Solubilisierung stark lipophiler Arzneistoffe in lipidhaltige ...

Kapitel III Experimenteller Teil
III.10 Gehaltbestimmung mittels Flüssigszintillationsmessung
Transportuntersuchungen mit Hilfe der Ussing-Kammer-Methode wurden teilweise mit
tritiummarkiertem Testosteron [ 3 H]T der spezifischen Radioaktivität 3515 GBq/mM von
Life Science Products, Inc. (Perkin-Elmer, Boston, MA, USA) durchgeführt. Die frisch
hergestellte radioaktive Verbindung wurde in ethanolischer Lösung der durchschnittlichen
Radioaktivität 37 MBq/ml (1 mCi/ml) geliefert und bei –20 °C gelagert. Etwa 24 h
vor dem Versuch wurden 2 µl der ethanolischen radioaktiven Lösung mit Hilfe einer
Mikropipette entnommen, die dann mit 16 ml Probelösung versetzt und durchmischt
(Vortex®-Gerät) wurden. Die Mischung wurde daraufhin bis zum nächsten Tag zur
Equilibrierung im Kühlschrank gelagert.
Direkt vor Zugabe des Systems in das Donatorkompartiment (t = 0 min) wurden 200-µl-
Proben aus ihm entnommen und für die Radioaktivitätsmessungen wie die restlichen
Proben vorbereitet. Während des Versuchsverlaufes wurden in den vorgesehenen Zeiten
mithilfe einer Eppendorf-Pipette aus Donator- und Akzeptorkompartimenten jeweils
200 µl entnommen und durch gleiches Volumen vom wirkstofffreien Lösungsmittel
ersetzt. Die Proben wurden direkt in 5 ml Szintillationsgefäße (Packard, USA) gefüllt, mit
3 ml Szintillationscocktail Rotiszint® eco plus (Carl Roth GmbH & Co, Karlsruhe) versetzt,
durchmischt (Vortex®) und vermessen. Für die Bestimmung des Gehalts an
aufgenommenem [ 3 H]T in den Membranen wurden die Dünndarmabschnitte möglichst
schnell nach Versuchsende vorsichtig aus den ausgebauten Zellen entnommen, mit
eiskaltem KRPB gut gespült und in die Szintillationsgefäße überführt. Die Dünndarmstücke
wurden mit je 1 ml ILP lysiert, mit 3 ml Flüssigszintillator versetzt, durchmischt
und vermessen.
Die Radioaktivitätsmessungen erfolgten mit Flüssigszintillationszähler TRI-CARB 2100
TR Liquid Scintillation Analyzer von Packard (USA).
Beim Zerfall eines β-Strahlers wie des Isotops Tritium entstehen Elektronen, deren
Energien im Flüssigszintillatoren Lichtblitze (Lumineszenzen) erzeugen. Das Lumineszenzlicht
trifft auf die Photokathode des Photovervielfachers und erzeugt dort Photoelektronen,
die in Spannungsimpulse umgewandelt werden. Das Signal wird als CPM
(Counts Per Minute) oder nach Quench-Korrektur als DPM (Decays Per Minute)
registriert, von dem schließlich die Hintergrundaktivität (Leerwert) subtrahiert wird.
Das Gehalt an T in der Probe ist proportional zu ihrer gemessenen Radioaktivität und
kann deshalb direkt daraus errechnet werden, ohne das vorhergehende Aufnehmen von
Verdünnungsreihen. Dafür werden jedoch die Radioaktivität im untersuchten System vor
dem Versuchsbeginn und die Vorkenntnis seiner ursprünglichen Konzentration von T
benötigt.
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