1. Trennprinzipien in der Chromatographie - hikwww8.fzk.de

1. Trennprinzipien in der Chromatographie
Allgemeine Definition
- Als Chromatographie bezeichnet man eine Methode zur Trennung von Substanzen, bei der
sich die Moleküle, die zu trennen sind, zwischen zwei Phasen verteilen.
- Sie verteilen sich zwischen einer unbeweglichen (stationären) Phase und einer beweglichen
(mobilen) Phase.
- Die Trennung beruht auf den unterschiedlichen physikalisch-chemischen Eigenschaften der
verschiedenen Moleküle, die sich deshalb unterschiedlich lang in den beiden Phasen aufhalten
und somit getrennt werden können.
- Der Trennvorgang beruht auf reversiblen Gleichgewichtsmechanismen.
- Das trennbare Gemisch besteht aus Stoffen, die sich in ihrer Affinität zur Grenzfläche
unterscheidet. Diese Affinitäten sind als Enthalpien bestimmbar.
- Durch häufige Teilnahme der Moleküle an der Gleichgewichtsdynamik reichen kleine
Affinitätsunterschiede zur Trennung aus.
1.1 Chromatographisches System
Laufmittel
(mobile Phase)
Adsorbens
(stationäre Phase)
- Besteht aus 2 nicht miteinander mischbaren Phasen.
Die mobile Phase bewegt sich an der stationären
Phase vorbei.
- Aufgrund von Diffusionsprozessen treten die zu
trennenden Moleküle durch die Phasengrenzfläche
durch.
- Die Moleküle verweilen in der jeweiligen Phase entsprechend ihren physikalischen
Eigenschaften unterschiedlich lange.
- Anreicherung in der einen oder anderen Phase
- Je öfter der Trennvorgang wiederholt wird, umso besser ist die
Trennung, d.h. desto besser die Auflösung.
1.2 Einteilungskriterien:
1.2.1 Phasenkombination: mobile Phase: flüssig gasförmig
LC: LLC GC: GLC
LSC GSC
1.2.2 Trennprinzip - Adsorptionschromatographie
- Verteilungschromatographie
1

1.2.3 Ausführungstechniken
Entsprechend den Phasenkombinationen ergeben sich mehrere Ausführungstechniken:
a) Säulenchromatographie (SC, englisch LC): Stationäre Phase (fest) befindet sich in einer
Säule und wird von der mobilen Phase (flüssig) durchströmt.
b) Gaschromatographie (GC): Stationäre Phase: Festkörper oder Flüssigkeit (als Film)
Mobile Phase: Gas (H2, He, N2)
c) Dünnschichtchromatographie (DC, englisch TLC): Stationäre Phase: meist Kieselgel- oder
Alox-Schicht, die auf einen Träger (Glas, Kunststoff, Metall) aufgetragen ist.
Mobile Phase: Flüssigkeit (Laufmittel)
d) Papierchromatographie (PC): Stationäre Phase: Papier als Träger und Schicht
Mobile Phase: Flüssigkeit
1.3 Zusammenhang zwischen Phasenkombinationen und Ausführungstechnik
Phasenkombination Technik
flüssig - fest (LSC) SC, DC, PC
flüssig - flüssig (LLC) SC, DC, PC
gasförmig - fest (GSC) GC
gasförmig - flüssig (GLC) GC
2. Physikalisch-chemische Grundlagen
2.1 Adsorption
Unter Adsorption versteht man eine Grenzflächenreaktion zwischen einem gelösten und
einem festen Stoff (dem Adsorbens).
Die Folge dieser Reaktion ist eine Anreicherung des gelösten Stoffes an der
Phasengrenzfläche des festen Stoffes (als Adsorbant).
2.1.1 Adsorptionschromatographie
Stationäre Phase : Festkörper mit großer Oberfläche
Mobile Phase: Flüssigkeit, Gas
Die Oberflächeneigenschaften der stationären Phase bewirken die chromatographische
Trennung der unterschiedlichen Substanzen in der mobilen Phase.
Adsorption beruht auf Wechselwirkungskräften (WW):
Teilchen in mobiler Phase ↔ stationäre Phase
Ursachen für diese WW-Kräfte: - Dipol-Dipol-WW (z.B. oxidische Adsorbentien)
- Wasserstoffbrückenverbindungen
- elektrostatische WW (Ionenaustausch)
- van der Waals WW
Je nach Stärke dieser WW-Kräfte unterscheidet man zwischen physikalischer Adsorption und
chemischer Adsorption.
2

2.1.1 Physikalische Adsorption (seltener „Physisorption“)
- beruht auf schwachen van der Waals'schen Kräften
- Adsorptionsenthalpie liegt bei 8-40 kJ/mol (Bereich der Verdampfungsenthalpie)
- reversibler Vorgang
- läuft ab bis zur Gleichgewichtseinstellung
Beschreibung des Gleichgewichtszustandes (GG) Adsorption Desorption:
Der GG-Zustand kann durch empirische Gleichungen beschrieben werden:
- Langmuir-Adsorptionsisotherme
- Freundlich-Adsorptionsisotherme
- BET- Adsorptionsisotherme (Brunauer, Emmett, Teller)
Langmuir-Adsorptionsisotherme
- Voraussetzungen : - monomolekulare Belegung der Adsorbensoberfläche
- homogene Adsorbensoberfläche
- adsorbierte Moleküle üben keine WW aufeinander aus
- Adsorption und Desorption stehen im GG
- T = konst.
