19NO6
188

H-89
189
J. Anhang
H-89 . dihydrochloride (Alexis ® Deutschland, Grünberg)
Bei H-89 ist ein Inhibitor der Proteinkinase A. Dieses Reagenz hemmt wirksam und
selektiv cAMP- und cGMP-abhängige Proteinkinasen und die Proteinkinase Cµ
(PKCµ), die meisten anderen Isotypen der Proteinkinase C werden nur schwach
gehemmt.
Summen- und Strukturformel: C20H20BrN3O2S . 2HCl
Bisindolylmaleimide I . hydrochloride
GF-109203X . HCl, Gö 6850 . HCl (Alexis® Deutschland, Grünberg)
Es handelt sich bei dieser Chemikalie um einen sehr wirksamen Inhibitor der
Proteinkinase C (PKC).
Summen- und Strukturformel: C25H24N4O2 . HCl
Okadainsäure
Ocadaic acid (high purity) (Alexis® Deutschland, Grünberg)
Dieses aus dem Prorocentrum concavum gewonnene Reagenz ist ein Inhibitor der
Proteinphosphatasen 1 und 2A in verschiedenen Zelltypen. Es besteht dagegen kein
Einfluss auf die acid Phosphatase, die alkaline Phosphatase sowie die
Tyrosinphosphatase.

J. Anhang
Summen- und Strukturformel: C44H68O13
Calyculin A (Alexis® Deutschland, Grünberg)
Dieser hochspezifische Inhibitor der Proteinphosphatase 1 und 2A wird aus der
Discodermia calyx isoliert.
Summen- und Strukturformel: C50H81N4O15P
Papaverin
Papaverine . hydrochloride (Alexis® Deutschland, Grünberg)
Papaverin hemmt die Phosphodiesterase.
Summen- und Strukturformel: C20H21NO4 . HCl
190

Forskolin
191
J. Anhang
Colforsin (Alexis® Deutschland, Grünberg)
Aus dem Coleus forskohlii wird dieser Aktivator der Adenylatcyclase gewonnen, der
einen Anstieg des intrazellulären cAMP-Spiegels bewirkt.
Summen- und Srukturformel: C22H34O7
Dedoxy-Forskolin (Alexis® Deutschland, Grünberg)
Dieses Reagenz, bei dem es sich um ein biologisch inaktives Analogon des Forskolin
dreht, hat keinen Einfluss auf den intrazellulären cAMP-Spiegel und ist als negative
Kontrolle eingesetzt worden.
Summen- und Strukturformel: C22H34O7
Tamoxifen
Tamoxifen . citrate (Alexis® Deutschland, Grünberg)
Tamoxifen ist ein Inhibitor der Chloridkanäle, es wird auch eine Hemmung der
Proteinkinase C beschrieben.
Summen- und Strukturformel: C26 H29NO. C6H8O7

J. Anhang
Hydroxytamoxifen
(Z)-4-Hydroxytamoxifen (Alexis® Deutschland, Grünberg)
Dieser Metabolit des Tamoxifen hemmt Cl - -Kanäle, es ist außerdem ein Inhibitor der
Lipidperoxidase.
Summen- und Strukturformel: C26 H29NO2
Quinin
Quinine . hemisulfate (Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Steinheim)
Quinin ist ein Inhibitor der K + -Kanäle.
Summen- und Strukturformel: C20 H24N2O2 . 1 /2 H2SO4
Quinidin
Syn. Chinidine
Quinidine . sulfate . dihydrate (Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Steinheim)
Bei diesem Reagenz handelt es sich um ein Alkaloid der Chinarinde, das einen
Inhibitor der Na + - und K + -Kanäle darstellt. Dieses Stereoisomer des Quinin hemmt
Natriumkanäle effektiver als Quinin.
Summen- und Strukturformel: (C20 H24N2O2)2 . H2SO4 . 2H2O
192

AEBSF
193
J. Anhang
AEBSF . hydrochloride (Alexis ® Deutschland, Grünberg)
Dieses Reagenz hemmt Serinproteasen einschließlich Trypsin, Chymotypsin,
Plasmakallikrein und Thrombin irreversibel.
Summen- und Strukturformel: C8 H10FNO2S . HCl
E-64
E-64 (Alexis® Deutschland, Grünberg) wird synthetisch hergestellt. Es stellt einen
irreversiblen Inhibitor der Cysteinproteinasen dar, indem es eine Thioetherbindung
mit dem Thiol des Cysteins eingeht. Auf Serinproteinasen besteht kein Einfluss.
Summen- und Strukturformel: C15 H27N5O5
Vanadate
Sodium orthovanadate (Alexis® Deutschland, Grünberg)
Dieser Inhibitor hemmt die ATPase, die alkalische Phosphatase sowie die
Tyrosinphosphatase.
Summenformel: Na3.VO4

