Charakterisierung von pektinolytischen Enzymen der Zuckerrübe

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3.3.1 Geräte und Materialien exo-Polygalacturonaseuntersuchung
- Spektralfotometer specords s100 (Analytik Jena AG) und Software Aspect Plus
- Klimaschrank (T = 30°C)
- Wasserbad (T = 100°C)
- Stoppuhr
- Reagenzgläser mit Deckel
- Quarzküvetten (d = 10 mm)
- PD – 10 Gelfiltrationssäulen mit Sephadex G-25 Medium (GE Healthcare)
- Eisbad
- Pipetten
- Bechergläser
- Enzymextrakt
- Na-Salz der Polygalacturonsäure, 0,1%ige Lösung (Sigma)
- 0,2 M Acetatpuffer (pH 5 nach Gomori ,1955), mit 0,4 mM gelöstem CaCl2
- zur Bestimmung des pH-Optimum wurden Acetatpuffer weiterer pH-Werte genutz
- 0,2 M Boratpuffer (pH 9,0 nach Opitz und Kaltofen, 1998)
- 2-Cyanacetamid, 1%ige Lösung
- Galacturonsäure, 0,01 M Stammlösung in entionisiertem Wasser
3.3.2 Durchführung exo-Polygalacturonaseuntersuchung
Vorbereitend auf die Untersuchung wurde eine Eichgerade erstellt, wozu aus der 0,01 M
Stammlösung durch Verdünnungen Standardlösungen hergestellt wurden, die 50, 100, 150
und 200 μM Galacturonsäure enthielten. Von diesen Standardlösungen wurden jeweils 0,5 ml
in ein Reagenzglas pipettiert und mit 0,5 ml des Acetatpuffers versetzt. Des Weiteren wurden
jeweils 1ml Cyanacetamidlösung und 2 ml des Boratpuffers hinzupipettiert. Nach dem Verschließen
der Reagenzgläser, wurde der Inhalt durch Schütteln gemischt und die Reagenzgläser
für 11 Minuten in einem Wasserbad bei 99,9 °C erwärmt. Anschließend wurden die Reagenzgläser
in einem Eisbad auf 20 °C abgekühlt und ihr Inhalt innerhalb einer Stunde in einem
Spektralphotometer unter Verwendung von Quarzküvetten bei 276 nm vermessen, wobei
die Referenzmessung gegen Luft erfolgte.
Eine Gelfiltrationssäule wird mit 2 mal 20 ml entionisiertem Wasser gespült und anschließend
mit 2,5 ml Enzymextrakt beaufschlagt, der mit 3,5 ml entionisiertem Wasser eluiert wurde.
Da die Gelfiltrationssäule mehrfach genutzt wurde, wurde das Spülen mit 2 mal 20 ml entionisiertem
Wasser vor jedem Gebrauch der Säule wiederholt.