Solubilisierung stark lipophiler Arzneistoffe in lipidhaltige ...

Kapitel III Experimenteller Teil
Proben wurden ACN, MeOH und EtOH miteinander verglichen. Die Proben wurden
jeweils mit 100 mg/ml Harnstoff versetzt und 30 min bei 60 °C im Wasserbad inkubiert.
Harnstoff diente zur Denaturierung bzw. Entfaltung der Albumine und sollte deswegen
die Extraktion der gebundenen Moleküle verbessern. Harnstoff sollte auch die Dichte der
Endprobe erhöhen und damit zu schmaleren Peaks im Chromatogramm führen [231].
Die Proben wurden anschließend 60 min bei 40 °C im Ultraschallbad mit dem
organischen Lösungsmittel 1:1 oder 1:2 (V/V) inkubiert, um BSA und Puffersalze zu
fällen und die gebundenen Steroide zu extrahieren. Die Mischung wurde danach 30 min
bei 2500 U/min zentrifugiert. Anschließend wurde der klare Überstand durch einen
Spritzenfilter (0,45 µm) filtriert. Die Proben wurden nach der Methode HPLC-2
gemessen. Zur quantitativen Auswertung wurden die Peaks der Substanzen bei der
entsprechenden Wellenlänge integriert. Die erhaltenen Flächen wurden dann statistisch
ausgewertet. Daraus ergaben sich die folgenden Retentionszeiten (t R) (Tabelle 6). Das
resultierende Chromatogramm ist in Abb. 10 dargestellt.
Tabelle 6 ermittelte Retentionszeiten verschiedener Testosteronderivate in den
aufgearbeiteten BSA/KRBP-Proben nach Methode HPLC-2
T TP TE TU
t R, 243 nm ± SA, n t R, 241nm ± SA, n t R, 240 nm ± SA, n t R, 240nm ± SA, n
8,52±0,03 min, 32 9,89±0,02 min, 32 11,16±0,03 min, 29 13,01±0,16 min, 29
Für die Erstellung der Kalibrierkurve in dieser Phase der Arbeit wurden 6
Konzentrationen im Bereich von 2-12 µg/ml ausgehend von einer Stammlösung in ACN
als Lösungsmittel hergestellt. Die Kalibrierproben wurden mit der o.g. HPLC-Methode
analysiert (Abb. 9). Es erfolgte dabei eine Dreifachbestimmung. Die Wiederfindungsraten
sind in Abb. 8 dargestellt. Basierend auf diesen Ergebnissen wurden die Methoden A2
und E2 für die Aufarbeitung der Proben ausgewählt. Mit dem lipophileren ACN war
allerdings die Fällung der Puffersalze effektiver. Daher war seine Verwendung bei der
Extraktion sicherer für die HPLC-Anlage. Außerdem wies die Methode mit ACN eine
rauschfreiere Basislinie auf, da es auch im Laufmittel verwendet wurde. Da der
Unterschied zwischen den Wiederfindungsraten beider Methoden klein war, während die
Kosten und die anderen o.g. praktischen Gründe gegen den Einsatz vom EtOH
sprachen, wurde die Methode A2 schließlich vorgezogen.
III.5.2.2 Analytik der BSA/KRBP-Proben und Überprüfung der Wiederholpräzision
Als Blindwert diente hier die reine testosteronfreie BSA/KRBP-Lösung. Der Blindwert und
eine BSA/KRBP-Probe mit T oder einem seiner Ester in Konzentration von 20 µg/ml
wurden wie in III.5.2.1 hergestellt und anschließend nach A2 vorbereitet. Die Aufarbeitung
wurde für die Bestimmung der Wiederholpräzision sechs mal pro die 20 µg/ml
steroidhaltige BSA/KRBP-Probe wiederholt. Die Kalibrierproben in BSA/KRBP wurden
unabhängig von einander in Konzentrationen von 5, 10, 15, 20, 25 und 30 µg/ml
ebenso wie in III.5.2.1 hergestellt und nach Methode A2 vorbereitet. Weiterhin wurden
BSA/KRBP-Proben 6 h bei 37 °C mit einem Überschuss von T bzw. seinen Estern zum
Sättigen geschüttelt. Anschließend wurden sie filtriert (0,45 µm Spritzenfilter) und
danach für die Messung je nach Bedarf mit BSA/KRBP verdünnt.
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