Charakterisierung von pektinolytischen Enzymen der Zuckerrübe
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tersuchung stattfinden sollte und in den anschließenden 4 Minuten wurde <strong>der</strong> pH-Wert durch<br />
das Zugeben <strong>der</strong> Maßlösung auf diesem Wert gehalten und <strong>der</strong> Verbrauch an Maßlösung erfasst.<br />
Bei <strong>der</strong> Bestimmung des NaCl-Optimums, wurde das Pektin in einer entsprechenden NaCl-<br />
Lösung eingestreut und gelöst. Die Messung erfolgte bei einem pH-Wert <strong>von</strong> 7.<br />
3.3 Methode zur Bestimmung <strong>der</strong> exo-Polygalacturonaseaktivität<br />
Durch die Aktivität <strong>der</strong> exo-Polygalacturonasen werden Galacturonsäuren vom nichtreduzierenden<br />
Ende <strong>der</strong> Polygalacturonsäuren abgespalten. Honda et al. (1982) betrachteten die Zunahme<br />
<strong>der</strong> reduzierenden Gruppen in einer polygalacturonsäurehaltigen Reaktionslösung als<br />
ein Maß für die Aktivität <strong>der</strong> in <strong>der</strong> Reaktionslösung vorhandenen exo-Polygalacturonase.<br />
Alle an<strong>der</strong>en Verfahren, mit denen man die Aktivität des Enzyms bestimmen konnte nutzten<br />
ebenfalls die Tatsache, dass reduzierende Gruppen freigesetzt wurden. Als übliche Verfahren<br />
<strong>der</strong> Bestimmung galten bis 1982 die Kupfer-Arsenmolybdate-Methode nach Nelson und die<br />
Nitrosalicylsäure-Methode nach Luchsinger und Cornesky, wobei die Kupfer-<br />
Arsenmolybdate-Methode <strong>von</strong> Gross (1982) als die wesentlich sensiblere Methode dargestellt<br />
wurde. Als Mittel <strong>der</strong> Wahl stellte Gross (1982) jedoch die Methode nach Honda et al.<br />
dar, da sie um ca. 140 % sensibler sei als die üblichen Methoden.<br />
Bei <strong>der</strong> Methode nach Honda et al. (1982) wurde 2-Cyanacetamid genutzt, welches mit den<br />
Aldehydgruppen <strong>der</strong> reduzierenden Zuckern reagierte, wobei es durch Kondensationsreaktionen<br />
zu Reaktionsprodukten kam, die ihr Extinktionsmaximum bei einer Wellenlänge <strong>von</strong> 276<br />
nm hatten. Auch kam es bei längerer Reaktionsdauer als Folge <strong>von</strong> Dehydrierungen zur Bildung<br />
<strong>von</strong> Ringverbindungen wie Pyrrol- und Pyridin<strong>der</strong>ivaten, die ihr Extinktionsoptimum<br />
ebenfalls bei einer Wellenlänge <strong>von</strong> 276 nm hatten.<br />
Das Interessante an diesem Verfahren ist, dass mit ihm nicht nur Galacturonsäure nachweisbar<br />
ist, son<strong>der</strong> auch eine Vielzahl weiterer reduzieren<strong>der</strong> Kohlehydrat-Verbindungen wie z.B.<br />
Arabinose, Glucomannose und Mannose. Honda et al. selbst nutzten Glucose bei <strong>der</strong> Entwicklung<br />
des Verfahrens. Wichtig ist daher, dass mit <strong>der</strong> entsprechenden Substanz, die nachgewiesen<br />
werden soll, eine Eichkurve erstellt werden muss, um so die absolute Menge des nachzuweisenden<br />
Stoffes berechnen zu können, was für die Bestimmung <strong>der</strong> Aktivität des Enzyms<br />
nötig ist. Honda et al. (1982) und Gross (1982) nutzten dazu Glucose-Standards in einem Bereich<br />
<strong>von</strong> 5-250 nmol. Meurer (1991) und Ewest (2009) hingegen nutzen Konzentrationen<br />
<strong>von</strong> 50-200 µmol/l Galacturonsäure, um eine Eichgerade zu erstellen. Aus den so gemessenen