Charakterisierung von pektinolytischen Enzymen der Zuckerrübe

3 Materialien und Methoden
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3.1 Herstellung des Enzymextraktes mittels Ultrafiltration
Da pektinolytische Enzyme im Gewebe der Pflanzen nur in sehr geringen Mengen vorkommen,
ist es nötig, sie in Form eines Extraktes zu konzentrieren. Dafür werden vorrangig zwei
Varianten genutzt, von denen eine die Ammoniumsulfatfällung ist, bei der ein Ausfällen der
Enzyme mittels Ammoniumsulfat vorgenommen wird. Ewest (2009) favorisiert jedoch die
Enzymextraktgewinnung mittels Ultrafiltration, da sie weniger zeitintensiv ist und die Enzymaktivität
weniger beeinflusst. Bei beiden Herstellverfahren ist jedoch zu beachten, dass
alle Verfahrensschritte bei 4 °C ausgeführt werden, da die Enzyme thermisch labil sind.
Die Herstellung des Enzymextraktes mittels Ultrafiltration lässt sich im Wesentlichen in drei
Verfahrensschritte untergliedern, von denen der Aufschluss des Zellgewebes der erste ist. In
diesem Verfahrensschritt wird das Pflanzengewebe über eine Messermühle bzw. Küchenmaschine
zerkleinert, was unter Zusatz einer wässrigen NaCl-Lösung geschieht, die zudem noch
mit Saponin versetzt ist. Saponine sind Chemikalien, die über tensidähnliche Eigenschaften
verfügen und eingesetzt werden, um den Zellaufschluss zu verbessern. Nach dem Vorzerkleinern
über die Küchenmaschine erfolgt das Homogenisieren und weitere Zerkleinern der
Pflanzengewebestücke mittels eines Ultra-Turrax. Die so erzeugte Suspension wird 2 Stunden
gerührt und dann durch ein Nylontuch gegeben, um die festen Bestandteile abzutrennen, dabei
wird der sich bildende Filterkuchen mit dem Nylontuch ausgewrungen. Das so erzeugte Filtrat
wird dann bei 4 °C zentrifugiert. Der klare Überstand durchläuft anschließend den zweiten
wesentlichen Herstellungsschritt. Er wird mittels Ultrafiltration aufkonzentriert. In diesem
Verfahrensschritt werden der Enzymlösung vorrangig Wasser, Salze und andere Stoffe, wie
z.B. reduzierende Zucker, die in der Lage sind die Membran zu passieren, entzogen. Ist die
Enzymlösung auf ein bestimmtes Volumen aufkonzentriert, wird die Membran mit einem
definierten, auf 4 °C temperierten Volumen NaCl-Lösung gespült, das dem Retentat zugegeben
wird. Der so erzeugte Enzymextrakt wird nun dem dritten großen Verfahrensschritt unterzogen,
in dem er von löslichen Stoffen mit niedriger Molekülmasse befreit wird. Dazu wird
ein Dialysebad verwendet, in dem sich eine Dialyselösung befindet, die aus entionisiertem
Wasser, NaCl und einer sehr geringen Menge Natriumazid zusammensetzt. Das Natriumazid
dient der Unterdrückung mikrobiellen Wachstums. Der Enzymextrakt befindet sich in einer
semipermeablen Membran aus Cellulose, die Dialyseschlauch genannt wird. Dieser Dialyse-