Solubilisierung stark lipophiler Arzneistoffe in lipidhaltige ...

Kapitel III Experimenteller Teil
weisend, mit schrägen Nadeln auf einem Parafilmstück in einer Agarplatte eingespannt.
Die mit Nadeln bestückte Kammerseite wurde dann auf das Darmstück gedrückt, so
dass es anschließend nach Zusammensetzung der Kammerhälfte zwischen den beiden
Hälften eingespannt blieb und eine Barriere dazwischen bildete. Auf diese Weise
entstand eine serosale und eine mukosale Hälfte. Die Folie diente zur Gewährleistung
gleichmäßiger Spannung der Membran und wurde vor der Zusammensetzung der
Kammerhälfte entfernt. Nach dem Einspannen des Epithels wurde die Zelle unverzüglich
in die Versuchsapparatur eingesetzt und an eine Carbogenflasche angeschlossen. 5 ml
tensidfreie KRBP Lösung kam in die mukosale Seite und 5 ml BSA/KRBP in die
Serosale. Danach schloss sich eine 15-minütige Equilibrierungsphase an. Die mizellaren
Systeme für diese Untersuchungen wurden 24 h vor dem Versuch in KRBP Lösung
hergestellt. Die Lösung auf der mukosalen Seite wurde durch das zu untersuchende, auf
37 °C temperierte mizellare System ersetzt. Gerade vor und nach Zugabe des Systems in
die DK erfolgte mit einer Eppendorf-Pipette eine 200-µl-Probenentnahme von der
Donator- und der Akzeptorlösung und dann nach jeweils 20, 40, 60, 90, 120, 180 min
ab Systemzugabe bzw. Versuchsbeginn (t=0 min). Die entnommenen Lösungen aus
den Kammern wurden dann sofort durch 200 µl KRBP bzw. BSA/KRBP ersetzt. Die
gerade vor Versuchsbeginn entnommene KRBP-Probe aus der DK und die ebenso
BSA/KRBP-Probe aus der AK galten als Blindwerte der entsprechenden Proben.
Anhand der Leitfähigkeitsmessungen während der Vorversuche wurde festgestellt, dass
die Spannungsklemme „voltage clamp“ einen negativen Einfluss auf die Vitalitätsdauer
der Membranen hat. Davon ausgehend und da es sich in dieser Arbeit um die
Resorption von nichtionischen Wirkstoffen handelte, bei denen normalerweise die
passiven Transportprozesse die Hauptrolle spielen und hier deshalb zu untersuchen
waren, wurden die Epithele im Verlauf der Untersuchungen nicht kurzgeschlossen.
Durch Probenahmen auf beiden Membranseiten kam es zu einer Verringerung der
vorliegenden Wirkstoffkonzentrationen. Dies wurde durch Korrektur um die entsprechenden
Mengen gemäß Gl. III.8-1 ausgeglichen. Jeder Versuch wurde mit drei
parallelen Wiederholungen in drei Zellen durchgeführt. Für die Bestimmung des
aufgenommenem Testosteronesters in den Membranen wurden die Dünndarmabschnitte
möglichst schnell nach Versuchsende vorsichtig aus den ausgebauten Zellen
entnommen, mit eiskaltem KRPB gespült und in mit Schliffhals versehene Reagenzgläser
überführt, die nach Zugabe von Reagenzien mit Glasstopfen dicht verschlossen
wurden. Die Dünndarmstücke wurden 30 min bei 60 °C jeweils mit 1 ml harnstoffhaltigem
(100 mg/ml) ILP in einem Ultraschallwasserbad inkubiert. Danach wurde die
Mischung mit 3 ml n-Hexan (HPLC-Grad) versetzt und 60 min in einer Rüttelapparatur
geschüttelt. Nach Abkühlung im Kühlschrank wurden die Reagenzgläser 40 min bei
3000 U/min zentrifugiert. Der klare Überstand wurde durch Spritzenmembranfilter
(PTFE, 0,45 µm) filtriert. Dabei wurde angenommen, dass sich die untersuchten
Steroide vollständig in der organischen Phase befanden. Davon wurde eine 1,5-ml-Probe
in HPLC-Fläschchen eingefüllt und in einem Exikkator unter Vakuum zum Verdunsten
belassen. Anschließend wurde der Rückstand in MeOH aufgelöst und mit Hilfe der
Methode HPLC-2 ( III.5) analysiert.
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