Transgene Tiere
Transgene Tiere
Transgene Tiere
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<strong>Transgene</strong> <strong>Tiere</strong><br />
Definition:<br />
Ein transgenes Tier besitzt definierte Veränderungen im<br />
Genom, die nicht durch klassische Züchtung oder zufällige<br />
Mutagenese zu erreichen wären.<br />
Beispiele:<br />
- Das Gen für Wachstumshormon (GH) wurde mit einem<br />
starke Promotor in das Genom der Maus eingepflanzt.<br />
- Das Gen für humanes a1-Antitrypsin (AAT) wurde in das<br />
Genom des Schafs übertragen.<br />
- Das Gen für das Prion-Protein (PRP) wurde bei der Maus<br />
durch homologe Rekombination inaktiviert (knock out<br />
Maus).
<strong>Transgene</strong> <strong>Tiere</strong><br />
Wildtyp Maus<br />
GH-transgene Maus
Erzeugung transgener <strong>Tiere</strong><br />
1. Mikroinjektion von DNA-Konstrukten in befruchtetete<br />
Eizellen<br />
2. Intramuskuläre DNA-Injektion<br />
3. Genetische Veränderung von embryonalen Stammzellen<br />
(ES)<br />
und Erzeugung chimärer <strong>Transgene</strong><br />
4. Klonierung von <strong>Tiere</strong>n aus genetisch veränderten Zellen<br />
5. Gentransfer mittels retroviraler Vektoren
Spendertier<br />
Superovulation<br />
Mikroinjektion (1)<br />
Gewinnung befruchteter<br />
Eizellen (Vorkernstadium)<br />
Mikroinjektion des<br />
DNA-Konstrukts<br />
Besamung<br />
in vitro Kultivierung<br />
transferfähiger<br />
Embryo
Mikroinjektion (2)<br />
transferfähiger<br />
Embryo zyklussynchronisertes<br />
Empfängertier<br />
Embryotransfer<br />
Trächtigkeit<br />
Geburt<br />
transgenes Foundertier<br />
Überprüfung auf Integration<br />
und Expression des Transgens<br />
F1-Generation, F2-Generation<br />
transgene Linie
Eigenschaften der Mikroinjektion<br />
- stabile Integration des DNA-Konstukts in das Genom<br />
- häufig viele Kopien (ca. 10 – 100) tandemartig wiederholt<br />
- Integrationsort zufällig (Positionseffekte !)<br />
- Foundertiere besitzen genetisch einheitliche Zellen<br />
- experimentell aufwendig (Mikroinjektion, in vitro Kultur der<br />
Embryonen)
Intramuskuläre DNA-Injektion<br />
DNA Injektion<br />
- nur einzelne wenige Zellen des Tiers integrieren das Konstrukt<br />
- Transgen wird nicht an die Nachkommen weitergegeben<br />
- Durchführung sehr einfach<br />
- ideal geeignet zur genetischen Immunisierung<br />
- DNA besser lager- und transportfähig als Protein-Impfstoffe<br />
- einmalige Applikation ausreichend<br />
- keine Gefahr durch Lebendimpfstoffe (abgeschwächte Viren)
Gentransfer mittels ES oder durch<br />
Klonierung genetisch veränderter Zellen<br />
- genetische Veränderung wird an einzelnen Zellen in Zellkultur<br />
vorgenommen<br />
-durch homologe Rekombination kann man Integrationsstelle steuern<br />
- praktisch jede denkbare Modifikation der DNA möglich<br />
- ES-Zellen nur für Mäuse verfügbar<br />
- Klonierung von <strong>Tiere</strong>n aus differenzierten Zellen bietet prinzipiell die<br />
gleichen Möglichkeiten zum Gentransfer wie die Verwendung von<br />
ES-Zellen
Expression des Transgens<br />
- abhängig vom gewählten Promotor<br />
- starke virale Promotoren (CMV, SV40)<br />
- endogene Promotoren<br />
