1. Trennprinzipien in der Chromatographie - hikwww8.fzk.de
1. Trennprinzipien in der Chromatographie - hikwww8.fzk.de
1. Trennprinzipien in der Chromatographie - hikwww8.fzk.de
Sie wollen auch ein ePaper? Erhöhen Sie die Reichweite Ihrer Titel.
YUMPU macht aus Druck-PDFs automatisch weboptimierte ePaper, die Google liebt.
<strong>1.</strong> <strong>Trennpr<strong>in</strong>zipien</strong> <strong>in</strong> <strong><strong>de</strong>r</strong> <strong>Chromatographie</strong><br />
Allgeme<strong>in</strong>e Def<strong>in</strong>ition<br />
- Als <strong>Chromatographie</strong> bezeichnet man e<strong>in</strong>e Metho<strong>de</strong> zur Trennung von Substanzen, bei <strong><strong>de</strong>r</strong><br />
sich die Moleküle, die zu trennen s<strong>in</strong>d, zwischen zwei Phasen verteilen.<br />
- Sie verteilen sich zwischen e<strong>in</strong>er unbeweglichen (stationären) Phase und e<strong>in</strong>er beweglichen<br />
(mobilen) Phase.<br />
- Die Trennung beruht auf <strong>de</strong>n unterschiedlichen physikalisch-chemischen Eigenschaften <strong><strong>de</strong>r</strong><br />
verschie<strong>de</strong>nen Moleküle, die sich <strong>de</strong>shalb unterschiedlich lang <strong>in</strong> <strong>de</strong>n bei<strong>de</strong>n Phasen aufhalten<br />
und somit getrennt wer<strong>de</strong>n können.<br />
- Der Trennvorgang beruht auf reversiblen Gleichgewichtsmechanismen.<br />
- Das trennbare Gemisch besteht aus Stoffen, die sich <strong>in</strong> ihrer Aff<strong>in</strong>ität zur Grenzfläche<br />
unterschei<strong>de</strong>t. Diese Aff<strong>in</strong>itäten s<strong>in</strong>d als Enthalpien bestimmbar.<br />
- Durch häufige Teilnahme <strong><strong>de</strong>r</strong> Moleküle an <strong><strong>de</strong>r</strong> Gleichgewichtsdynamik reichen kle<strong>in</strong>e<br />
Aff<strong>in</strong>itätsunterschie<strong>de</strong> zur Trennung aus.<br />
<strong>1.</strong>1 Chromatographisches System<br />
Laufmittel<br />
(mobile Phase)<br />
Adsorbens<br />
(stationäre Phase)<br />
- Besteht aus 2 nicht mite<strong>in</strong>an<strong><strong>de</strong>r</strong> mischbaren Phasen.<br />
Die mobile Phase bewegt sich an <strong><strong>de</strong>r</strong> stationären<br />
Phase vorbei.<br />
- Aufgrund von Diffusionsprozessen treten die zu<br />
trennen<strong>de</strong>n Moleküle durch die Phasengrenzfläche<br />
durch.<br />
- Die Moleküle verweilen <strong>in</strong> <strong><strong>de</strong>r</strong> jeweiligen Phase entsprechend ihren physikalischen<br />
Eigenschaften unterschiedlich lange.<br />
- Anreicherung <strong>in</strong> <strong><strong>de</strong>r</strong> e<strong>in</strong>en o<strong><strong>de</strong>r</strong> an<strong><strong>de</strong>r</strong>en Phase<br />
- Je öfter <strong><strong>de</strong>r</strong> Trennvorgang wie<strong><strong>de</strong>r</strong>holt wird, umso besser ist die<br />
Trennung, d.h. <strong>de</strong>sto besser die Auflösung.<br />
<strong>1.</strong>2 E<strong>in</strong>teilungskriterien:<br />
<strong>1.</strong>2.1 Phasenkomb<strong>in</strong>ation: mobile Phase: flüssig gasförmig<br />
LC: LLC GC: GLC<br />
LSC GSC<br />
<strong>1.</strong>2.2 Trennpr<strong>in</strong>zip - Adsorptionschromatographie<br />
- Verteilungschromatographie<br />
1
<strong>1.</strong>2.3 Ausführungstechniken<br />
Entsprechend <strong>de</strong>n Phasenkomb<strong>in</strong>ationen ergeben sich mehrere Ausführungstechniken:<br />
a) Säulenchromatographie (SC, englisch LC): Stationäre Phase (fest) bef<strong>in</strong><strong>de</strong>t sich <strong>in</strong> e<strong>in</strong>er<br />
Säule und wird von <strong><strong>de</strong>r</strong> mobilen Phase (flüssig) durchströmt.<br />
b) Gaschromatographie (GC): Stationäre Phase: Festkörper o<strong><strong>de</strong>r</strong> Flüssigkeit (als Film)<br />
Mobile Phase: Gas (H2, He, N2)<br />
c) Dünnschichtchromatographie (DC, englisch TLC): Stationäre Phase: meist Kieselgel- o<strong><strong>de</strong>r</strong><br />
Alox-Schicht, die auf e<strong>in</strong>en Träger (Glas, Kunststoff, Metall) aufgetragen ist.<br />
Mobile Phase: Flüssigkeit (Laufmittel)<br />
d) Papierchromatographie (PC): Stationäre Phase: Papier als Träger und Schicht<br />
Mobile Phase: Flüssigkeit<br />
<strong>1.</strong>3 Zusammenhang zwischen Phasenkomb<strong>in</strong>ationen und Ausführungstechnik<br />
Phasenkomb<strong>in</strong>ation Technik<br />
flüssig - fest (LSC) SC, DC, PC<br />
flüssig - flüssig (LLC) SC, DC, PC<br />
gasförmig - fest (GSC) GC<br />
gasförmig - flüssig (GLC) GC<br />
2. Physikalisch-chemische Grundlagen<br />
2.1 Adsorption<br />
Unter Adsorption versteht man e<strong>in</strong>e Grenzflächenreaktion zwischen e<strong>in</strong>em gelösten und<br />
e<strong>in</strong>em festen Stoff (<strong>de</strong>m Adsorbens).<br />
Die Folge dieser Reaktion ist e<strong>in</strong>e Anreicherung <strong>de</strong>s gelösten Stoffes an <strong><strong>de</strong>r</strong><br />
Phasengrenzfläche <strong>de</strong>s festen Stoffes (als Adsorbant).<br />
2.<strong>1.</strong>1 Adsorptionschromatographie<br />
Stationäre Phase : Festkörper mit großer Oberfläche<br />
Mobile Phase: Flüssigkeit, Gas<br />
Die Oberflächeneigenschaften <strong><strong>de</strong>r</strong> stationären Phase bewirken die chromatographische<br />
Trennung <strong><strong>de</strong>r</strong> unterschiedlichen Substanzen <strong>in</strong> <strong><strong>de</strong>r</strong> mobilen Phase.<br />
Adsorption beruht auf Wechselwirkungskräften (WW):<br />
Teilchen <strong>in</strong> mobiler Phase ↔ stationäre Phase<br />
Ursachen für diese WW-Kräfte: - Dipol-Dipol-WW (z.B. oxidische Adsorbentien)<br />
- Wasserstoffbrückenverb<strong>in</strong>dungen<br />
- elektrostatische WW (Ionenaustausch)<br />
- van <strong><strong>de</strong>r</strong> Waals WW<br />
Je nach Stärke dieser WW-Kräfte unterschei<strong>de</strong>t man zwischen physikalischer Adsorption und<br />
chemischer Adsorption.<br />
2
2.<strong>1.</strong>1 Physikalische Adsorption (seltener „Physisorption“)<br />
- beruht auf schwachen van <strong><strong>de</strong>r</strong> Waals'schen Kräften<br />
- Adsorptionsenthalpie liegt bei 8-40 kJ/mol (Bereich <strong><strong>de</strong>r</strong> Verdampfungsenthalpie)<br />
- reversibler Vorgang<br />
- läuft ab bis zur Gleichgewichtse<strong>in</strong>stellung<br />
Beschreibung <strong>de</strong>s Gleichgewichtszustan<strong>de</strong>s (GG) Adsorption Desorption:<br />
Der GG-Zustand kann durch empirische Gleichungen beschrieben wer<strong>de</strong>n:<br />
- Langmuir-Adsorptionsisotherme<br />
- Freundlich-Adsorptionsisotherme<br />
- BET- Adsorptionsisotherme (Brunauer, Emmett, Teller)<br />
Langmuir-Adsorptionsisotherme<br />
- Voraussetzungen : - monomolekulare Belegung <strong><strong>de</strong>r</strong> Adsorbensoberfläche<br />
- homogene Adsorbensoberfläche<br />
- adsorbierte Moleküle üben ke<strong>in</strong>e WW aufe<strong>in</strong>an<strong><strong>de</strong>r</strong> aus<br />
- Adsorption und Desorption stehen im GG<br />
- T = konst.<br />
A frei<br />
k 1<br />
k 2<br />
A ads<br />
k1 bzw. k2 = Geschw<strong>in</strong>digkeitskonstante <strong><strong>de</strong>r</strong> Adsorption bzw. Desorption<br />
- Herleitung: Def<strong>in</strong>ition <strong>de</strong>s Belegungsgra<strong>de</strong>s θ<br />
