Solubilisierung stark lipophiler Arzneistoffe in lipidhaltige ...
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Kapitel III Experimenteller Teil<br />
Tabelle 4 Angewandte isokratische HPLC-Methode für die<br />
Gehaltsbestimmung der verschiedenen untersuchten Steroide <strong>in</strong><br />
mizellaren Tensidsystemen<br />
TD<br />
λ max<br />
[nm]<br />
Eluent<br />
MeOH/H 2O<br />
Durchflussrate<br />
[ml.m<strong>in</strong>]<br />
Temperatur<br />
[°C]<br />
T 244 70:30 1,2 40<br />
TP 242 85:15 1,2 40<br />
TE 242 90:10 1,2 30<br />
TU 242 95:5 1,3 45<br />
Methode HPLC-2 (Gradientelution): Die Methode wird <strong>in</strong> der Tabelle 5<br />
zusammengefasst.<br />
Tabelle 5 Funktionsparameter der HPLC-Analyse und Programm der Laufmittelpumpe<br />
Säule (Stationäre<br />
Phase)<br />
Laufmittel (mobile<br />
Phase)<br />
XTerra® RP 18 3,5 µm,<br />
3,9x100 mm, Waters, USA<br />
A: ACN/H 2O (25:75)<br />
B: ACN/H 2O (95:5)<br />
Messzeit<br />
[m<strong>in</strong>]<br />
Anteil Laufmittel<br />
B [%]<br />
Flussrate<br />
[ml.m<strong>in</strong> -1 ]<br />
0 0 0,8<br />
Flussrate 0,8 ml.m<strong>in</strong> -1<br />
1 100 0,8<br />
Säulentemperatur 40 °C 7 100 0,8<br />
Pumpensystem<br />
Waters Delta 600 + Waters<br />
600 Controller<br />
8 100 0,9<br />
Autosampler Waters 717 Plus Autosampler<br />
Waters 2996, Photodiode<br />
9 0 0,9<br />
Detektion<br />
Array Detector,<br />
λ=230-260 nm<br />
15 0 0,9<br />
Injektionsvolumen 20 µl 16 0 0,8<br />
Software<br />
Masslynx V3.5, Micromass<br />
Ltd., Manchester, UK<br />
18 0 0,8<br />
III.5.2 Analytik der BSA/KRBP-Lösung<br />
Die Modellierung des Transports <strong>in</strong>-vitro erfolgte mit Hilfe der Uss<strong>in</strong>g-Kammer-Technik.<br />
Für die Aufnahme transportierter Steroide im AK wurde e<strong>in</strong>e BSA-Lösung (BSA =<br />
bov<strong>in</strong>e serum albom<strong>in</strong>) <strong>in</strong> KRBP benutzt. Die Anwendung von BSA (4%) auf der<br />
basolateralen Seite sorgte für notwendige Absorptionskräfte, die dadurch e<strong>in</strong><br />
Konzentrationsgefälle wie <strong>in</strong>-vivo bewirkten. Außerdem sollte dies laut Krishna et al.<br />
[230] e<strong>in</strong>e bessere Wiederf<strong>in</strong>dung (recovery) und P app (sche<strong>in</strong>bare Permeabilität) für <strong>stark</strong><br />
lipophile prote<strong>in</strong>-b<strong>in</strong>dende Stoffe ergeben.<br />
III.5.2.1 Entwicklung der Aufarbeitungsmethode<br />
Bei Versuchen <strong>in</strong> der Uss<strong>in</strong>g-Kammer musste aus dem o.g. Grund e<strong>in</strong>e HPLC-Methode<br />
für die Konzentrationsbestimmung von T, TP, TE und TU <strong>in</strong> der BSA/KRBP-Lösung<br />
entwickelt werden. Bei der Probenvorbereitung mussten die Wiederf<strong>in</strong>dungsraten und<br />
die Wiederholpräzision optimiert werden. Dafür wurde zunächst die BSA-Lösung im<br />
KRBP (4% W/V) hergestellt. E<strong>in</strong>e Lösung von T bzw. Testosteronestern <strong>in</strong> EtOH (10<br />
mg/ml) wurde mit BSA/KRBP im Verhältnis 1:500 versetzt (entsprechend e<strong>in</strong>er<br />
Endkonzentration von 20 µg/ml) und 30 m<strong>in</strong> bei 37 °C <strong>in</strong>kubiert. Die Änderung an<br />
Probevolumen war hier ger<strong>in</strong>gfügig und wurde deshalb vernachlässigt. Für die Auswahl<br />
des am besten geeigneten organischen Lösungsmittels für die Aufarbeitung der BSA-<br />
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