Charakterisierung von pektinolytischen Enzymen der Zuckerrübe

- 1 M NaOH
- Aceton
- G2-Fritte
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3.4.2 Durchführung Kapillarviskosimetrie
Zu Beginn des Versuches wurde eine 0,4 %ige Pektinlösung, die als Substrat diente, hergestellt,
wobei das Pektin unter ständigem Rühren in 100 ml Citrat-Phosphat-Puffer eingestreut
wurde und die Suspension auf 60 – 70 °C erwärmt wurde. Nach dem Abkühlen erfolgte das
Auffüllen der Lösung auf 200 ml. Dazu wurde entionisiertes Wasser verwendet. Die Lösung
wurde anschließend unter Verwendung eines Ultraschallbades entgast.
Für die Messung wurden 12,5 ml der Substratlösung in ein Becherglas pipettiert und mit 2,5
ml Enzymextrakt versetzt und gemischt. Im Moment der Zugabe des Enzymextraktes wurde
die Stoppuhr betätigt. Das Gemisch wurde dann in die Kapillare eingefüllt und diese unverzüglich
in das Wasserbad des Kapillarviskosimeters, das auf 30 °C temperiert war, gestellt.
Die erste Messung bzw. das Hochpumpen der Lösung in der Kapillare wurde 3 Minuten nach
Zugabe des Enzymextraktes gestartet. Die Zeit, die ein definiertes Volumen des Substrat-
Enzym-Gemisches benötigte, um die Kapillare zu durchströmen wurde über zwei Lichtschranken
erfasst. 10 Minuten nach Ablesung des ersten Messwertes wurde die Lösung erneut
hoch gepumpt und wiederum wurde die Zeit erfasst, die das definierte Flüssigkeitsvolumen
benötigte, um die Kapillare zu durchströmen.
Ebenfalls erfasst wurde die Zeit, die entionisiertes Wasser benötigt, um bei 30 °C die Kapillare
zu durchströmen. Bei jedem Probewechsel erfolgte ein dreimaliges Spülen der Kapillare
mit 1 M NaOH-Lösung und ein Nachspülen mit entionisiertem Wasser. Um die Kapillare
anschließend zu trocknen, wurde sie mit Aceton gespült. Um den Trocknung mittels Aceton
zu beschleunigen und letzte Acetonreste aus der Kapillare zu entfernen, wurde kurzzeitig
Druckluft durch die Kapillare geleitet.
3.5 Bestimmung der endo-Polygalacturonaseaktivität mittel Rotationsviskosimetrie
Rotationsviskosimeter, die auch als Rotations-Rheometer bezeichnet werden, sind oft zylindrische
Messsysteme, die aus einem rotierenden zylindrischen Körper, der als Rotor bezeichnet
wird und einer ruhenden Gegenfläche, die Stator genannt wird, bestehen. Grundsätzlich werden
bei dieser Art der Viskosimetrie, im Falle eines koaxialen Zylindermesssystems, wie in
Abb. 5 dargestellt, zwei Systeme unterschieden.