nAds Anzahl <strong><strong>de</strong>r</strong> belegten Adsorptionsstellen<br />
θ = ———— = ———————————————————<br />
n∞ Anzahl <strong><strong>de</strong>r</strong> verfügbaren Adsorptionsstellen<br />
1 - θ = nicht belegte Oberfläche<br />
Geschw<strong>in</strong>digkeit <strong><strong>de</strong>r</strong> Adsorption: rAds = k1cA (1 - θ)<br />
Geschw<strong>in</strong>digkeit <strong><strong>de</strong>r</strong> Desorption: rDes = k2θ<br />
Im Gleigewicht: rAds = rDes ; k1cA (1 - θ) = k2θ<br />
k1cA<br />
=<br />
1/ k<br />
k1cA<br />
+ k 2<br />
θ │ • 1<br />
cA<br />
θ =<br />
cA<br />
+ k2<br />
/ k1<br />
│ k 2 / k1<br />
= b<br />
cA<br />
θ = ; aus<br />
b + cA<br />
nAds<br />
=<br />
n∞<br />
nAds<br />
cA<br />
b + cA<br />
θ ergibt sich für nAds = θ • n∞<br />
= • n∞<br />
3
Gleichung e<strong>in</strong>er Hyperbel durch <strong>de</strong>n Ursprung:<br />
Ads.<br />
n oo<br />
l<strong>in</strong>ear<br />
Bereich<br />
c A<br />
Grenzfälle: b nAds = n∞<br />
b > cA ══════> nAds = konst. (Ursprunggera<strong>de</strong>)<br />
Nur im l<strong>in</strong>earen Bereich ist chromatographisches Arbeiten möglich, <strong>de</strong>nn nur hier ist die<br />
Adsorptionsisotherme <strong>in</strong> ihrem Verhalten unabhängig von <strong><strong>de</strong>r</strong> Probenmenge !<br />
2.<strong>1.</strong>2 Chemische Adsorption (Chemisorption)<br />
- Bildung e<strong>in</strong>er festen Oberflächenverb<strong>in</strong>dung<br />
- Adsorptionsenthalpie liegt bei 80-600 kJ/mol (Bereich <strong><strong>de</strong>r</strong> chemischen Reaktionsenthalpien)<br />
- irreversibler Vorgang<br />
- stark gehemmte GG-E<strong>in</strong>stellung wegen Aktivierungsenergien<br />
2.2 Verteilung<br />
- Bei <strong><strong>de</strong>r</strong> Verteilung (flüssig - flüssig) besteht das System aus zwei praktisch nicht mischbaren<br />
Flüssigkeiten und e<strong>in</strong>em <strong>in</strong> bei<strong>de</strong>n Phasen löslichen Stoff.<br />
- Die Trennung beruht auf <strong>de</strong>n unterschiedlichen Löslichkeiten <strong>de</strong>s Stoffes <strong>in</strong> <strong>de</strong>n bei<strong>de</strong>n<br />
Flüssigkeiten<br />
- Zusammengefasst im Nernst'schen Verteilungsgesetz<br />
c IA<br />
c IIA<br />
α = Verteilungskoeffizient<br />
cIA<br />
α = ———— = konst. cIA = Konzentration <strong>de</strong>s Stoffes A <strong>in</strong> Phase I<br />
cIIA cIIA = Konzentration <strong>de</strong>s Stoffes A <strong>in</strong> Phase II<br />
α stellt die Gleichgewichtskonstante e<strong>in</strong>es Verteilungsgleichgewichtes dar :<br />
α = f (T, p, Phase) ; α ≠ f (c) ; I<strong>de</strong>alfall : α ≠ f (cA)<br />
Abweichungen von <strong><strong>de</strong>r</strong> Nernst-Verteilung: cA ≠ αA ; cA wird ersetzt durch cA • fA<br />
4
α A<br />
c A<br />
f > 1<br />
Nernst-Vert.<br />
f < 1<br />
Anwendung auf Stoffgemische: Trennung zweier Stoffe A und B<br />
c I<br />
f > 1<br />
f < 1<br />
Nernst-Vert.<br />
- Um e<strong>in</strong> Stoffgemisch A + B trennen zu können, ist es notwendig, dass <strong><strong>de</strong>r</strong> Unterschied <strong><strong>de</strong>r</strong><br />
Verteilungskoeffizienten αA und αB ausreichend groß ist.<br />
- Die Verteilungskoeffizienten erhält man aus <strong>de</strong>n Steigungen <strong><strong>de</strong>r</strong> Gera<strong>de</strong>n, wenn man cI<br />
gegen cII aufträgt:<br />
c I<br />
A<br />
α Α<br />
α B<br />
c II<br />
B<br />
Ermittlung <strong>de</strong>s Trennfaktors β :<br />
αA cIA cIB<br />
β = ——— mit αA = ——— ; αB = ———<br />
αB cIIA cIIB<br />
cIA • cIIB<br />
β = ———— ; für β > 1000: Trennung durch e<strong>in</strong>fache Verteilung möglich (Ausschütteln<br />
cIIA • cIB im Schütteltrichter)<br />
für β< 1000: Trennung durch multiplikative Verteilung (Verteilungsbatterie)<br />
Unter multiplikativer Verteilung versteht man e<strong>in</strong> Trennverfahren, bei <strong>de</strong>m das Pr<strong>in</strong>zip <strong>de</strong>s<br />
Ausschüttelns mit vielfachem Phasenwechsel angewen<strong>de</strong>t wird. Die bekannte Variante ist die<br />
Craig-Verteilung.<br />
Ablauf <strong>de</strong>s Trennvorganges :<br />
- gute Durchmischung zur Erreichung <strong><strong>de</strong>r</strong> GG-E<strong>in</strong>stellung<br />
- Phasentrennung<br />
- Überführung <strong><strong>de</strong>r</strong> Oberphase <strong>in</strong> das nächste Element<br />
c II<br />
5
Obere Phase = mobile Phase Untre Phase = stationäre Phase<br />
Element<br />
Ergebnis e<strong>in</strong>er Verteilung zweier Substanzen A + B mit αA = 3 x 10 -2 und αB = 1/3 x 10 2 .<br />
3. Papierchromatographie (PC)<br />
Die PC ist e<strong>in</strong>e Verteilungschromatographie, bei <strong><strong>de</strong>r</strong> e<strong>in</strong>e Verteilung <strong><strong>de</strong>r</strong> zu trennen<strong>de</strong>n<br />
Substanzen zwischen zwei nicht o<strong><strong>de</strong>r</strong> nur begrenzt flüssigen mischbaren Phasen e<strong>in</strong>tritt.<br />
Filterpapier bestimmter Qualität dient als Träger für die stationäre und für die mobile Phase.<br />
Die Cellulose ist e<strong>in</strong> Polysaccharid, das stark zur Quellung mit Wasser neigt. Es kann<br />
<strong>in</strong>termicellar <strong>in</strong> se<strong>in</strong>en freien Gitterräumen beträchtliche Mengen Wasser e<strong>in</strong>lagern. Die<br />
Cellulose umgibt sich also, grob gesehen, mit e<strong>in</strong>er Hydrathülle, die als wässrige (stationäre)<br />
Phase <strong>de</strong>s Verteilungschromatogramms fungiert, <strong>in</strong> <strong><strong>de</strong>r</strong> sich die hydrophilen Moleküle lösen<br />
und sich <strong>in</strong>s Gleichgewicht mit <strong><strong>de</strong>r</strong> vorbeiströmen<strong>de</strong>n feuchten organischen (mobilen) Phase<br />
setzen.<br />
Die verschie<strong>de</strong>n große Wan<strong><strong>de</strong>r</strong>ungsgeschw<strong>in</strong>digkeit <strong><strong>de</strong>r</strong> Substanzen auf <strong>de</strong>m Chromatogramm<br />
beruht auf ihrem unterschiedlichen Verteilungskoeffizienten zwischen <strong><strong>de</strong>r</strong> stationären und<br />
mobilen Phase. Die Wan<strong><strong>de</strong>r</strong>ungsstrecke <strong>in</strong> e<strong>in</strong>em bestimmten Laufmittel ist charakteristisch<br />
für die betreffen<strong>de</strong> Substanz, wenn diese Strecke zur Wan<strong><strong>de</strong>r</strong>ungsstrecke <strong>de</strong>s Laufmittels <strong>in</strong><br />
Beziehung gesetzt wird. Als Maß für die Wan<strong><strong>de</strong>r</strong>ungsgeschw<strong>in</strong>digkeit e<strong>in</strong>er Verb<strong>in</strong>dung<br />
wur<strong>de</strong> somit <strong><strong>de</strong>r</strong> sog. Rf -Wert als Quotient aus Entfernung <strong><strong>de</strong>r</strong> Substanz vom Startpunkt und<br />
Entfernung <strong><strong>de</strong>r</strong> Laufmittelfront vom Startpunkt <strong>de</strong>f<strong>in</strong>iert (Rf- Wert: engl. "ratio" zur "front"):<br />
Entfernung <strong><strong>de</strong>r</strong> Substanz vom Start<br />
Rf -Wert = ——————————————————<br />
Entfernung <strong><strong>de</strong>r</strong> Laufmittelfront vom Start<br />
Da <strong><strong>de</strong>r</strong> Rf -Wert durch E<strong>in</strong>fluss von Temperatur, Fremdionen, Konzentrationsunterschie<strong>de</strong><br />