- induzierbare Promotoren (z.B. Tet R -Promotor)<br />
- gewebsspezifische Promotoren (z.B. ß-<br />
Lactoglobulinpromotor für<br />
Expression in der Milchdrüse)<br />
- abhängig vom Integrationsort (Positionseffekt)<br />
- abhängig von der Kopienzahl der integrierten Konstrukte<br />
- cDNA-Konstrukte funktionieren häufig nicht gut
Kosten bei der Erstellung transgener <strong>Tiere</strong><br />
Maus Schwein Schaf Rind<br />
Kosten/Tier (DM) 13 320 120 1 040<br />
Kosten/Tag/Tier (DM) 0,40 14 4 24<br />
Betreuungszeit<br />
(Anzahl <strong>Tiere</strong> x Tage) 204 2 412 20 400 30 135<br />
Kosten für ein<br />
exprimierendes<br />
transgenes Tier (DM) 195 40 000 96 000 873 000
Anwendungsmöglichkeiten transgener <strong>Tiere</strong><br />
• Tiergesundheit<br />
- genetische Immunisierung<br />
- Übertragung von Resistenzgenen<br />
- Modifikation von endogenen Genen<br />
• Humanmedizin<br />
- Produktion therapeutischer Proteine (Bioreaktor, gene pharming)<br />
- Produktion von Organen für die Xenotransplantation<br />
• Verbesserung tierischer Produkte<br />
- Fleischleistung (Wachstumshormon)<br />
- Fettverteilung, Fettzusammensetzung<br />
- Milchzusammensetzung (Lactose-Gehalt, Caseine)<br />
- Eigenschaften der Wolle<br />
• Umweltschutz<br />
- Urinzusammensetzung (Reduktion von Phosphat und Nitrat)
Mögliche Ansatzpunkte für die Veränderung der<br />
Milchzusammensetzung<br />
Gen Effekt<br />
Casein Steigerung des Proteingehalts<br />
verändertes Casein Änderung der Verarbeitungseigenschaften<br />
Anti-sense ß-Lactoglobulin Verringerung des ß-Lactoglobulingehalts<br />
Anti-sense Verringerung des Fettgehalts<br />
Acetyl-CoA-Carboxylase<br />
ß-Galactosidase, Lactase Verminderung des Lactosegehalts<br />
spezifische Antikörpergene Mastitisprävention,<br />
verbesserte Hygiene der Milch
DNA<br />
Erstellung einer transgenen Kuh, die Lactase produziert<br />
(Reduzierung des Lactosegehalts in der Kuhmilch)<br />
ß-Lactoglobulin-<br />
Promotor (Rind)<br />
Mikroinjektion des DNA-Konstrukts<br />
Lactasegen ohne Promotor<br />
(Rind oder Mensch)<br />
Embryokultur,<br />
Embryotransfer<br />
transgenes Foundertier<br />
(hemizygot)<br />
Überprüfung der Integration des<br />
DNA-Konstrukts<br />
Überprüfung der Expression des<br />
Lactase-Gens<br />
(= Wird tatsächlich Lactase in der<br />
Milch gebildet?)<br />
Aufbau einer transgenen Linie<br />
mit homozygot transgenen <strong>Tiere</strong>n
Humane Proteine, die bislang in der Milch transgener Nutztiere produziert<br />
wurden:<br />
Gen<br />
α1-Antitrypsin (AAT)<br />
γ-Interferon (γIFN)<br />
Faktor IX (FIX)<br />
Wachstumshormon (GH)<br />
Plasminogen-Aktivator (tPA)<br />
Fibrinogen<br />
monoklonaler Antikörper<br />
Antithrombin III (ATIII)<br />
lange wirksamer<br />
Plasminogen-Aktivator (LA-tPA)<br />
Interleukin 2 (IL2)<br />
Protein C (PC)<br />
Lactoferrin<br />
Spezies<br />
Schaf<br />
Schaf<br />
Schaf<br />
Schaf<br />
Schaf<br />
Schaf<br />
Schaf<br />
Ziege<br />
Ziege<br />
Kaninchen<br />
Schwein<br />
Rind<br />
Konz.<br />
[mg/l]<br />
35 000<br />
0,02<br />
100<br />
1 700<br />
3<br />
1 000<br />
300<br />
10<br />
5<br />
0,4<br />
0,2<br />
Anwendung<br />
Lungenemphysem<br />
Krebs<br />