K. Danksagung
K. Danksagung
Ich möchte mich bei Frau Dr. Dr. E. Töpfer-Petersen für das Überlassen des
interessanten Themas, die Bereitstellung des Arbeitsplatzes im Institut für
Reproduktionsmedizin der Tierärztlichen Hochschule Hannover sowie die nette
Betreuung, Korrekturen, viele Anregungen, Gedankenanstöße und freundliche
Unterstützung bei der Erstellung dieser Arbeit bedanken.
Frau Dr. Dipl.-Phys. A. M. Petrounkina danke ich für die Übernahme der Betreuung
der praktischen und statistischen Arbeit.
Herrn Prof. Dr. K. F. Weitze vielen Dank für die Bereitstellung des Arbeitsplatzes in
seinem Labor.
Der Graduiertenförderung der Tierärztlichen Hochschule Hannover bin ich für die
finanzielle Unterstützung dieser Dissertation zu besonderem Dank verpflichtet.
Der Frauenförderung der Tierärztlichen Hochschule Hannover möchte ich für die
finanzielle Unterstützung der Teilnahme an der 36. Jahrestagung Physiologie und
Pathologie in Wien danken.
Außerdem danke ich den Mitarbeitern und (Ex-)Doktoranden aus „Werk II“:
Christiane (Christel) Hettel, Dr. Mahnaz (Nasi) Ekhlasi-Hundrieser, Dr. Katrin Gohr,
Bianca Oldendorf, Christine Kochel, Dr. Silja Ebeling, Dorothee (Doro) von
Witzendorff und Erik Olaf Piehler, die mich so nett in ihrem Kreis aufgenommen
haben, jederzeit sehr hilfsbereit waren, mir mit Rat, Tat und hilfreichen Tipps zur
Seite standen, immer wieder Membranen begutachteten, die „richtige“ Pipettenspitze
BPB für eine „hübsche“ Farbe zufügten, meine Präsentationen begutachteten,
Drucker am CASY anschlossen, eifrig Korrektur lasen ...
194

195
K. Danksagung
Recht herzlich danke ich Frau Magret Schäfer für ihr „Schlüssel-Vertrauen“,
zahlreiche Durchschreibbüchlein und ihre nette Art.
Danken möchte ich ebenfalls aus „Werk I“ Petra Hasenleder, Inga Reinhardt, Erika
Schröder und Christiane Bode für die zahlreichen „Pipettenspitzen-Karton- und Flow-
Messgefäß-Spenden“.
Vielen Dank auch meinen „Mitstreitern im Schweinelabor“:
Gabi Volker für den unschlagbaren Teamgeist (EG lässt grüßen), nicht nur bei
gemeinsamer Wärmeschrank-Nutzung, optimalem Inkubations-Timing oder
gemeinsamen Sheath-Kanister-Schleppen, Zusammenhalt, Zusammenarbeit und
zahlreiche Gegenseitig-Mitleid-Spende-Telefonate.
Anke Döhring und Florenzia (Flor) Ardón, die jederzeit die Eberejakulate gewonnen
haben. Dr. Frank Magnus und Dr. Katrin Simon für die Einführung im Schweinelabor
und den Kurzlehrgang „Nachweis der Tyrosinphosphorylierung“.
Ein besonderes Dankeschön geht an Natalia, die leider viel zu kurz mit uns das
Schweinelabor bevölkert hat, bevor sie wieder zu ihren „mings“ nach Moskau
zurückgekehrt ist.
Ein herzliches Dankeschön meinen mich liebenden Eltern, die mir immer zur Seite
gestanden haben, mir unermüdlich zugehört, mich ermuntert, getröstet, moralisch
und auf jede erdenkliche Weise unterstützt, mir stets den Rücken gestärkt und mir
das alles ermöglicht haben. Ohne Eure Hilfe hätte ich es nicht geschafft. Vielen Dank
für alles!
Mein herzlicher Dank geht an die 1. HÜX-Maus Tissi, die meinen Alltag mit vielen
lieben Postkarten, Aufmunterungspäckchen, zahlreichen HL-Abenden mit
Quatschen, Pizza-Funghi, ... bis zum Morgengrauen sowie HÜX-Mäuse–Mix erhellt
hat, Danke!
Danke Barbara, dass Du immer so geduldig zugehört hast in den zahlreichen kleinen
und großen Krisen, ich auf deine moralische Unterstützung stets zählen konnte.
Danke für Hundespaziergänge, Postkarten-Verpflegung meines Briefkastens, trotz

K. Danksagung
Arbeitsstresses Korrekturlesen und eine schöne gemeinsame Zeit hier – Ruthe sei
Dank!
Hannah danke ich herzlich für den sportlichen Ausgleich, nette Abende in Biergarten
und Kino. Nicht zu vergessen die hervorragende Betreuung meiner Balkonpflanzen.
Ein herzliches Dankeschön an Wiebke, die so viel Zeit für das so gründliche,
spitzenmäßige Korrekturlesen meiner Arbeit geopfert hat und mir noch so diesen
oder jenen guten Tipp gab.
Ein Dankeschön auch an meine zwei Lieblingscousins Alex und Thomas, v.a. Alex
für die vielen erhörten SOS-Anrufe und telefonische Erste Hilfe, wenn der PC
unerklärlicherweise wieder einmal ein Eigenleben entwickelte.
Außerdem möchte ich allen (2- und 4beinigen) holsteinischen Nordlichtern danken,
die an mich geglaubt haben und jeder auf seine eigene Art zum Gelingen der Arbeit
beigetragen hat. Danke vor allem für die (telefonischen) Ablenkungs-,
Aufmunterungs- und Motivationsversuche.
Nicht zu vergessen ein Dankeschön den vierbeinigen, grunzenden Probanden, allen
voran Nautilus, Frank, Sven und Ron, die immer bemüht waren, ihr Bestes zu geben.
196

Tief, tief in unserer Seele
197
K. Danksagung
tänzelt das Pferd .... Das Pferd, das Pferd!
Das Sinnbild
der überschäumenden Kraft und
der machtvollen Bewegung,
der Energie ...
D.H. Lawrence