schwanken kann, lässt man möglichst Vergleichssubstanzen mitlaufen.<br />
Vorteile <strong><strong>de</strong>r</strong> PC: - billig<br />
- flexible Größe<br />
c<br />
A B<br />
Anzahl <strong><strong>de</strong>r</strong><br />
Elemente<br />
. . .<br />
6
- ger<strong>in</strong>ger apparativer Aufwand<br />
- mehrere Detektionsmetho<strong>de</strong>n<br />
Nachteile <strong><strong>de</strong>r</strong> PC: - nicht präparativ<br />
- aufsteigen<strong>de</strong> Metho<strong>de</strong>, kann gegen die Schwerkraft maximal e<strong>in</strong>e<br />
Steigehöhe von ca. 30 cm erreichen<br />
- ger<strong>in</strong>gere Trennleistung gegenüber <strong><strong>de</strong>r</strong> DC<br />
Variation <strong><strong>de</strong>r</strong> Bed<strong>in</strong>gungen:<br />
- Verlängerung <strong><strong>de</strong>r</strong> Trennstrecke mit Hilfe <strong><strong>de</strong>r</strong> absteigen<strong>de</strong>n Technik<br />
- Flächengewicht und Härte <strong>de</strong>s Papiers bee<strong>in</strong>flussen die Steiggeschw<strong>in</strong>digkeit (> 60-190<br />
mm/30 M<strong>in</strong>)<br />
-schnelllaufen<strong>de</strong> Papiere haben kurze Analysenzeiten, aber ger<strong>in</strong>gere Trennschärfe (weichere<br />
Papiere → hohe Steiggeschw<strong>in</strong>digkeit; harte Papiere → ger<strong>in</strong>ge Steiggeschw<strong>in</strong>digkeit)<br />
Detektionsmetho<strong>de</strong>n:<br />
- Farbige Substanzen erübrigen beson<strong><strong>de</strong>r</strong>e Metho<strong>de</strong>n<br />
- konjugierte Doppelb<strong>in</strong>dungen (u.a. Aromaten) → UV-Detektor<br />
- Doppelb<strong>in</strong>dungen → Jodkammer<br />
- funktionelle Gruppen → Sprühreagenzien<br />
- radioaktive Substanzen → Sz<strong>in</strong>tillationszähler<br />
Anwendung <strong><strong>de</strong>r</strong> PC:<br />
- Trennung von polaren, meist wasserlöslichen Stoffen<br />
- überwiegend zur Trennung von Naturstoffen (Pepti<strong>de</strong>, Nucleoti<strong>de</strong>)<br />
4. Reversed-Phase-<strong>Chromatographie</strong> (RPC)<br />
Normalfall <strong><strong>de</strong>r</strong> PC: stationäre Phase → Wasser (polar)<br />
mobile Phase → organische Laufmittel (unpolar)<br />
Für hydrophile Substanzen wählt man e<strong>in</strong> Laufmittel, das die Substanzen noch etwas löst,<br />
aber mit Wasser weitgehend unmischbar ist (Essigester, Butanol).<br />
Bei im Wasser schwerlöslichen Substanzen und hydrophoben Stoffen verän<strong><strong>de</strong>r</strong>t man die<br />
stationäre Phase: Imprägnierung <strong><strong>de</strong>r</strong> Cellulose mit polaren organischen Lösungsmitteln.<br />
- stationäre Phase → organisches, polares Lösungsmittel<br />
- mobile Phase → organisches Lösungsmittel mit ger<strong>in</strong>ger Löslichkeit<br />
Reversed-Phase : stationäre Phase → organisch, unpolar<br />
mobile Phase →wässrig, polar<br />
Durchführung <strong><strong>de</strong>r</strong> RPC:<br />
- Befreiung <strong><strong>de</strong>r</strong> Cellulose von <strong><strong>de</strong>r</strong> Hydrathülle (Trocknung)<br />
- Auftragung e<strong>in</strong>es gut haften<strong>de</strong>n organischen Öls (Paraff<strong>in</strong>öl, Silikonöl)<br />
Wirkung:<br />
- unpolare, hydrophobe Substanzen lösen sich besser <strong>in</strong> <strong><strong>de</strong>r</strong> stationären Phase als <strong>in</strong> <strong><strong>de</strong>r</strong><br />
polaren mobilen Phase<br />
- Verr<strong>in</strong>gerung <strong><strong>de</strong>r</strong> Rf -Werte im Vergleich zur normalen PC<br />
7
5. Dünnschichtchromatographie (DC)<br />
Adsorptionschromatographie<br />
- Trennung beruht auf Grenzflächenreaktion<br />
- stationäre Phase besteht aus e<strong>in</strong>er dünnen Schicht, die auf e<strong>in</strong>em Träger aufgetragen ist<br />
- Trennvorgang erfolgt meist zweidimensional<br />
E<strong>in</strong>e DC-Anordnung besteht aus<br />
- <strong><strong>de</strong>r</strong> Sorptionsschicht (Schichtdicke: 0,1-2 mm)<br />
- <strong>de</strong>m Laufmittel<br />
- <strong><strong>de</strong>r</strong> Entwicklungskammer<br />
- <strong><strong>de</strong>r</strong> Probe<br />
Adsorbentien (Sorptionsmittel)<br />
- Kieselgel (SiO2) : - ohne B<strong>in</strong><strong>de</strong>mittel<br />
- mit Gips (CaSO4) o<strong><strong>de</strong>r</strong> Stärke (als B<strong>in</strong><strong>de</strong>mittel)<br />
- mit Fluoreszenz<strong>in</strong>dikator<br />
- Alox (Al2O3): - basisch<br />
- neutral<br />
- sauer<br />
- Magnesiumsilikat (Mg2SiO4)<br />
- Hydroxyapatit [Ca5(PO4)3(OH)]<br />
- Cellulose<br />
Adsorbens Trenneigenschaft Bemerkung<br />
————————————————————————————————————<br />
SiO2 zur Trennung wenig polarer sehr polares Trennmittel<br />
Substanzen geeignet f<strong>in</strong><strong>de</strong>t häufigste Anwendung<br />
Alox analog SiO2 sehr polares Trennmaterial<br />
saures Alox → saure Verb<strong>in</strong>dungen<br />
basisches Alox → bas. Verb<strong>in</strong>dungen<br />
Detektion:<br />
- Fluoreszenz: Viele aromatische Verb<strong>in</strong>dungen zeigen im UV-Licht (200-400 nm)<br />
Eigenfluoreszenz<br />
- Absorption: Die meisten Platten enthalten e<strong>in</strong>en Fluoreszenz<strong>in</strong>dikator (In<strong>de</strong>x F254), d.h. beim<br />
Bestrahlen mit UV-Licht (254 nm) fluoresziert <strong><strong>de</strong>r</strong> Indikator grün-gelb. UV-aktive<br />
Substanzen absorbieren das e<strong>in</strong>gestrahlte Licht, <strong><strong>de</strong>r</strong> Fluoreszenz<strong>in</strong>dikator wird im Bereich <strong><strong>de</strong>r</strong><br />
Substanz nicht angeregt, man beobachtet auf <strong>de</strong>m Chromatogramm dunkle Flecken auf<br />
fluoreszieren<strong>de</strong>m Untergrund.<br />
- Chemische Reaktion: Funktionelle Gruppen getrennter Substanzen reagieren mit Reagenzien<br />
zu farbigen Folgeprodukten.<br />
Vorteile <strong><strong>de</strong>r</strong> DC: - ger<strong>in</strong>ger apparativer Aufwand<br />
- hohe Trennleistung <strong>in</strong> kurzer Zeit<br />
- selektive Nachweise s<strong>in</strong>d möglich<br />
- niedrige Nachweisgrenzen<br />
8
Wichtiger Vorteil: Ergebnisse <strong><strong>de</strong>r</strong> DC lassen sich <strong>in</strong> vielen Fällen auf die<br />
Säulenchromatographie übertragen (Komb<strong>in</strong>ation DC-SC). Testtrennung mit DC, bevor man<br />
SC anwen<strong>de</strong>t. Dabei ist zu berücksichtigen: Trennleistung <strong><strong>de</strong>r</strong> DC ist höher als bei SC (10 cm<br />
DC-Platte = 1 m Säule)! Ursache : ger<strong>in</strong>gere Stoffbelastung <strong>de</strong>s DC-Trennsystems und<br />
weniger Störung durch Diffusion, da durch das kapillare Aufsteigen <strong><strong>de</strong>r</strong> mobilen Phase e<strong>in</strong>e<br />
erzwungene Strömung entsteht.<br />
Nachteile <strong><strong>de</strong>r</strong> DC: Bei <strong><strong>de</strong>r</strong> Aufarbeitung <strong><strong>de</strong>r</strong> getrennten Substanzen muss nicht nur SiO2<br />
abgetrennt wer<strong>de</strong>n, son<strong><strong>de</strong>r</strong>n auch das B<strong>in</strong><strong>de</strong>mittel (CaSO4) und <strong><strong>de</strong>r</strong> Fluoreszenz<strong>in</strong>dikator.<br />
E<strong>in</strong>fluss <strong><strong>de</strong>r</strong> Adsorptionsisothermen auf die DC-Trennung:<br />
n Ads<br />
n Ads<br />