Hämophilie<br />
Wachstumsstörungen<br />
Herzinfarkt, Schlaganfall<br />
Blutersatzprodukte<br />
antikörperspezifisch<br />
Durchblutungsstörungen<br />
Herzinfarkt, Schlaganfall<br />
Krebs<br />
Thrombose<br />
Infektionen, Anämie
genomische DNA<br />
DNA-Konstrukt für<br />
knock-out<br />
rekombinierte<br />
genomische DNA<br />
Erstellung einer knock out Maus (1)<br />
homologe Rekombination<br />
Startcodon<br />
ATG<br />
1 2 3<br />
neo R<br />
homologe DNA-Bereiche<br />
neo R<br />
+<br />
Stopcodon<br />
HSV-TK<br />
Gen mit 3 Exons<br />
Transfektion des DNA-Konstrukts in ES-Zellen<br />
homologe Rekombination von Konstrukt und gen. DNA<br />
Zellkultur der ES-Zellen<br />
Selektion mit G418 (Anwesenheit von neo R )<br />
Selektion mit Ganciclovir (Abwesenheit von HSV-TK)<br />
Überprüfung der korrekten Integration des Konstrukts<br />
Stopcodon<br />
1 2 3<br />
1. Exon des Gens fehlt,<br />
Genprodukt kann nicht<br />
mehr gebildet werden
Erstellung einer knock out Maus (2)<br />
Erzeugung einer Keimbahnchimäre<br />
genetisch modifizierte ES-Zellen<br />
Injektion in eine Blastocyste,<br />
Implantation in Empfängertier<br />
Trächtigkeit<br />
Chimäre Maus<br />
Überprüfung, ob genetisch modifizierte ES-Zellen<br />
zur Keimbahn beigetragen haben<br />
Erzeugung heterozygoter F1-<strong>Tiere</strong> und<br />
homozygot Gen-defizienter F2-<strong>Tiere</strong> (= knock out Mäuse)
Dolly (erstes kloniertes Schaf)<br />
Wilmut et al., (1997)<br />
Nature 385, 810-813
Polly<br />
(Klon eines Faktor IX transgenen Schafs)
Abstammungssicherung in der Tiermedizin<br />
Kommt ein bestimmtes männliches Tier als Vater in Frage ?<br />
Quelle: Tosso Leeb, Tierärztl. HS Hannover<br />
M N V1 V2<br />
3 Systeme:<br />
- Blutgruppen<br />
- Mikrosatelliten (STR-Typisierung)<br />
- AFLP/Fingerprint<br />
?
Abstammungssicherung in der Tiermedizin<br />
Notwendigkeit eines gesicherten Abstammungsnachweises:<br />
- Nutzung erblicher Leistungsmerkmale<br />
- Vermeidung erblicher Defekte<br />
Kennzeichnung von <strong>Tiere</strong>n:<br />
(Abhängig von Tierart)<br />
Aufnahme des Signalements<br />
Tätowierungen<br />
Brandzeichen<br />
Ohrmarken<br />
Geburtsmeldung nach VVO (Tierpass)<br />
Mikrochip<br />
Quelle: Tosso Leeb, Tierärztl. HS Hannover
Doppellender ( Myostatin-Gen)<br />
Blaue Belgier (Belgian Blue):<br />
Extreme Bemuskelung (+ 20 %), reine Fleischrasse<br />
Muskuläre Hyperplasie (mehr Muskelzellen, Größe normal)<br />
Verminderte Fruchtbarkeit<br />
Verminderte Milchleistung<br />
Häufig Schwergeburten<br />
monogenetisch, autosomal rezessiver Erbgang
Erbliche Immunschwäche bei Arabern (SCID)<br />
Severe combined immunodeficiency (SCID):<br />
Vollständiges Fehlen von B- und T-<br />
Lymphozyten<br />
<strong>Tiere</strong> sterben früh an opportunistischen<br />
Infektionen<br />
monogenetisch, Erbgang autosomal rezessiv<br />
Ursache: Mutation im Gen f. d. katalytische<br />
Untereinheit d. DNA-Abhängigen<br />
Proteinkinase (PRKDC) keine funktionelle<br />
DNA-PK, keine VDJ-Rekombination<br />
(Sequenzspezifische Rekombination zur<br />
Umlagerung von Genen für Immunglobuline<br />
und T-Zell-Rezeptoren)
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