Charakterisierung von pektinolytischen Enzymen der Zuckerrübe

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Im Anschluss wurden 0,25 ml des gereinigten Enzymextraktes mit 0,25 ml der 0,1 %igen
Polygalacturonsäurelösung und 0,5 ml des Acetatpuffers in ein Reagenzglas pipettiert und
nach dem Verschließen durch Schütteln gemischt. Das Gemisch wurde dann für 3 Stunden bei
30 °C in einem Klimaschrank inkubiert. Anschließend wurden dem Gemisch 1ml 1%ige 2-
Cyanacetamidlösung und 2 ml des Boratpuffers (pH 9,0) hinzupipettiert und das Reagenzglas
11 Minuten in einem Wasserbad bei 99,9 °C erwärmt. Das Abkühlen des Reagenzglases auf
20 °C erfolgte in einem Eisbad. Nach dem erneuten Mischen des Reagenzglasinhaltes wurde
die Lösung in dem Spektralphotometer unter Verwendung von Quarzküvetten bei 276 nm
vermessen.
Begleitend zu der Enzymprobe wurden bei jeder Untersuchung drei Blindproben angefertigt,
die zu einem Gesamtblindwert (BG) zusammengefasst wurden und von der Extinktion der
Enzymprobe abgezogen wurden. Aus diesem Grunde wurden ein Enzymblindwert (BE), ein
Substratblindwert (BS) und ein Pufferblindwert (BP), wie in Tabelle 4 dargestellt, angefertigt.
Tab. 3: Darstellung der Zusammensetzung der Blindwerte
Blindwert Zusammensetzung
BE
BS
BP
BG
0,5 ml Acetatpuffer
0,25 ml Enzymlösung
0,25 ml entionisiertes Wasser
0,5 ml Acetatpuffer
0,25 ml Polygalacturonsäurelösung
0,25 ml entionisiertes Wasser
0,5 ml Acetatpuffer
0,5 ml entionisiertes Wasser
BE + BS – BP
3.4 Methode zur Bestimmung der endo-Polygalacturonaseaktivität
Die endo-Polygalacturonase ist ein Enzym, das die Hydrolyse der α−1,4−glycosidischen Bin-
dungen der Polygalacturonsäure katalysiert. Somit kann ihre Aktivität über die Änderung der
Viskosität einer Polygalacturonsäure- bzw. Pektinlösung unter definierten Bedingungen bestimmt
werden.
Laut Meurer (1991) ist Citruspectin das optimale Substrat für die Untersuchung der endo-
Polygalacturonaseaktivität, da die Viskosität einer Citruspectinlösung deutlich schneller ge-