n Ads<br />
A<br />
A<br />
B<br />
B<br />
c A , c B<br />
c A , c B<br />
c A , c B<br />
A<br />
B<br />
B<br />
A<br />
A<br />
B<br />
B<br />
A<br />
- große Steigung <strong><strong>de</strong>r</strong> Isothermen im l<strong>in</strong>earen Bereich<br />
-bei<strong>de</strong> Stoffe wer<strong>de</strong>n stark adsorbiert,<br />
A stärker als B<br />
- Unterschied <strong><strong>de</strong>r</strong> Steigung zu ger<strong>in</strong>g, daher schechte<br />
Trennung<br />
Verän<strong><strong>de</strong>r</strong>ung <strong><strong>de</strong>r</strong> Polarität <strong><strong>de</strong>r</strong> mobilen Phase<br />
- Än<strong><strong>de</strong>r</strong>ung <strong>de</strong>s Isothermenverlaufs<br />
- A und B wer<strong>de</strong>n weniger stark adsorbiert<br />
- Unterschied <strong><strong>de</strong>r</strong> Steigungen größer, daher bessere<br />
Trennung<br />
E<strong>in</strong>fluss <strong><strong>de</strong>r</strong> Konzentration von A und B auf<br />
die Isothermen<br />
- Konzentrationen nicht mehr im l<strong>in</strong>earen Bereich<br />
- Ban<strong>de</strong>n ziehen sich ause<strong>in</strong>an<strong><strong>de</strong>r</strong><br />
- ke<strong>in</strong>e Auftrennung<br />
Anwendungsbereich <strong><strong>de</strong>r</strong> DC: Trennung von Substanzen im analytischen (ng - µg) Bereich<br />
und im präparativen (mg - g) Bereich.<br />
9
Laufmittel: Eluotrope Reihe o<strong><strong>de</strong>r</strong> Polaritätsreihe<br />
- Elutionswirkung ist abhängig von <strong><strong>de</strong>r</strong> Polarität <strong>de</strong>s Lösungsmittels<br />
- Dielektrizitätskonstante ε ist e<strong>in</strong> direktes Maß für die Polarität<br />
- je polarer das Lösungsmittel, <strong>de</strong>sto kürzer die Retentionszeit (= Verweilzeit) e<strong>in</strong>er Probe<br />
Ursache: Die WW zwischen Probe und mobiler Phase wird größer, die WW zwischen Probe<br />
und <strong><strong>de</strong>r</strong> stationären Phase kle<strong>in</strong>er.<br />
zunehmen<strong>de</strong> Polarität<br />
————————————————————————————————————><br />
n-Pentan, Cyclohexan, Ether, Benzol, Essigester, Dioxan, CHCl3, CH2Cl2, Aceton, Ethanol,<br />
Methanol, H2O org. Säuren, anorg. Säuren<br />
Wirkung:<br />
- je weiter das Laufmittel <strong>in</strong> <strong><strong>de</strong>r</strong> eluotropen Reihe, <strong>de</strong>sto größer <strong><strong>de</strong>r</strong> Rf - Wert e<strong>in</strong>er Probe<br />
- von zwei zu trennen<strong>de</strong>n Substanzen hat bei gegebenem Laufmittel die weniger polare<br />
Substanz <strong>de</strong>n größeren Rf - Wert.<br />
Für die RPC gilt die eluotrope Reihe <strong>in</strong> genau umgekehrter Reihenfolge. Sie wird dann<br />
mixotrope Reihe genannt.<br />
Entwicklungsarten <strong>in</strong> <strong><strong>de</strong>r</strong> DC<br />
Das Auftragen <strong>de</strong>s zu trennen<strong>de</strong>n Substanzgemisches erfolgt punktförmig auf <strong><strong>de</strong>r</strong> Startl<strong>in</strong>ie<br />
<strong><strong>de</strong>r</strong> DC-Platte mit Hilfe von Glaskapillaren (5-20 µL Substanzlösung). Durch mehrmaliges<br />
Auftragen e<strong>in</strong>es ger<strong>in</strong>gen Volumens mit anschließen<strong>de</strong>m Trocknen können die Flecken kle<strong>in</strong><br />
gehalten wer<strong>de</strong>n. Die Entwicklung erfolgt <strong>in</strong> Trennkammern, die mit Laufmittelatmosphäre<br />
gesättigt s<strong>in</strong>d.<br />
- Aufsteigen<strong>de</strong> DC: häufigste Technik, kann mehrfach mit verschie<strong>de</strong>nen (Stufentechnik) o<strong><strong>de</strong>r</strong><br />
gleichem (Mehrfach-DC) Fließmittel wie<strong><strong>de</strong>r</strong>holt wer<strong>de</strong>n.<br />
- Absteigen<strong>de</strong> DC: für langsam fließen<strong>de</strong> Laufmittelgemische. Das Laufmittel wird über e<strong>in</strong>en<br />
saugfähigen Docht von oben auf die Platte geführt.<br />
- Keilstreifentechnik: zusätzliche Strömung senkrecht zur Laufrichtung (Substanzflecken<br />
wer<strong>de</strong>n ause<strong>in</strong>an<strong><strong>de</strong>r</strong>gezogen; längere Laufzeiten)<br />
- Zirkulartechnik: Das Laufmittel wird über e<strong>in</strong>en Docht <strong>in</strong> <strong><strong>de</strong>r</strong> Mitte e<strong>in</strong>er horizontal<br />
liegen<strong>de</strong>n DC-Platte aufgegeben (mehrere Substanzgemische können gleichzeitig getrennt<br />
wer<strong>de</strong>n).<br />
- Zweidimensionale DC: Das Substanzengemisch wird für <strong>de</strong>n <strong>1.</strong> Lauf <strong>in</strong> <strong><strong>de</strong>r</strong> l<strong>in</strong>ken unteren<br />
Ecke <strong><strong>de</strong>r</strong> Platte aufgetragen; es wird entwickelt und getrocknet. Nach <strong><strong>de</strong>r</strong> Drehung <strong><strong>de</strong>r</strong> Platte<br />
um 90° erfolgt e<strong>in</strong> 2. Lauf mit e<strong>in</strong>em an<strong><strong>de</strong>r</strong>en Laufmittelgemisch. An <strong>de</strong>n Rän<strong><strong>de</strong>r</strong>n können<br />
jeweils Referenzsubstanzen mitlaufen.<br />
- TRT-Technik (Trennen - Reaktion - Trennen): zur Untersuchung physikalischer und<br />
chemischer E<strong>in</strong>wirkungen auf Substanzen auf <strong><strong>de</strong>r</strong> DC-Platte.<br />
Entwicklung analog zweidimensionaler DC <strong>in</strong> e<strong>in</strong>er Richtung.<br />
Reaktion (z.B. UV-Bestrahlung, O2 - o<strong><strong>de</strong>r</strong> HCl - E<strong>in</strong>wirkung)<br />
Entwicklung <strong>in</strong> 2. Richtung mit gleichem Laufmittel (s<strong>in</strong>d die Substanzen<br />
unverän<strong><strong>de</strong>r</strong>t geblieben, so liegen sie auf e<strong>in</strong>er Diagonalen)<br />
10
6. Säulenchromatographie (SC) (Adsorptionschromatographie)<br />
- Verfahren zur Trennung von großen als auch von kle<strong>in</strong>en Substanzmengen<br />
- Stationäre Phase (Adsorbens) bef<strong>in</strong><strong>de</strong>t sich <strong>in</strong> e<strong>in</strong>er Säule<br />
- Das Substanzgemisch wird mit <strong><strong>de</strong>r</strong> mobilen Phase durch die Säule transportiert<br />
- Trennung <strong><strong>de</strong>r</strong> e<strong>in</strong>zelnen Komponenten aufgrund ihrer physikalischen Eigenschaften<br />
- Das Trennmittelbett besteht aus <strong><strong>de</strong>r</strong> stationären Phase und wird Sorptionsmittel genannt.<br />
- Die mobile Phase nennt man Elutionsmittel.<br />
- Das zu trennen<strong>de</strong> Gemisch liegt während <strong>de</strong>s Trennvorganges flüssig o<strong><strong>de</strong>r</strong> gasförmig vor<br />
- Die Trennung f<strong>in</strong><strong>de</strong>t an <strong><strong>de</strong>r</strong> Grenzfläche zwischen mobiler und stationärer Phase statt.<br />
- Bei <strong><strong>de</strong>r</strong> SC müssen zwei For<strong><strong>de</strong>r</strong>ungen erfüllt se<strong>in</strong>:<br />
maximale Größe <strong><strong>de</strong>r</strong> Phasengrenzfläche<br />
m<strong>in</strong>imales Volumen <strong><strong>de</strong>r</strong> Säule: - lange, dünne Röhre<br />
- röhrenförmige Zwischenkornvolum<strong>in</strong>a e<strong>in</strong>er Packung<br />
von Feststoffteilchen<br />
Watte<br />
Laufmittel<br />
Sand<br />
Adsorbens<br />
Sand<br />
.<br />