A frei
k 1
k 2
A ads
k1 bzw. k2 = Geschwindigkeitskonstante der Adsorption bzw. Desorption
- Herleitung: Definition des Belegungsgrades θ
nAds Anzahl der belegten Adsorptionsstellen
θ = ———— = ———————————————————
n∞ Anzahl der verfügbaren Adsorptionsstellen
1 - θ = nicht belegte Oberfläche
Geschwindigkeit der Adsorption: rAds = k1cA (1 - θ)
Geschwindigkeit der Desorption: rDes = k2θ
Im Gleigewicht: rAds = rDes ; k1cA (1 - θ) = k2θ
k1cA
=
1/ k
k1cA
+ k 2
θ │ • 1
cA
θ =
cA
+ k2
/ k1
│ k 2 / k1
= b
cA
θ = ; aus
b + cA
nAds
=
n∞
nAds
cA
b + cA
θ ergibt sich für nAds = θ • n∞
= • n∞
3

Gleichung einer Hyperbel durch den Ursprung:
Ads.
n oo
linear
Bereich
c A
Grenzfälle: b nAds = n∞
b > cA ══════> nAds = konst. (Ursprunggerade)
Nur im linearen Bereich ist chromatographisches Arbeiten möglich, denn nur hier ist die
Adsorptionsisotherme in ihrem Verhalten unabhängig von der Probenmenge !
2.1.2 Chemische Adsorption (Chemisorption)
- Bildung einer festen Oberflächenverbindung
- Adsorptionsenthalpie liegt bei 80-600 kJ/mol (Bereich der chemischen Reaktionsenthalpien)
- irreversibler Vorgang
- stark gehemmte GG-Einstellung wegen Aktivierungsenergien
2.2 Verteilung
- Bei der Verteilung (flüssig - flüssig) besteht das System aus zwei praktisch nicht mischbaren
Flüssigkeiten und einem in beiden Phasen löslichen Stoff.
- Die Trennung beruht auf den unterschiedlichen Löslichkeiten des Stoffes in den beiden
Flüssigkeiten
- Zusammengefasst im Nernst'schen Verteilungsgesetz
c IA
c IIA
α = Verteilungskoeffizient
cIA
α = ———— = konst. cIA = Konzentration des Stoffes A in Phase I
cIIA cIIA = Konzentration des Stoffes A in Phase II
α stellt die Gleichgewichtskonstante eines Verteilungsgleichgewichtes dar :
α = f (T, p, Phase) ; α ≠ f (c) ; Idealfall : α ≠ f (cA)
Abweichungen von der Nernst-Verteilung: cA ≠ αA ; cA wird ersetzt durch cA • fA
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α A
c A
f > 1
Nernst-Vert.
f < 1
Anwendung auf Stoffgemische: Trennung zweier Stoffe A und B
c I
f > 1
f < 1
Nernst-Vert.
- Um ein Stoffgemisch A + B trennen zu können, ist es notwendig, dass der Unterschied der
Verteilungskoeffizienten αA und αB ausreichend groß ist.
- Die Verteilungskoeffizienten erhält man aus den Steigungen der Geraden, wenn man cI
gegen cII aufträgt:
c I
A
α Α
α B
c II
B
Ermittlung des Trennfaktors β :
αA cIA cIB
β = ——— mit αA = ——— ; αB = ———
αB cIIA cIIB
cIA • cIIB
β = ———— ; für β > 1000: Trennung durch einfache Verteilung möglich (Ausschütteln
cIIA • cIB im Schütteltrichter)
für β< 1000: Trennung durch multiplikative Verteilung (Verteilungsbatterie)
Unter multiplikativer Verteilung versteht man ein Trennverfahren, bei dem das Prinzip des
Ausschüttelns mit vielfachem Phasenwechsel angewendet wird. Die bekannte Variante ist die
Craig-Verteilung.
Ablauf des Trennvorganges :
- gute Durchmischung zur Erreichung der GG-Einstellung
- Phasentrennung
- Überführung der Oberphase in das nächste Element
c II
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Obere Phase = mobile Phase Untre Phase = stationäre Phase
Element
Ergebnis einer Verteilung zweier Substanzen A + B mit αA = 3 x 10 -2 und αB = 1/3 x 10 2 .
3. Papierchromatographie (PC)
Die PC ist eine Verteilungschromatographie, bei der eine Verteilung der zu trennenden
Substanzen zwischen zwei nicht oder nur begrenzt flüssigen mischbaren Phasen eintritt.
Filterpapier bestimmter Qualität dient als Träger für die stationäre und für die mobile Phase.
Die Cellulose ist ein Polysaccharid, das stark zur Quellung mit Wasser neigt. Es kann
intermicellar in seinen freien Gitterräumen beträchtliche Mengen Wasser einlagern. Die
Cellulose umgibt sich also, grob gesehen, mit einer Hydrathülle, die als wässrige (stationäre)
Phase des Verteilungschromatogramms fungiert, in der sich die hydrophilen Moleküle lösen
und sich ins Gleichgewicht mit der vorbeiströmenden feuchten organischen (mobilen) Phase
setzen.
Die verschieden große Wanderungsgeschwindigkeit der Substanzen auf dem Chromatogramm
beruht auf ihrem unterschiedlichen Verteilungskoeffizienten zwischen der stationären und
mobilen Phase. Die Wanderungsstrecke in einem bestimmten Laufmittel ist charakteristisch
für die betreffende Substanz, wenn diese Strecke zur Wanderungsstrecke des Laufmittels in
Beziehung gesetzt wird. Als Maß für die Wanderungsgeschwindigkeit einer Verbindung
wurde somit der sog. Rf -Wert als Quotient aus Entfernung der Substanz vom Startpunkt und
Entfernung der Laufmittelfront vom Startpunkt definiert (Rf- Wert: engl. "ratio" zur "front"):
Entfernung der Substanz vom Start
Rf -Wert = ——————————————————
Entfernung der Laufmittelfront vom Start
Da der Rf -Wert durch Einfluss von Temperatur, Fremdionen, Konzentrationsunterschiede
schwanken kann, lässt man möglichst Vergleichssubstanzen mitlaufen.
