Charakterisierung von pektinolytischen Enzymen der Zuckerrübe
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Im Anschluss wurden 0,25 ml des gereinigten Enzymextraktes mit 0,25 ml <strong>der</strong> 0,1 %igen<br />
Polygalacturonsäurelösung und 0,5 ml des Acetatpuffers in ein Reagenzglas pipettiert und<br />
nach dem Verschließen durch Schütteln gemischt. Das Gemisch wurde dann für 3 Stunden bei<br />
30 °C in einem Klimaschrank inkubiert. Anschließend wurden dem Gemisch 1ml 1%ige 2-<br />
Cyanacetamidlösung und 2 ml des Boratpuffers (pH 9,0) hinzupipettiert und das Reagenzglas<br />
11 Minuten in einem Wasserbad bei 99,9 °C erwärmt. Das Abkühlen des Reagenzglases auf<br />
20 °C erfolgte in einem Eisbad. Nach dem erneuten Mischen des Reagenzglasinhaltes wurde<br />
die Lösung in dem Spektralphotometer unter Verwendung <strong>von</strong> Quarzküvetten bei 276 nm<br />
vermessen.<br />
Begleitend zu <strong>der</strong> Enzymprobe wurden bei je<strong>der</strong> Untersuchung drei Blindproben angefertigt,<br />
die zu einem Gesamtblindwert (BG) zusammengefasst wurden und <strong>von</strong> <strong>der</strong> Extinktion <strong>der</strong><br />
Enzymprobe abgezogen wurden. Aus diesem Grunde wurden ein Enzymblindwert (BE), ein<br />
Substratblindwert (BS) und ein Pufferblindwert (BP), wie in Tabelle 4 dargestellt, angefertigt.<br />
Tab. 3: Darstellung <strong>der</strong> Zusammensetzung <strong>der</strong> Blindwerte<br />
Blindwert Zusammensetzung<br />
BE<br />
BS<br />
BP<br />
BG<br />
0,5 ml Acetatpuffer<br />
0,25 ml Enzymlösung<br />
0,25 ml entionisiertes Wasser<br />
0,5 ml Acetatpuffer<br />
0,25 ml Polygalacturonsäurelösung<br />
0,25 ml entionisiertes Wasser<br />
0,5 ml Acetatpuffer<br />
0,5 ml entionisiertes Wasser<br />
BE + BS – BP<br />
3.4 Methode zur Bestimmung <strong>der</strong> endo-Polygalacturonaseaktivität<br />
Die endo-Polygalacturonase ist ein Enzym, das die Hydrolyse <strong>der</strong> α−1,4−glycosidischen Bin-<br />
dungen <strong>der</strong> Polygalacturonsäure katalysiert. Somit kann ihre Aktivität über die Än<strong>der</strong>ung <strong>der</strong><br />
Viskosität einer Polygalacturonsäure- bzw. Pektinlösung unter definierten Bedingungen bestimmt<br />
werden.<br />
Laut Meurer (1991) ist Citruspectin das optimale Substrat für die Untersuchung <strong>der</strong> endo-<br />
Polygalacturonaseaktivität, da die Viskosität einer Citruspectinlösung deutlich schneller ge-