Der Erfolg <strong><strong>de</strong>r</strong> SC-Trennung hängt von folgen<strong>de</strong>n Faktoren ab:<br />
- Selektivität <strong>de</strong>s Systems Adsorbens - Laufmittel<br />
- Betriebsbed<strong>in</strong>gungen : Fließgeschw<strong>in</strong>digkeit, Temperatur, Viskosität <strong>de</strong>s Laufmittels<br />
- Dimension <strong><strong>de</strong>r</strong> Säule:<br />
Säulendurchmesser: 0,5 - 10 cm (abhängig von <strong><strong>de</strong>r</strong> Substanzmenge)<br />
Säulenlänge: 10 - 100 cm (Optimierung nötig von Fall zu Fall)<br />
Teilchendurchmesser: 100 - 200 µm<br />
Durchflussrate: 1 - 10 mL/M<strong>in</strong> (abhängig vom Durchmesser)<br />
Adsorbentien:<br />
- polar:SiO2 (Kieselgel) - amorph, porös, wasserhaltig mit Hydroxygruppen (200 - 800 m 2 /g)<br />
Al2O3 (Alox) - sauer, neutral o<strong><strong>de</strong>r</strong> basisch, (100 - 200 m 2 /g)<br />
MgO - basisch<br />
Mg2SiO4 (Florisil) - enthält saure Oberflächengruppen<br />
Ca5(PO4)3(OH) (Hydroxyapatit)<br />
- unpolar: Aktivkohle - breite Porengrößenverteilung (300 - 1100 m 2 /g)<br />
poröse Polymere - hochpolymere Kunststoffe<br />
11
Elution:<br />
Die mobile Phase trägt nach e<strong>in</strong>er gewissen Zeit e<strong>in</strong>heitliche Zonen aus <strong><strong>de</strong>r</strong> Säule heraus<br />
→ mit Elutionsmittel gemischte Re<strong>in</strong>substanzen wer<strong>de</strong>n eluiert<br />
→ die Reihenfolge ihres Austritts aus <strong>de</strong>m System ist abhängig von <strong><strong>de</strong>r</strong> stoffspezifischen<br />
Verweildauer im System.<br />
Austreten<strong>de</strong> Eluate wer<strong>de</strong>n <strong>in</strong> separaten Vorlagen fraktioniert<br />
→ die Fraktionen e<strong>in</strong>heitlicher Zusammensetzung wer<strong>de</strong>n räumlich vone<strong>in</strong>an<strong><strong>de</strong>r</strong> getrennt<br />
Qualitativer bzw. quantitativer Nachweis <strong><strong>de</strong>r</strong> isolierten Stoffe entwe<strong><strong>de</strong>r</strong><br />
→ <strong>in</strong> Mischung mit Elutionsmittel während <strong><strong>de</strong>r</strong> Elution o<strong><strong>de</strong>r</strong><br />
→ nach <strong><strong>de</strong>r</strong> Elution nach <strong><strong>de</strong>r</strong> Entfernung <strong>de</strong>s Elutionsmittels<br />
<strong>Chromatographie</strong>apparatur<br />
Retention:<br />
Elutionsmittelreservoir<br />
Probenaufgabe<br />
Säule<br />
Detektor<br />
Vorlage<br />
Während die mobile Phase an <strong><strong>de</strong>r</strong> stationären Phase entlang strömt, verweilen die zu<br />
trennen<strong>de</strong>n Moleküle e<strong>in</strong>e Zeitlang an <strong><strong>de</strong>r</strong> stationären Phase.<br />
- Sie wer<strong>de</strong>n gegenüber <strong><strong>de</strong>r</strong> gedachten Lösungsmittelfront zurückgehalten<br />
- Die Moleküle zeigen Retention<br />
- Die Verweilzeit an <strong><strong>de</strong>r</strong> stationären Phase ist artspezifisch<br />
- Je<strong>de</strong> Probekomponente zeigt ihre eigene Retention<br />
<strong>Chromatographie</strong> heißt: häufige Ausnutzung <strong><strong>de</strong>r</strong> artspezifischen Verweildauer auf <strong><strong>de</strong>r</strong><br />
stationären Phase und Verstärkung <strong><strong>de</strong>r</strong> Unterschie<strong>de</strong> im S<strong>in</strong>ne e<strong>in</strong>es Vielstufenprozesses.<br />
- Bildung e<strong>in</strong>heitlicher Substanzzonen, <strong><strong>de</strong>r</strong>en Schwerpunkte und Grenzen immer weiter<br />
vone<strong>in</strong>an<strong><strong>de</strong>r</strong> getrennt s<strong>in</strong>d<br />
- Die Trennung wird dadurch immer schärfer<br />
- Vollständige Trennung: Zwischen zwei Zonen liegt e<strong>in</strong> Volumenelement, das aus re<strong>in</strong>er<br />
mobiler und stationärer Phase besteht.<br />
Stoffe mit o<strong><strong>de</strong>r</strong> ohne Retention: WW zwischen wirksamer Phasengrenzfläche und Molekülen<br />
kann folgen<strong><strong>de</strong>r</strong>maßen ablaufen:<br />
- Moleküle, die zurückgehalten wer<strong>de</strong>n (Stoffe mit Retention). Auf <strong>de</strong>n sorptionsfähigen<br />
Partikel sitzt das Adsorbat, im Zwischenkornvolumen bef<strong>in</strong><strong>de</strong>t sich die zugehörige GG-<br />
Konzentration.<br />
12
- Moleküle, die nicht zurückgehalten wer<strong>de</strong>n (Inertsubstanzen); ke<strong>in</strong>e WW mit stationärer<br />
Phase; Substanz bef<strong>in</strong><strong>de</strong>t sich <strong>in</strong> Zwischenkornvolumen.<br />
Peak:<br />
Die räumliche Aus<strong>de</strong>hnung e<strong>in</strong>er Substanz auf e<strong>in</strong>er Säule wird Zone o<strong><strong>de</strong>r</strong> Peak genannt.<br />
- ke<strong>in</strong>e Differenzierung zwischen <strong><strong>de</strong>r</strong> örtlichen Beladung von stationärer und mobiler Phase,<br />
betrachtet wird nur die räumliche Aus<strong>de</strong>hnung <strong><strong>de</strong>r</strong> Gesamtmasse an Substanz im<br />
chromatographischen System<br />
c<br />
Aufgabepeak<br />
Beim Durchlaufen <strong>de</strong>s Trennbetts wird <strong><strong>de</strong>r</strong> Peak durch Diffusion- und Strömungsphänomene<br />
ause<strong>in</strong>an<strong><strong>de</strong>r</strong>gezogen.<br />
Die Basis <strong><strong>de</strong>r</strong> Glockenkurve wird <strong>in</strong> <strong><strong>de</strong>r</strong> Regel niemals schmaler als die Breite <strong>de</strong>s<br />
Aufgabepeaks (Im Interesse schmaler Ban<strong>de</strong>n und e<strong>in</strong>er guten Auflösung muss <strong><strong>de</strong>r</strong> Aufgabe-<br />
peak möglichst schmal se<strong>in</strong>!).<br />
Darstellung <strong><strong>de</strong>r</strong> Elutionskurven<br />
z<br />
nach kurzer<br />
Laufzeit<br />
To<br />
T<br />
1<br />
T2<br />
nach<br />
längerer<br />
Laufzeit<br />
Üblicherweise wer<strong>de</strong>n Substanzen <strong>in</strong> <strong><strong>de</strong>r</strong> Form <strong>de</strong>tektiert und registriert, <strong>in</strong> <strong><strong>de</strong>r</strong> sie die Säule<br />
verlassen.<br />
I II<br />
c/t bzw. c/R -Diagramm c/R<br />
c<br />
I<br />
A<br />
B<br />
c<br />
B<br />
A<br />
I<br />
c/t<br />
c<br />
I<br />
t<br />
R<br />
III<br />
A<br />
B<br />
c<br />
B A<br />
R<br />
t<br />
IV<br />
I<br />
13
Die t- bzw. R-Achse zählt von rechts nach l<strong>in</strong>ks o<strong><strong>de</strong>r</strong> umgekehrt.<br />
Bei <strong>de</strong>n alten Registriergeräten läuft das Papier meist nach rechts.<br />
Auflösung / Selektivität<br />
Bestimmung <strong><strong>de</strong>r</strong> Flächen<strong>in</strong>halte <strong><strong>de</strong>r</strong> Ban<strong>de</strong>n: Fi = hib0,5i<br />
Def<strong>in</strong>ition <strong><strong>de</strong>r</strong> Selektivität r (relative Retention):<br />
r<br />
2,<br />
1<br />
t'<br />
R2<br />
tR2<br />
− t 0<br />
= =<br />
r gibt die relative Position benachbarter Ban<strong>de</strong>n an<br />
t'<br />
R1<br />
tR1<br />
− t 0<br />
Def<strong>in</strong>ition <strong><strong>de</strong>r</strong> Auflösung R:<br />
R<br />
2,<br />
1<br />
c<br />
t0<br />
tR1<br />
b0,5, 1<br />
tR2<br />
h1<br />
w1<br />
b0,5, 2<br />
2(<br />
tR2<br />
− tR1)<br />
= R = 1 für <strong>de</strong>n Fall, dass sich bei<strong>de</strong> Basisbreiten genau treffen<br />