Vorteile der PC: - billig
- flexible Größe
c
A B
Anzahl der
Elemente
. . .
6

- geringer apparativer Aufwand
- mehrere Detektionsmethoden
Nachteile der PC: - nicht präparativ
- aufsteigende Methode, kann gegen die Schwerkraft maximal eine
Steigehöhe von ca. 30 cm erreichen
- geringere Trennleistung gegenüber der DC
Variation der Bedingungen:
- Verlängerung der Trennstrecke mit Hilfe der absteigenden Technik
- Flächengewicht und Härte des Papiers beeinflussen die Steiggeschwindigkeit (> 60-190
mm/30 Min)
-schnelllaufende Papiere haben kurze Analysenzeiten, aber geringere Trennschärfe (weichere
Papiere → hohe Steiggeschwindigkeit; harte Papiere → geringe Steiggeschwindigkeit)
Detektionsmethoden:
- Farbige Substanzen erübrigen besondere Methoden
- konjugierte Doppelbindungen (u.a. Aromaten) → UV-Detektor
- Doppelbindungen → Jodkammer
- funktionelle Gruppen → Sprühreagenzien
- radioaktive Substanzen → Szintillationszähler
Anwendung der PC:
- Trennung von polaren, meist wasserlöslichen Stoffen
- überwiegend zur Trennung von Naturstoffen (Peptide, Nucleotide)
4. Reversed-Phase-Chromatographie (RPC)
Normalfall der PC: stationäre Phase → Wasser (polar)
mobile Phase → organische Laufmittel (unpolar)
Für hydrophile Substanzen wählt man ein Laufmittel, das die Substanzen noch etwas löst,
aber mit Wasser weitgehend unmischbar ist (Essigester, Butanol).
Bei im Wasser schwerlöslichen Substanzen und hydrophoben Stoffen verändert man die
stationäre Phase: Imprägnierung der Cellulose mit polaren organischen Lösungsmitteln.
- stationäre Phase → organisches, polares Lösungsmittel
- mobile Phase → organisches Lösungsmittel mit geringer Löslichkeit
Reversed-Phase : stationäre Phase → organisch, unpolar
mobile Phase →wässrig, polar
Durchführung der RPC:
- Befreiung der Cellulose von der Hydrathülle (Trocknung)
- Auftragung eines gut haftenden organischen Öls (Paraffinöl, Silikonöl)
Wirkung:
- unpolare, hydrophobe Substanzen lösen sich besser in der stationären Phase als in der
polaren mobilen Phase
- Verringerung der Rf -Werte im Vergleich zur normalen PC
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5. Dünnschichtchromatographie (DC)
Adsorptionschromatographie
- Trennung beruht auf Grenzflächenreaktion
- stationäre Phase besteht aus einer dünnen Schicht, die auf einem Träger aufgetragen ist
- Trennvorgang erfolgt meist zweidimensional
Eine DC-Anordnung besteht aus
- der Sorptionsschicht (Schichtdicke: 0,1-2 mm)
- dem Laufmittel
- der Entwicklungskammer
- der Probe
Adsorbentien (Sorptionsmittel)
- Kieselgel (SiO2) : - ohne Bindemittel
- mit Gips (CaSO4) oder Stärke (als Bindemittel)
- mit Fluoreszenzindikator
- Alox (Al2O3): - basisch
- neutral
- sauer
- Magnesiumsilikat (Mg2SiO4)
- Hydroxyapatit [Ca5(PO4)3(OH)]
- Cellulose
Adsorbens Trenneigenschaft Bemerkung
————————————————————————————————————
SiO2 zur Trennung wenig polarer sehr polares Trennmittel
Substanzen geeignet findet häufigste Anwendung
Alox analog SiO2 sehr polares Trennmaterial
saures Alox → saure Verbindungen
basisches Alox → bas. Verbindungen
Detektion:
- Fluoreszenz: Viele aromatische Verbindungen zeigen im UV-Licht (200-400 nm)
Eigenfluoreszenz
- Absorption: Die meisten Platten enthalten einen Fluoreszenzindikator (Index F254), d.h. beim
Bestrahlen mit UV-Licht (254 nm) fluoresziert der Indikator grün-gelb. UV-aktive
Substanzen absorbieren das eingestrahlte Licht, der Fluoreszenzindikator wird im Bereich der
Substanz nicht angeregt, man beobachtet auf dem Chromatogramm dunkle Flecken auf
fluoreszierendem Untergrund.
- Chemische Reaktion: Funktionelle Gruppen getrennter Substanzen reagieren mit Reagenzien
zu farbigen Folgeprodukten.
Vorteile der DC: - geringer apparativer Aufwand
- hohe Trennleistung in kurzer Zeit
- selektive Nachweise sind möglich
- niedrige Nachweisgrenzen
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Wichtiger Vorteil: Ergebnisse der DC lassen sich in vielen Fällen auf die
Säulenchromatographie übertragen (Kombination DC-SC). Testtrennung mit DC, bevor man
SC anwendet. Dabei ist zu berücksichtigen: Trennleistung der DC ist höher als bei SC (10 cm
DC-Platte = 1 m Säule)! Ursache : geringere Stoffbelastung des DC-Trennsystems und
weniger Störung durch Diffusion, da durch das kapillare Aufsteigen der mobilen Phase eine
erzwungene Strömung entsteht.
Nachteile der DC: Bei der Aufarbeitung der getrennten Substanzen muss nicht nur SiO2
abgetrennt werden, sondern auch das Bindemittel (CaSO4) und der Fluoreszenzindikator.
Einfluss der Adsorptionsisothermen auf die DC-Trennung:
n Ads
n Ads
n Ads
A
A
B
B
c A , c B
c A , c B
c A , c B
A
B
B
A
A
B
B
A
- große Steigung der Isothermen im linearen Bereich
-beide Stoffe werden stark adsorbiert,
A stärker als B
- Unterschied der Steigung zu gering, daher schechte
Trennung
Veränderung der Polarität der mobilen Phase
- Änderung des Isothermenverlaufs
- A und B werden weniger stark adsorbiert
- Unterschied der Steigungen größer, daher bessere
Trennung
Einfluss der Konzentration von A und B auf
die Isothermen
- Konzentrationen nicht mehr im linearen Bereich
- Banden ziehen sich auseinander
- keine Auftrennung
Anwendungsbereich der DC: Trennung von Substanzen im analytischen (ng - µg) Bereich
und im präparativen (mg - g) Bereich.
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Laufmittel: Eluotrope Reihe oder Polaritätsreihe
- Elutionswirkung ist abhängig von der Polarität des Lösungsmittels
- Dielektrizitätskonstante ε ist ein direktes Maß für die Polarität
- je polarer das Lösungsmittel, desto kürzer die Retentionszeit (= Verweilzeit) einer Probe
Ursache: Die WW zwischen Probe und mobiler Phase wird größer, die WW zwischen Probe
und der stationären Phase kleiner.
zunehmende Polarität
————————————————————————————————————>
n-Pentan, Cyclohexan, Ether, Benzol, Essigester, Dioxan, CHCl3, CH2Cl2, Aceton, Ethanol,
Methanol, H2O org. Säuren, anorg. Säuren
Wirkung:
- je weiter das Laufmittel in der eluotropen Reihe, desto größer der Rf - Wert einer Probe
- von zwei zu trennenden Substanzen hat bei gegebenem Laufmittel die weniger polare
Substanz den größeren Rf - Wert.
Für die RPC gilt die eluotrope Reihe in genau umgekehrter Reihenfolge. Sie wird dann
mixotrope Reihe genannt.
Entwicklungsarten in der DC
Das Auftragen des zu trennenden Substanzgemisches erfolgt punktförmig auf der Startlinie
der DC-Platte mit Hilfe von Glaskapillaren (5-20 µL Substanzlösung). Durch mehrmaliges
Auftragen eines geringen Volumens mit anschließendem Trocknen können die Flecken klein
gehalten werden. Die Entwicklung erfolgt in Trennkammern, die mit Laufmittelatmosphäre
gesättigt sind.
- Aufsteigende DC: häufigste Technik, kann mehrfach mit verschiedenen (Stufentechnik) oder
gleichem (Mehrfach-DC) Fließmittel wiederholt werden.
- Absteigende DC: für langsam fließende Laufmittelgemische. Das Laufmittel wird über einen
saugfähigen Docht von oben auf die Platte geführt.
- Keilstreifentechnik: zusätzliche Strömung senkrecht zur Laufrichtung (Substanzflecken
werden auseinandergezogen; längere Laufzeiten)
- Zirkulartechnik: Das Laufmittel wird über einen Docht in der Mitte einer horizontal
liegenden DC-Platte aufgegeben (mehrere Substanzgemische können gleichzeitig getrennt
werden).
- Zweidimensionale DC: Das Substanzengemisch wird für den 1. Lauf in der linken unteren
Ecke der Platte aufgetragen; es wird entwickelt und getrocknet. Nach der Drehung der Platte
um 90° erfolgt ein 2. Lauf mit einem anderen Laufmittelgemisch. An den Rändern können
jeweils Referenzsubstanzen mitlaufen.
- TRT-Technik (Trennen - Reaktion - Trennen): zur Untersuchung physikalischer und
chemischer Einwirkungen auf Substanzen auf der DC-Platte.
Entwicklung analog zweidimensionaler DC in einer Richtung.
Reaktion (z.B. UV-Bestrahlung, O2 - oder HCl - Einwirkung)
Entwicklung in 2. Richtung mit gleichem Laufmittel (sind die Substanzen
unverändert geblieben, so liegen sie auf einer Diagonalen)
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6. Säulenchromatographie (SC) (Adsorptionschromatographie)
- Verfahren zur Trennung von großen als auch von kleinen Substanzmengen
- Stationäre Phase (Adsorbens) befindet sich in einer Säule
- Das Substanzgemisch wird mit der mobilen Phase durch die Säule transportiert
- Trennung der einzelnen Komponenten aufgrund ihrer physikalischen Eigenschaften
- Das Trennmittelbett besteht aus der stationären Phase und wird Sorptionsmittel genannt.
- Die mobile Phase nennt man Elutionsmittel.
- Das zu trennende Gemisch liegt während des Trennvorganges flüssig oder gasförmig vor
- Die Trennung findet an der Grenzfläche zwischen mobiler und stationärer Phase statt.
- Bei der SC müssen zwei Forderungen erfüllt sein:
maximale Größe der Phasengrenzfläche
minimales Volumen der Säule: - lange, dünne Röhre
- röhrenförmige Zwischenkornvolumina einer Packung
von Feststoffteilchen
Watte
Laufmittel
Sand
Adsorbens
Sand
.