w1<br />
+ w2<br />
In <strong><strong>de</strong>r</strong> Realität führt <strong><strong>de</strong>r</strong> tatsächliche Kurvenverlauf zu breiteren Ban<strong>de</strong>n (die Trennung ist für<br />
R = 1 noch nicht vollständig).<br />
Um die Auflösung von R = 1 zu erreichen, wer<strong>de</strong>n je nach Selektivität <strong>de</strong>s Trennsystems e<strong>in</strong>e<br />
unterschiedliche Zahl von Trennstufen benötigt.<br />
Entwicklungstechniken <strong><strong>de</strong>r</strong> SC<br />
- Entwicklung: Chromatographischer Vorgang zur Auftrennung e<strong>in</strong>es Substanzgemisches <strong>in</strong><br />
Zonen.<br />
Frontaltechnik: kont<strong>in</strong>uierliches Auftragen <strong>de</strong>s Substanzgemisches auf die Säule, gelöst <strong>in</strong> <strong><strong>de</strong>r</strong><br />
mobilen Phase.<br />
-Nachteil: Die nachfolgen<strong>de</strong>n Fraktionen enthalten Anteile <strong><strong>de</strong>r</strong> ersten Fraktion<br />
(unvollständige Trennung).<br />
- Anwendung: Abtrennung von Spuren aus e<strong>in</strong>er Hauptkomponente, wenn Spuren stark und<br />
die Hauptkomponente kaum adsorbiert wird.<br />
w2<br />
h2<br />
tR<br />
14
cA<br />
- Beispiele: Re<strong>in</strong>igung von Ether an Alox (Spuren: Peroxi<strong>de</strong>, H2O)<br />
Re<strong>in</strong>igung von CHCl3 an Alox (Spuren: Ethanol)<br />
Allgeme<strong>in</strong>e Anwendung: Trocknung von Lösungsmitteln<br />
Elutionsprofil<br />
cB A+B<br />
Verdrängungstechnik: Anwendung bei Substanzen, die von <strong><strong>de</strong>r</strong> stationären Phase stark<br />
adsorbiert wer<strong>de</strong>n (große Menge an mobiler Phase nötig zur Elution).<br />
Zusatz e<strong>in</strong>er Substanz zur mobilen Phase, die noch stärker adsorbiert wird.<br />
Diese Substanz verdrängt an<strong><strong>de</strong>r</strong>e Komponenten aus <strong>de</strong>n Adsorptionsstellen <strong><strong>de</strong>r</strong> stationären<br />
Phase. Die mobile Phase selbst kann zur Verdrängung e<strong>in</strong>gesetzt wer<strong>de</strong>n.<br />
Nachteil: ke<strong>in</strong>e vollständige Trennung<br />
Praktische Anwendung: Ionenaustauschvorgänge<br />
Elution, isokratisch (wichtigste Entwicklungstechnik)<br />
Pr<strong>in</strong>zip: Man lässt solange die mobile Phase durch die Säule fließen, bis die e<strong>in</strong>zelnen<br />
Substanzen die Säule getrennt verlassen haben. Das Substanzgemisch wird diskont<strong>in</strong>uierlich<br />
aufgetragen<br />
Elution ist die Folge <strong><strong>de</strong>r</strong> e<strong>in</strong>zelnen Adsorptions- und Desorptionsvorgänge, die zu GG-<br />
Zustän<strong>de</strong>n führen. Je<strong>de</strong> GG-E<strong>in</strong>stellung wird als theoretische Trennstufe <strong>de</strong>f<strong>in</strong>iert.<br />
cA<br />
cB<br />
A<br />
A<br />
t<br />
t<br />
Für <strong>Chromatographie</strong> auf normaler Phase:<br />
B <strong>1.</strong> Fraktion: A, unpolar<br />
-A unpolarer als B<br />
-A adsorbiert weniger stark als B<br />
-A ersche<strong>in</strong>t als erste Fraktion am Säulenen<strong>de</strong><br />
-danach folgen die Fraktionen <strong><strong>de</strong>r</strong> polareren<br />
Komponenten<br />
2. Fraktion: B, polar<br />
Gradientenelution<br />
Pr<strong>in</strong>zip: Kont<strong>in</strong>uierliche Verän<strong><strong>de</strong>r</strong>ung <strong><strong>de</strong>r</strong> Laufmittelpolarität, diskont<strong>in</strong>uierliche Auftragung<br />
<strong>de</strong>s Substanzgemisches (vgl. isokratische Elution : konstante LM-Polarität).<br />
Effekt <strong><strong>de</strong>r</strong> Gradientenelution: schmalere, höhere Peaks, Verr<strong>in</strong>gerung <strong><strong>de</strong>r</strong> Analysenzeit und<br />
<strong>de</strong>s Laufmittelvolumens<br />
15
c<br />
A<br />
cB<br />
Stufenelution<br />
Pr<strong>in</strong>zip: diskont<strong>in</strong>uierliche Aufgabe <strong>de</strong>s Substanzgemisches<br />
- Entwicklung mit unpolarem LM: polare Substanzen adsorbieren auf stat. Phase sehr stark,<br />
unpolare wer<strong>de</strong>n eluiert.<br />
Entwicklung mit polarem LM. Elution <strong><strong>de</strong>r</strong> polaren Komponenten<br />
7. Gelchromatographie<br />
A<br />
A B<br />
Säulenchromatographisches Trennverfahren, bei <strong>de</strong>m Substanzen nach ihrer Molekülgröße<br />
getrennt wer<strong>de</strong>n. Die zu trennen<strong>de</strong>n Moleküle verteilen sich zwischen <strong><strong>de</strong>r</strong> stationären und <strong><strong>de</strong>r</strong><br />
mobilen Phase.<br />
- mobile Phase → Flüssigkeit außerhalb <strong><strong>de</strong>r</strong> Partikel<br />
- stationäre Phase → Flüssigkeit <strong>in</strong> <strong>de</strong>n Partikeln (zusammen mit <strong><strong>de</strong>r</strong> Matrix)<br />
Pr<strong>in</strong>zip: Verwendung poröser Gele als Säulenmaterial (Matrix). Der Porendurchmesser dieser<br />
Gele liegt <strong>in</strong> e<strong>in</strong>em <strong>de</strong>f<strong>in</strong>ierten Größenbereich. Moleküle, die größer als die Poren <strong><strong>de</strong>r</strong> Matrix<br />
s<strong>in</strong>d, wer<strong>de</strong>n mit <strong><strong>de</strong>r</strong> mobilen Phase ohne Verzögerung durch die Säule transportiert. Kle<strong>in</strong>e<br />
Moleküle diffundieren <strong>in</strong> die Poren <strong><strong>de</strong>r</strong> Matrix und legen dadurch e<strong>in</strong>e größere Wegstrecke<br />
zurück.<br />
Trenneffekt: sterischer Ausschluss, verursacht durch die unterschiedliche Zugänglichkeit<br />
e<strong>in</strong>zelner Porenbereiche im porösen Festkörper.<br />
Gele: Bei Zugabe von Lösungsmittel quellen die vernetzten Makromoleküle (Solvatisierung),<br />
d.h. sie umgeben sich mit e<strong>in</strong>er großen Menge an Lösungsmitteln. Diese wer<strong>de</strong>n durch Dipol-<br />
Dipol-WW fest gehalten.<br />
t<br />
B<br />
16
Quellvermögen: Aufnahme an Gramm Lösungsmittel je Gramm trocken Gel bei <strong><strong>de</strong>r</strong><br />
Gelquellung. Porosität hängt von <strong><strong>de</strong>r</strong> Gesamtkonzentration und <strong><strong>de</strong>r</strong> Menge an bifunktionellem<br />
Reagenz ab. Das Trennvermögen e<strong>in</strong>es Gels beruht auf <strong><strong>de</strong>r</strong> Porenstruktur, <strong><strong>de</strong>r</strong> chemische<br />
Aufbau ist von untergeordneter Be<strong>de</strong>utung: Wasser → hydrophile Gele<br />
organ. Lösungsmittel → organophile Gele<br />
Hydrophile Gele: Poly<strong>de</strong>xtrane, Agarosegele<br />
- Dextrangele: - Han<strong>de</strong>lsname SEPHADEX<br />
- Herstellung: aus Polysaccharid Dextran (1,6-α-glycosidisch verbun<strong>de</strong>ne<br />
Glucose- E<strong>in</strong>heiten); Vernetzung durch Epichlorhydr<strong>in</strong><br />
Cl<br />
O<br />
Dextran Poly<strong>de</strong>xtran (Glycer<strong>in</strong>ether)<br />
je höher die Epichlohydr<strong>in</strong>konzentration, <strong>de</strong>sto<br />
- stärker die Vernetzung<br />
- kle<strong>in</strong>er die Poren <strong>de</strong>s Gels<br />
- ger<strong>in</strong>ger <strong><strong>de</strong>r</strong> Anteil <strong><strong>de</strong>r</strong> hydrophilen OH-Gruppen<br />
- stärker nimmt die Solvatation und damit die Quellung ab<br />
Typenbereich* Durchmesser <strong><strong>de</strong>r</strong> Bettvolumen Fraktionierbereich<br />