Der Erfolg der SC-Trennung hängt von folgenden Faktoren ab:
- Selektivität des Systems Adsorbens - Laufmittel
- Betriebsbedingungen : Fließgeschwindigkeit, Temperatur, Viskosität des Laufmittels
- Dimension der Säule:
Säulendurchmesser: 0,5 - 10 cm (abhängig von der Substanzmenge)
Säulenlänge: 10 - 100 cm (Optimierung nötig von Fall zu Fall)
Teilchendurchmesser: 100 - 200 µm
Durchflussrate: 1 - 10 mL/Min (abhängig vom Durchmesser)
Adsorbentien:
- polar:SiO2 (Kieselgel) - amorph, porös, wasserhaltig mit Hydroxygruppen (200 - 800 m 2 /g)
Al2O3 (Alox) - sauer, neutral oder basisch, (100 - 200 m 2 /g)
MgO - basisch
Mg2SiO4 (Florisil) - enthält saure Oberflächengruppen
Ca5(PO4)3(OH) (Hydroxyapatit)
- unpolar: Aktivkohle - breite Porengrößenverteilung (300 - 1100 m 2 /g)
poröse Polymere - hochpolymere Kunststoffe
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Elution:
Die mobile Phase trägt nach einer gewissen Zeit einheitliche Zonen aus der Säule heraus
→ mit Elutionsmittel gemischte Reinsubstanzen werden eluiert
→ die Reihenfolge ihres Austritts aus dem System ist abhängig von der stoffspezifischen
Verweildauer im System.
Austretende Eluate werden in separaten Vorlagen fraktioniert
→ die Fraktionen einheitlicher Zusammensetzung werden räumlich voneinander getrennt
Qualitativer bzw. quantitativer Nachweis der isolierten Stoffe entweder
→ in Mischung mit Elutionsmittel während der Elution oder
→ nach der Elution nach der Entfernung des Elutionsmittels
Chromatographieapparatur
Retention:
Elutionsmittelreservoir
Probenaufgabe
Säule
Detektor
Vorlage
Während die mobile Phase an der stationären Phase entlang strömt, verweilen die zu
trennenden Moleküle eine Zeitlang an der stationären Phase.
- Sie werden gegenüber der gedachten Lösungsmittelfront zurückgehalten
- Die Moleküle zeigen Retention
- Die Verweilzeit an der stationären Phase ist artspezifisch
- Jede Probekomponente zeigt ihre eigene Retention
Chromatographie heißt: häufige Ausnutzung der artspezifischen Verweildauer auf der
stationären Phase und Verstärkung der Unterschiede im Sinne eines Vielstufenprozesses.
- Bildung einheitlicher Substanzzonen, deren Schwerpunkte und Grenzen immer weiter
voneinander getrennt sind
- Die Trennung wird dadurch immer schärfer
- Vollständige Trennung: Zwischen zwei Zonen liegt ein Volumenelement, das aus reiner
mobiler und stationärer Phase besteht.
Stoffe mit oder ohne Retention: WW zwischen wirksamer Phasengrenzfläche und Molekülen
kann folgendermaßen ablaufen:
- Moleküle, die zurückgehalten werden (Stoffe mit Retention). Auf den sorptionsfähigen
Partikel sitzt das Adsorbat, im Zwischenkornvolumen befindet sich die zugehörige GG-
Konzentration.
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- Moleküle, die nicht zurückgehalten werden (Inertsubstanzen); keine WW mit stationärer
Phase; Substanz befindet sich in Zwischenkornvolumen.
Peak:
Die räumliche Ausdehnung einer Substanz auf einer Säule wird Zone oder Peak genannt.
- keine Differenzierung zwischen der örtlichen Beladung von stationärer und mobiler Phase,
betrachtet wird nur die räumliche Ausdehnung der Gesamtmasse an Substanz im
chromatographischen System
c
Aufgabepeak
Beim Durchlaufen des Trennbetts wird der Peak durch Diffusion- und Strömungsphänomene
auseinandergezogen.
Die Basis der Glockenkurve wird in der Regel niemals schmaler als die Breite des
Aufgabepeaks (Im Interesse schmaler Banden und einer guten Auflösung muss der Aufgabe-
peak möglichst schmal sein!).
Darstellung der Elutionskurven
z
nach kurzer
Laufzeit
To
T
1
T2
nach
längerer
Laufzeit
Üblicherweise werden Substanzen in der Form detektiert und registriert, in der sie die Säule
verlassen.
I II
c/t bzw. c/R -Diagramm c/R
c
I
A
B
c
B
A
I
c/t
c
I
t
R
III
A
B
c
B A
R
t
IV
I
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Die t- bzw. R-Achse zählt von rechts nach links oder umgekehrt.
Bei den alten Registriergeräten läuft das Papier meist nach rechts.
Auflösung / Selektivität
Bestimmung der Flächeninhalte der Banden: Fi = hib0,5i
Definition der Selektivität r (relative Retention):
r
2,
1
t'
R2
tR2
− t 0
= =
r gibt die relative Position benachbarter Banden an
t'
R1
tR1
− t 0
Definition der Auflösung R:
R
2,
1
c
t0
tR1
b0,5, 1
tR2
h1
w1
b0,5, 2
2(
tR2
− tR1)
= R = 1 für den Fall, dass sich beide Basisbreiten genau treffen
w1
+ w2
In der Realität führt der tatsächliche Kurvenverlauf zu breiteren Banden (die Trennung ist für
R = 1 noch nicht vollständig).
Um die Auflösung von R = 1 zu erreichen, werden je nach Selektivität des Trennsystems eine
unterschiedliche Zahl von Trennstufen benötigt.
Entwicklungstechniken der SC
- Entwicklung: Chromatographischer Vorgang zur Auftrennung eines Substanzgemisches in
Zonen.
Frontaltechnik: kontinuierliches Auftragen des Substanzgemisches auf die Säule, gelöst in der
mobilen Phase.
-Nachteil: Die nachfolgenden Fraktionen enthalten Anteile der ersten Fraktion
(unvollständige Trennung).
- Anwendung: Abtrennung von Spuren aus einer Hauptkomponente, wenn Spuren stark und
die Hauptkomponente kaum adsorbiert wird.
w2
h2
tR
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cA
- Beispiele: Reinigung von Ether an Alox (Spuren: Peroxide, H2O)
Reinigung von CHCl3 an Alox (Spuren: Ethanol)
Allgemeine Anwendung: Trocknung von Lösungsmitteln
Elutionsprofil
cB A+B
Verdrängungstechnik: Anwendung bei Substanzen, die von der stationären Phase stark
adsorbiert werden (große Menge an mobiler Phase nötig zur Elution).
Zusatz einer Substanz zur mobilen Phase, die noch stärker adsorbiert wird.
Diese Substanz verdrängt andere Komponenten aus den Adsorptionsstellen der stationären
Phase. Die mobile Phase selbst kann zur Verdrängung eingesetzt werden.
Nachteil: keine vollständige Trennung
Praktische Anwendung: Ionenaustauschvorgänge
Elution, isokratisch (wichtigste Entwicklungstechnik)
Prinzip: Man lässt solange die mobile Phase durch die Säule fließen, bis die einzelnen
Substanzen die Säule getrennt verlassen haben. Das Substanzgemisch wird diskontinuierlich
aufgetragen
Elution ist die Folge der einzelnen Adsorptions- und Desorptionsvorgänge, die zu GG-
Zuständen führen. Jede GG-Einstellung wird als theoretische Trennstufe definiert.
cA
cB
A
A
t
t
Für Chromatographie auf normaler Phase:
B 1. Fraktion: A, unpolar
-A unpolarer als B
-A adsorbiert weniger stark als B
-A erscheint als erste Fraktion am Säulenende
-danach folgen die Fraktionen der polareren
Komponenten
2. Fraktion: B, polar
Gradientenelution
Prinzip: Kontinuierliche Veränderung der Laufmittelpolarität, diskontinuierliche Auftragung
des Substanzgemisches (vgl. isokratische Elution : konstante LM-Polarität).
Effekt der Gradientenelution: schmalere, höhere Peaks, Verringerung der Analysenzeit und
des Laufmittelvolumens
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c
A
cB
Stufenelution
Prinzip: diskontinuierliche Aufgabe des Substanzgemisches
- Entwicklung mit unpolarem LM: polare Substanzen adsorbieren auf stat. Phase sehr stark,
unpolare werden eluiert.
Entwicklung mit polarem LM. Elution der polaren Komponenten
7. Gelchromatographie
A
A B
Säulenchromatographisches Trennverfahren, bei dem Substanzen nach ihrer Molekülgröße
getrennt werden. Die zu trennenden Moleküle verteilen sich zwischen der stationären und der
mobilen Phase.
- mobile Phase → Flüssigkeit außerhalb der Partikel
- stationäre Phase → Flüssigkeit in den Partikeln (zusammen mit der Matrix)
Prinzip: Verwendung poröser Gele als Säulenmaterial (Matrix). Der Porendurchmesser dieser
Gele liegt in einem definierten Größenbereich. Moleküle, die größer als die Poren der Matrix
sind, werden mit der mobilen Phase ohne Verzögerung durch die Säule transportiert. Kleine
Moleküle diffundieren in die Poren der Matrix und legen dadurch eine größere Wegstrecke
zurück.
Trenneffekt: sterischer Ausschluss, verursacht durch die unterschiedliche Zugänglichkeit
einzelner Porenbereiche im porösen Festkörper.
Gele: Bei Zugabe von Lösungsmittel quellen die vernetzten Makromoleküle (Solvatisierung),
d.h. sie umgeben sich mit einer großen Menge an Lösungsmitteln. Diese werden durch Dipol-
Dipol-WW fest gehalten.
t
B
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Quellvermögen: Aufnahme an Gramm Lösungsmittel je Gramm trocken Gel bei der
Gelquellung. Porosität hängt von der Gesamtkonzentration und der Menge an bifunktionellem
Reagenz ab. Das Trennvermögen eines Gels beruht auf der Porenstruktur, der chemische
Aufbau ist von untergeordneter Bedeutung: Wasser → hydrophile Gele
organ. Lösungsmittel → organophile Gele
Hydrophile Gele: Polydextrane, Agarosegele
- Dextrangele: - Handelsname SEPHADEX
- Herstellung: aus Polysaccharid Dextran (1,6-α-glycosidisch verbundene
Glucose- Einheiten); Vernetzung durch Epichlorhydrin
Cl
O
Dextran Polydextran (Glycerinether)
je höher die Epichlohydrinkonzentration, desto
- stärker die Vernetzung
- kleiner die Poren des Gels
- geringer der Anteil der hydrophilen OH-Gruppen
- stärker nimmt die Solvatation und damit die Quellung ab
Typenbereich* Durchmesser der Bettvolumen Fraktionierbereich
(Sephadex) trockenen Partikel pro g Trockengel (Molmasse in g/mol)
————————————————————————————————————
G10 40 - 120 µm 2 - 3 mL bis 700
G100 40 - 120 µm 15 - 20 mL 40000 - 150000
G200 40 - 120 µm 20 - 25 mL 50000 - 80000
* gibt an, wie viel mL pro g Trockenmasse aufgenommen werden (z.B. G10: 10 mL Wasser
/g Trockenmasse
Organophile Gele: Verwendung organischer Laufmittel
- Problem: Benetzung und Solvatisierung der Poren → Derivatisierung von Dextrangelen:
durch Veretherung der hydrophilen OH-Gruppen erhält man lipophile Gele
Anforderung an das Gel als Säulenmaterial
- Porengröße muss durch Herstellungsprozess variabel sein
- keine spezifische WW des Gels mit den zu trennenden Substanzen
- möglichst geringe Korngröße (rasche Einstellung des Diffusionsgleichgewichts)
Herstellung von Gelen:
- lösliche Makromoleküle werden durch chemische Umsetzung unlöslich gemacht
- durch Copolymerisation von Monomeren mit ein- oder zwei funktionellen Gruppen
Zusammensetzung eines Gels
- Dispergierte Substanz → Gelbildner: - 3D Netzwerk von Makromolekülen
- die Makromoleküle sind miteinander verbunden
durch: - H-Brücken
- Dipol-Dipol-WW
- kovalente Bindungen
- Dispersionsmittel → Lösungsmittel
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Anwendung der Gelchromatographie
- Entsalzen von Proteinen
- Trennung von Polymer-, Protein-, und Peptidgemischen
- Abschätzung der Molekulargewichte annähernd kugelförmiger Makromoleküle
Vorteil der Gelchromatographie: Wiederverwendbarkeit / Regenerierbarkeit der Gele
8. Ionenaustausch - Chromatographie
Chromatographisches Trennverfahren für Substanzen mit elektrischen Ladungen.