(Sepha<strong>de</strong>x) trockenen Partikel pro g Trockengel (Molmasse <strong>in</strong> g/mol)<br />
————————————————————————————————————<br />
G10 40 - 120 µm 2 - 3 mL bis 700<br />
G100 40 - 120 µm 15 - 20 mL 40000 - 150000<br />
G200 40 - 120 µm 20 - 25 mL 50000 - 80000<br />
* gibt an, wie viel mL pro g Trockenmasse aufgenommen wer<strong>de</strong>n (z.B. G10: 10 mL Wasser<br />
/g Trockenmasse<br />
Organophile Gele: Verwendung organischer Laufmittel<br />
- Problem: Benetzung und Solvatisierung <strong><strong>de</strong>r</strong> Poren → Derivatisierung von Dextrangelen:<br />
durch Veretherung <strong><strong>de</strong>r</strong> hydrophilen OH-Gruppen erhält man lipophile Gele<br />
Anfor<strong><strong>de</strong>r</strong>ung an das Gel als Säulenmaterial<br />
- Porengröße muss durch Herstellungsprozess variabel se<strong>in</strong><br />
- ke<strong>in</strong>e spezifische WW <strong>de</strong>s Gels mit <strong>de</strong>n zu trennen<strong>de</strong>n Substanzen<br />
- möglichst ger<strong>in</strong>ge Korngröße (rasche E<strong>in</strong>stellung <strong>de</strong>s Diffusionsgleichgewichts)<br />
Herstellung von Gelen:<br />
- lösliche Makromoleküle wer<strong>de</strong>n durch chemische Umsetzung unlöslich gemacht<br />
- durch Copolymerisation von Monomeren mit e<strong>in</strong>- o<strong><strong>de</strong>r</strong> zwei funktionellen Gruppen<br />
Zusammensetzung e<strong>in</strong>es Gels<br />
- Dispergierte Substanz → Gelbildner: - 3D Netzwerk von Makromolekülen<br />
- die Makromoleküle s<strong>in</strong>d mite<strong>in</strong>an<strong><strong>de</strong>r</strong> verbun<strong>de</strong>n<br />
durch: - H-Brücken<br />
- Dipol-Dipol-WW<br />
- kovalente B<strong>in</strong>dungen<br />
- Dispersionsmittel → Lösungsmittel<br />
17
Anwendung <strong><strong>de</strong>r</strong> Gelchromatographie<br />
- Entsalzen von Prote<strong>in</strong>en<br />
- Trennung von Polymer-, Prote<strong>in</strong>-, und Peptidgemischen<br />
- Abschätzung <strong><strong>de</strong>r</strong> Molekulargewichte annähernd kugelförmiger Makromoleküle<br />
Vorteil <strong><strong>de</strong>r</strong> Gelchromatographie: Wie<strong><strong>de</strong>r</strong>verwendbarkeit / Regenerierbarkeit <strong><strong>de</strong>r</strong> Gele<br />
8. Ionenaustausch - <strong>Chromatographie</strong><br />
Chromatographisches Trennverfahren für Substanzen mit elektrischen Ladungen.<br />
Matrix<br />
(Polymer)<br />
Ankergruppe<br />
(Festion)<br />
Pr<strong>in</strong>zip<br />
- Verwendung e<strong>in</strong>er unlöslichen, polymeren Matrix mit chemisch gebun<strong>de</strong>nen ionischen<br />
Gruppen<br />
- die Gegenionen dieser Gruppen s<strong>in</strong>d durch elektrostatische Kräfte nur locker gebun<strong>de</strong>n<br />
- Gegenionen können gegen Ionen <strong><strong>de</strong>r</strong> mobilen Phase ausgetauscht wer<strong>de</strong>n ( → reversibel)<br />
- <strong><strong>de</strong>r</strong> Prozess beruht also auf <strong>de</strong>n Coulomb'schen Kräften zwischen <strong>de</strong>n Ionen<br />
Differenzierung zwischen Ionenaustausch und Ionenaustausch-<strong>Chromatographie</strong><br />
- Ionenaustausch: Ionenaustauschvorgänge führen zu e<strong>in</strong>em GG-Zustand<br />
→ Anwendung <strong>de</strong>s Massenwirkungsgesetzes (MWG)<br />
bAL a+ + aBM b+ bAM a+ + aBL b+ L = Lösungsmittel ; M = Matrix<br />
[A a+ ]M b • [B b+ ]L a<br />
K = ———————— Stöchiometrie erfüllt !<br />
[B b+ ]M a • [A a+ ]L b<br />
Gegenionen<br />
Trennung beruht beim Ionenaustausch darauf, dass <strong><strong>de</strong>r</strong> GG-Koeffizient für verschie<strong>de</strong>ne<br />
Ionen bzw. Ionenpaare unterschiedlich groß se<strong>in</strong> kann. Ursache: Ionengröße und Ionenladung.<br />
-Ionenaustausch-<strong>Chromatographie</strong>: Der Ionenaustausch kann von Adsorptionsersche<strong>in</strong>ungen<br />
überlagert se<strong>in</strong>; ke<strong>in</strong> stöchiometrischer Verlauf, MWG nicht anwendbar!<br />
18
Ionenaustausch-Matrix<br />
- Anorganische Ionenaustauscher:<br />
Zeolithe → Na-Al-Silikate, <strong>in</strong> <strong><strong>de</strong>r</strong>en Silikatgitter e<strong>in</strong> Teil <strong><strong>de</strong>r</strong> Si-Atome (auch Al-Atome)<br />
ersetzt ist. Durch Alkali- Erdalkalimetalle als Gegenionen wird die fehlen<strong>de</strong><br />
positive Ladung ausgeglichen.<br />
Apatite → ger<strong>in</strong>ge Temperatur- und Druckempf<strong>in</strong>dlichkeit, aber ger<strong>in</strong>ge chemische<br />
Stabilität<br />
- Organische Ionenaustauscher<br />
Cellulose, Dextran → enthalten nach chemischer Behandlung austauschaktive Gruppen wie<br />
-OH, -COOH, -SO3H, ger<strong>in</strong>ge chemische Stabilität.<br />
polymere Kunststoffe → Polymerisations- und Polykon<strong>de</strong>nsationsharze (z.B. Polystyrole), die<br />
austauschaktive Gruppe kann <strong>in</strong> e<strong>in</strong>em Grundstoff enthalten se<strong>in</strong><br />
o<strong><strong>de</strong>r</strong> nachträglich e<strong>in</strong>geführt wer<strong>de</strong>n.<br />
E<strong>in</strong>teilung von Ionenaustauschern<br />
Art <strong>de</strong>s Ionenaustauschers funktionelle Gruppe<br />
—————————————————————————————————————<br />
Kationenaustauscher<br />
stark sauer Sulfonsäure —SO3H<br />
Phosphonsäure —PO(OH)2<br />
schwach sauer Hydroxy-Gruppe —OH<br />
Carboxy-Gruppe —COOH<br />
Anionaustauscher<br />
stark basisch quartäres Am<strong>in</strong> —N + (CH3)3<br />
DEAE —(CH2)2-N + H(C2H5)2<br />
(DiEthylAm<strong>in</strong>oEthyl)<br />
schwach basisch primäre Am<strong>in</strong>ogruppe —NH2<br />
sekundäre Am<strong>in</strong>ogruppe —NH<br />
│<br />
tertiäre Am<strong>in</strong>ogruppe —N—<br />
│<br />
Charakterisierung von Ionenaustauschern<br />
- physikalische Stabilität → Festigkeit, thermische Beständigkeit<br />
- chemische Stabilität → Beständigkeit gegen pH-Wert o<strong><strong>de</strong>r</strong> Oxidationsmittel<br />
- Korngröße → 0,04 - 1 mm<br />
- Grad <strong><strong>de</strong>r</strong> Vernetzung → mittlere Vernetzungsgrad als Kompromiss<br />
- Porosität → Maschenweite <strong>de</strong>s Austauschnetzwerks, bee<strong>in</strong>flusst Kapazität und Selektivität<br />
- Quellung → Volumenvergrößerung durch Wasseraufnahme<br />
- Kapazität → gibt an, wieviel Gegenionen e<strong>in</strong>e bestimmte Menge e<strong>in</strong>es Ionenaustauschers<br />
aufnehmen kann<br />
- Selektivität → Möglichkeit von Trennungen aufgrund unterschiedlicher GG-Konstanten<br />
Selektivitätsreihen:<br />
K + Li-H-Na-NH4 + -K-Rb-Cs-Ag-Tl<br />
K 2+ Mg-Zn-Co-Cu-Cd, Ni-Ca-Sr-Pb-Ba<br />
K 3+ Al-Sc-Y-Ce-La<br />
Anionen Acetat-F-OH-Cl-SCN-Br-CrO4-NO3-I-Oxalat-Sulfat-Citrat<br />
('rechts verdrängt l<strong>in</strong>ks!')<br />
19
9. Elektrophorese<br />
Trennverfahren, bei <strong>de</strong>m die Wan<strong><strong>de</strong>r</strong>ung elektrisch gela<strong>de</strong>ner Moleküle im elektrischen Feld<br />
zur Trennung ausgenutzt wird.<br />
Pr<strong>in</strong>zip<br />
- Elektrisches Feld wirkt auf gela<strong>de</strong>ne Teilchen e<strong>in</strong><br />
- Teilchen mit verschie<strong>de</strong>nem Ladung/Masse-Verhältnis bewegen sich dar<strong>in</strong> unterschiedlich<br />
schnell.<br />