Matrix
(Polymer)
Ankergruppe
(Festion)
Prinzip
- Verwendung einer unlöslichen, polymeren Matrix mit chemisch gebundenen ionischen
Gruppen
- die Gegenionen dieser Gruppen sind durch elektrostatische Kräfte nur locker gebunden
- Gegenionen können gegen Ionen der mobilen Phase ausgetauscht werden ( → reversibel)
- der Prozess beruht also auf den Coulomb'schen Kräften zwischen den Ionen
Differenzierung zwischen Ionenaustausch und Ionenaustausch-Chromatographie
- Ionenaustausch: Ionenaustauschvorgänge führen zu einem GG-Zustand
→ Anwendung des Massenwirkungsgesetzes (MWG)
bAL a+ + aBM b+ bAM a+ + aBL b+ L = Lösungsmittel ; M = Matrix
[A a+ ]M b • [B b+ ]L a
K = ———————— Stöchiometrie erfüllt !
[B b+ ]M a • [A a+ ]L b
Gegenionen
Trennung beruht beim Ionenaustausch darauf, dass der GG-Koeffizient für verschiedene
Ionen bzw. Ionenpaare unterschiedlich groß sein kann. Ursache: Ionengröße und Ionenladung.
-Ionenaustausch-Chromatographie: Der Ionenaustausch kann von Adsorptionserscheinungen
überlagert sein; kein stöchiometrischer Verlauf, MWG nicht anwendbar!
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Ionenaustausch-Matrix
- Anorganische Ionenaustauscher:
Zeolithe → Na-Al-Silikate, in deren Silikatgitter ein Teil der Si-Atome (auch Al-Atome)
ersetzt ist. Durch Alkali- Erdalkalimetalle als Gegenionen wird die fehlende
positive Ladung ausgeglichen.
Apatite → geringe Temperatur- und Druckempfindlichkeit, aber geringe chemische
Stabilität
- Organische Ionenaustauscher
Cellulose, Dextran → enthalten nach chemischer Behandlung austauschaktive Gruppen wie
-OH, -COOH, -SO3H, geringe chemische Stabilität.
polymere Kunststoffe → Polymerisations- und Polykondensationsharze (z.B. Polystyrole), die
austauschaktive Gruppe kann in einem Grundstoff enthalten sein
oder nachträglich eingeführt werden.
Einteilung von Ionenaustauschern
Art des Ionenaustauschers funktionelle Gruppe
—————————————————————————————————————
Kationenaustauscher
stark sauer Sulfonsäure —SO3H
Phosphonsäure —PO(OH)2
schwach sauer Hydroxy-Gruppe —OH
Carboxy-Gruppe —COOH
Anionaustauscher
stark basisch quartäres Amin —N + (CH3)3
DEAE —(CH2)2-N + H(C2H5)2
(DiEthylAminoEthyl)
schwach basisch primäre Aminogruppe —NH2
sekundäre Aminogruppe —NH
│
tertiäre Aminogruppe —N—
│
Charakterisierung von Ionenaustauschern
- physikalische Stabilität → Festigkeit, thermische Beständigkeit
- chemische Stabilität → Beständigkeit gegen pH-Wert oder Oxidationsmittel
- Korngröße → 0,04 - 1 mm
- Grad der Vernetzung → mittlere Vernetzungsgrad als Kompromiss
- Porosität → Maschenweite des Austauschnetzwerks, beeinflusst Kapazität und Selektivität
- Quellung → Volumenvergrößerung durch Wasseraufnahme
- Kapazität → gibt an, wieviel Gegenionen eine bestimmte Menge eines Ionenaustauschers
aufnehmen kann
- Selektivität → Möglichkeit von Trennungen aufgrund unterschiedlicher GG-Konstanten
Selektivitätsreihen:
K + Li-H-Na-NH4 + -K-Rb-Cs-Ag-Tl
K 2+ Mg-Zn-Co-Cu-Cd, Ni-Ca-Sr-Pb-Ba
K 3+ Al-Sc-Y-Ce-La
Anionen Acetat-F-OH-Cl-SCN-Br-CrO4-NO3-I-Oxalat-Sulfat-Citrat
('rechts verdrängt links!')
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9. Elektrophorese
Trennverfahren, bei dem die Wanderung elektrisch geladener Moleküle im elektrischen Feld
zur Trennung ausgenutzt wird.
Prinzip
- Elektrisches Feld wirkt auf geladene Teilchen ein
- Teilchen mit verschiedenem Ladung/Masse-Verhältnis bewegen sich darin unterschiedlich
schnell.
- Je nach Ladung bewegen sich die Moleküle in unterschiedliche Richtungen (Kathode -
Anode).
Voraussetzung
Geladene Moleküle, z.B. Säuren R-COO -
R
H
NH 2
COO -
H +
H +
R-COOH
Basen R-NH + 3 R-NH2 + H +
Aminosäuren (amphoter)
R
H
NH 2
COOH
H + R COOH
H
+ NH
3
R COO
NH
3
-
basisch sauer
H
+
Die Gegenwart eines Puffers mit Leitsalzen vermeidet die Abscheidung der Substanzen an
den Elektroden. Proteine und Aminosäuren sind besonders geeignet, da über den pH-Wert die
Dissoziation beeinflusst werden kann. Die Ladung von Proteinen bei einem bestimmten pH-
Wert ist abhängig von der Anzahl der basischen (z.B. Lysin, Histidin) und sauren
Aminosäuren (z.B. Asparaginsäure, Glutaminsäure) in der Sequenz. Ein Protein
(Eiweißmolekül) ist ein amphoterer Polyelektrolyt, dessen Nettoladung abhängig ist vom pH-
Wert und der Molekülstruktur.
Trägerfreie Elektrophorese: Problem: Fixierung nach erfolgter Trennung
Trägergebundene Elektrophorese
Papierelektrophorese: Papier als kapillares Trägersystem wird mit Puffer getränkt
Niederspannungselektrophorese -1000 V
Hochspannungselektrophorese - 1000 - 3000 V
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Nachteil: Erwärmung durch Reibung der Ionen (Joul'sche Wärme), also eine gute Kühlung ist
notwendig
Heute werden meist Flachbettgele als Träger benutzt wie Stärke, Cellulose, Sephadex,
Polyamide, Agarose
10. Affinitätschromatographie
Trennung von Substanzen mit Hilfe selektiver oder spezifischer WW-Kräfte.
Prinzip: An in Wasser schwerlösliche Materialien (z.B. Agarose, Cellulose, Glaskugeln)
werden bestimmte Liganden kovalent gebunden, so dass dieses modifizierte Material nur jene
Substanzen adsorbiert, die eine "Affinität" zu dem betreffenden Liganden aufweisen. Durch
Änderung des Trennmediums (pH, Temperatur, Ionenstärke) kann der spezifische Komplex
wieder gelöst werden.
Matrix
Anwendung: Abtrennung / Reinigung biologischer Makromoleküle durch WW zwischen
Enzym - Substrat; Enzym - Cofaktor; Enzym - Inhibitor; Antigen - Antikörper; Rezeptor -
Hormon; DNA / RNA - komplementäre DNA / RNA
11. Gaschromatographie
Ligand
Spacer
(C6-C12-Kette)
Prinzip: Verteilung von flüchtigen Substanzen zwischen der gasförmigen mobilen Phase und
einer festen (SGC) oder flüssigen (LGC) Phase.
Vorteile: - niedrige Viskosität der mobilen Phase, daher hohe Diffusionsgeschwindigkeiten
der zu trennenden Substanzen und schnelle Einstellung der Gleichgewichte zwischen den
Phasen
- kurze Analysenzeiten durch hohe Strömungsgeschwindigkeiten in langen Trennsäulen mit
geringem Strömungswiderstand.
Durchführung: Ein Gas, eine verdampfbare Flüssigkeit oder ein verdampfbarer Feststoff wird
in eine Trennsäule gegeben. Dort werden die zu trennenden Substanzen mit Hilfe eines
Trägergas durch eine thermostatisierte Säule transportiert, wo der chromatographische
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Vorgang stattfindet. Die getrennten Substanzen passieren dann nacheinander am Säulenende
einen Detektor, der über einen Schreiber die einzelnen Bestandteile anzeigt.
Trennsäulen: innerer Durchmesser (3-8 mm), Länge (1-6 m), Material: Cu, Stahl, Glas, Quarz
-stationäre Phase: Adsorptions-GC: Aktivkohle, Kieselgel, Ionenaustauscher, poröse
Polymere
Verteilungs-GC: Trägermaterialien wie Kieselgel, Glaskugeln oder Teflon,
auf denen die flüssige stat. Phase (z.B. Siliconöle, Poly-
ethylenglycole) gleichmäßig verteilt ist.
Detektoren: Wärmeleitfähigkeits- Flammenionisations- Elektroneneinfangdetektor.
Kapillar-GC: Säulendurchmesser (0,1-1 mm), Länge (30-300 m)
- Säulen enthalten kein Trägermaterial für die Trennflüssigkeit.
- zur Trennung sehr komplexer Stoffgemische und zur Spurenanalyse.
- geringe Belastbarkeit (0,1 - 1 µL Probenmenge)
11. HPLC [High Performance (oder Pressure) Liquid Chromatography]
Automatische Hochdruck-Flüssigkeitschromatographie in Säulen mit der Fähigkeit für
hochauflösende Trennungen innerhalb weniger Minuten bis zu einer Stunde.
Größe der Packungsteilchen: 5-10 µm → bessere Trennungen wegen geringeren Trennstufen-
höhen, aber Probleme durch die Möglichkeit des
Verstopfens der Säule
Druckbereich: 20-400 atm
Trennsäulen: Durchmesser (2-5 mm, analytische Säulen), Länge (5-50 cm), Material (Glas,
Edelstahl, Tantal, Kupfer)
Aufbau einer HPLC-Apparatur: Pumpe - Einspritzsystem (Probenaufgabe) - Trennsäule mit
Füllung - Detektor - Fraktionssammler
Säulenmaterial: druckstabile poröse Teilchen (z.B. Kieselgel, Alox)
gleichmäßige Siebfraktionen
Literatur:
Veronika R. Meyer: Practical High-Performance Liquid Chromatography, Wiley, Chichester,
1996.
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