- Je nach Ladung bewegen sich die Moleküle <strong>in</strong> unterschiedliche Richtungen (Katho<strong>de</strong> -<br />
Ano<strong>de</strong>).<br />
Voraussetzung<br />
Gela<strong>de</strong>ne Moleküle, z.B. Säuren R-COO -<br />
R<br />
H<br />
NH 2<br />
COO -<br />
H +<br />
H +<br />
R-COOH<br />
Basen R-NH + 3 R-NH2 + H +<br />
Am<strong>in</strong>osäuren (amphoter)<br />
R<br />
H<br />
NH 2<br />
COOH<br />
H + R COOH<br />
H<br />
+ NH<br />
3<br />
R COO<br />
NH<br />
3<br />
-<br />
basisch sauer<br />
H<br />
+<br />
Die Gegenwart e<strong>in</strong>es Puffers mit Leitsalzen vermei<strong>de</strong>t die Abscheidung <strong><strong>de</strong>r</strong> Substanzen an<br />
<strong>de</strong>n Elektro<strong>de</strong>n. Prote<strong>in</strong>e und Am<strong>in</strong>osäuren s<strong>in</strong>d beson<strong><strong>de</strong>r</strong>s geeignet, da über <strong>de</strong>n pH-Wert die<br />
Dissoziation bee<strong>in</strong>flusst wer<strong>de</strong>n kann. Die Ladung von Prote<strong>in</strong>en bei e<strong>in</strong>em bestimmten pH-<br />
Wert ist abhängig von <strong><strong>de</strong>r</strong> Anzahl <strong><strong>de</strong>r</strong> basischen (z.B. Lys<strong>in</strong>, Histid<strong>in</strong>) und sauren<br />
Am<strong>in</strong>osäuren (z.B. Asparag<strong>in</strong>säure, Glutam<strong>in</strong>säure) <strong>in</strong> <strong><strong>de</strong>r</strong> Sequenz. E<strong>in</strong> Prote<strong>in</strong><br />
(Eiweißmolekül) ist e<strong>in</strong> amphoterer Polyelektrolyt, <strong>de</strong>ssen Nettoladung abhängig ist vom pH-<br />
Wert und <strong><strong>de</strong>r</strong> Molekülstruktur.<br />
Trägerfreie Elektrophorese: Problem: Fixierung nach erfolgter Trennung<br />
Trägergebun<strong>de</strong>ne Elektrophorese<br />
Papierelektrophorese: Papier als kapillares Trägersystem wird mit Puffer getränkt<br />
Nie<strong><strong>de</strong>r</strong>spannungselektrophorese -1000 V<br />
Hochspannungselektrophorese - 1000 - 3000 V<br />
20
Nachteil: Erwärmung durch Reibung <strong><strong>de</strong>r</strong> Ionen (Joul'sche Wärme), also e<strong>in</strong>e gute Kühlung ist<br />
notwendig<br />
Heute wer<strong>de</strong>n meist Flachbettgele als Träger benutzt wie Stärke, Cellulose, Sepha<strong>de</strong>x,<br />
Polyami<strong>de</strong>, Agarose<br />
10. Aff<strong>in</strong>itätschromatographie<br />
Trennung von Substanzen mit Hilfe selektiver o<strong><strong>de</strong>r</strong> spezifischer WW-Kräfte.<br />
Pr<strong>in</strong>zip: An <strong>in</strong> Wasser schwerlösliche Materialien (z.B. Agarose, Cellulose, Glaskugeln)<br />
wer<strong>de</strong>n bestimmte Ligan<strong>de</strong>n kovalent gebun<strong>de</strong>n, so dass dieses modifizierte Material nur jene<br />
Substanzen adsorbiert, die e<strong>in</strong>e "Aff<strong>in</strong>ität" zu <strong>de</strong>m betreffen<strong>de</strong>n Ligan<strong>de</strong>n aufweisen. Durch<br />
Än<strong><strong>de</strong>r</strong>ung <strong>de</strong>s Trennmediums (pH, Temperatur, Ionenstärke) kann <strong><strong>de</strong>r</strong> spezifische Komplex<br />
wie<strong><strong>de</strong>r</strong> gelöst wer<strong>de</strong>n.<br />
Matrix<br />
Anwendung: Abtrennung / Re<strong>in</strong>igung biologischer Makromoleküle durch WW zwischen<br />
Enzym - Substrat; Enzym - Cofaktor; Enzym - Inhibitor; Antigen - Antikörper; Rezeptor -<br />
Hormon; DNA / RNA - komplementäre DNA / RNA<br />
1<strong>1.</strong> Gaschromatographie<br />
Ligand<br />
Spacer<br />
(C6-C12-Kette)<br />
Pr<strong>in</strong>zip: Verteilung von flüchtigen Substanzen zwischen <strong><strong>de</strong>r</strong> gasförmigen mobilen Phase und<br />
e<strong>in</strong>er festen (SGC) o<strong><strong>de</strong>r</strong> flüssigen (LGC) Phase.<br />
Vorteile: - niedrige Viskosität <strong><strong>de</strong>r</strong> mobilen Phase, daher hohe Diffusionsgeschw<strong>in</strong>digkeiten<br />
<strong><strong>de</strong>r</strong> zu trennen<strong>de</strong>n Substanzen und schnelle E<strong>in</strong>stellung <strong><strong>de</strong>r</strong> Gleichgewichte zwischen <strong>de</strong>n<br />
Phasen<br />
- kurze Analysenzeiten durch hohe Strömungsgeschw<strong>in</strong>digkeiten <strong>in</strong> langen Trennsäulen mit<br />
ger<strong>in</strong>gem Strömungswi<strong><strong>de</strong>r</strong>stand.<br />
Durchführung: E<strong>in</strong> Gas, e<strong>in</strong>e verdampfbare Flüssigkeit o<strong><strong>de</strong>r</strong> e<strong>in</strong> verdampfbarer Feststoff wird<br />
<strong>in</strong> e<strong>in</strong>e Trennsäule gegeben. Dort wer<strong>de</strong>n die zu trennen<strong>de</strong>n Substanzen mit Hilfe e<strong>in</strong>es<br />
Trägergas durch e<strong>in</strong>e thermostatisierte Säule transportiert, wo <strong><strong>de</strong>r</strong> chromatographische<br />
21
Vorgang stattf<strong>in</strong><strong>de</strong>t. Die getrennten Substanzen passieren dann nache<strong>in</strong>an<strong><strong>de</strong>r</strong> am Säulenen<strong>de</strong><br />
e<strong>in</strong>en Detektor, <strong><strong>de</strong>r</strong> über e<strong>in</strong>en Schreiber die e<strong>in</strong>zelnen Bestandteile anzeigt.<br />
Trennsäulen: <strong>in</strong>nerer Durchmesser (3-8 mm), Länge (1-6 m), Material: Cu, Stahl, Glas, Quarz<br />
-stationäre Phase: Adsorptions-GC: Aktivkohle, Kieselgel, Ionenaustauscher, poröse<br />
Polymere<br />
Verteilungs-GC: Trägermaterialien wie Kieselgel, Glaskugeln o<strong><strong>de</strong>r</strong> Teflon,<br />
auf <strong>de</strong>nen die flüssige stat. Phase (z.B. Siliconöle, Poly-<br />
ethylenglycole) gleichmäßig verteilt ist.<br />
Detektoren: Wärmeleitfähigkeits- Flammenionisations- Elektronene<strong>in</strong>fang<strong>de</strong>tektor.<br />
Kapillar-GC: Säulendurchmesser (0,1-1 mm), Länge (30-300 m)<br />
- Säulen enthalten ke<strong>in</strong> Trägermaterial für die Trennflüssigkeit.<br />
- zur Trennung sehr komplexer Stoffgemische und zur Spurenanalyse.<br />
- ger<strong>in</strong>ge Belastbarkeit (0,1 - 1 µL Probenmenge)<br />
1<strong>1.</strong> HPLC [High Performance (o<strong><strong>de</strong>r</strong> Pressure) Liquid Chromatography]<br />
Automatische Hochdruck-Flüssigkeitschromatographie <strong>in</strong> Säulen mit <strong><strong>de</strong>r</strong> Fähigkeit für<br />
hochauflösen<strong>de</strong> Trennungen <strong>in</strong>nerhalb weniger M<strong>in</strong>uten bis zu e<strong>in</strong>er Stun<strong>de</strong>.<br />
Größe <strong><strong>de</strong>r</strong> Packungsteilchen: 5-10 µm → bessere Trennungen wegen ger<strong>in</strong>geren Trennstufen-<br />
höhen, aber Probleme durch die Möglichkeit <strong>de</strong>s<br />
Verstopfens <strong><strong>de</strong>r</strong> Säule<br />
Druckbereich: 20-400 atm<br />
Trennsäulen: Durchmesser (2-5 mm, analytische Säulen), Länge (5-50 cm), Material (Glas,<br />
E<strong>de</strong>lstahl, Tantal, Kupfer)<br />
Aufbau e<strong>in</strong>er HPLC-Apparatur: Pumpe - E<strong>in</strong>spritzsystem (Probenaufgabe) - Trennsäule mit<br />
Füllung - Detektor - Fraktionssammler<br />
Säulenmaterial: druckstabile poröse Teilchen (z.B. Kieselgel, Alox)<br />
gleichmäßige Siebfraktionen<br />
Literatur:<br />
Veronika R. Meyer: Practical High-Performance Liquid Chromatography, Wiley, Chichester,<br />
1996.<br />
22