Molekulare Alteration im E-Cadherin Gen bei malignen Melanomen ...

Molekulare Alteration im E-Cadherin Gen
bei malignen Melanomen
und kolorektalen Karzinomen
Von der Medizinischen Fakultät
der Rheinisch-Westfälischen Technischen Hochschule Aachen
zur Erlangung des akademischen Grades
einer Doktorin der Medizin
genehmigte Dissertation
vorgelegt von
Alinda Dalma Varnai
aus
Pecs, Ungarn
2003

Molekulare Alteration im E-Cadherin Gen bei malignen Melanomen
und kolorektalen Karzinomen
Von der Medizinischen Fakultät
der Rheinisch-Westfälischen Technischen Hochschule Aachen
zur Erlangung des akademischen Grades
einer Doktorin der Medizin
genehmigte Dissertation
Berichter: Herr Professor
Dr.med. Reinhard Büttner
Herr Universitätsprofessor
Dr.med. Christian Mittermayer
Tag der mündlichen Prüfung: 24. Juni 2003
vorgelegt von
Alinda Dalma Varnai
aus
Pecs, Ungarn
Diese Dissertation ist auf den Internetseiten der Hochschulbibliothek online
verfügbar

Meinen Eltern

I. INHALTSVERZEICHNIS
Abkürzungen 7
II. EINLEITUNG
II.1. Tumorentwicklung und Tumorprogression 8
II.2. Zelladhäsionsmoleküle 11
II.3. E-Cadherin 12
II.4. Rolle des E-Cadherin in der Tumorinvasion 17
II.5. Das maligne Melanom 19
II.6. Das kolorektale Karzinom 24
III. AUFGABENSTELLUNG 30
IV. MATERIAL UND METHODEN
IV.1. Puffer, Medien und Lösungen 31
IV.2. Materialien
IV.2.1 Chemikalien und Lösungen 33
IV.2.2 Molekulargewichtsstandard 34
IV.2.3 Geräte und Materialien 35
IV.2.4 Primer 36
IV.2.5 Zelllinien 37
IV.3. Molekularbiologische Methoden
IV.3.1 Kultivierung von eukaryontischen Zellen 38
IV.3.2 DNA- Isolierung 38
IV.3.3 Polymerase-Ketten-Reaktion (PCR) 39
IV.3.4 Gelelektrophorese 40
IV.3.5 PEG-Fällung 40
IV.3.6 Sequenzierung (cycle sequencing) 41
V. ERGEBNISSE 42
5

VI. DISKUSSION 52
VII. ZUSAMMENFASSUNG 57
VIII. LITERATURVERZEICHNIS 59
IX. ANHANG 68
6

ABKÜRZUNGEN
APC adenomatöse Polyposis coli
cDNA copyDNA
CO2 Kohlendioxid
DCC deleted in colorectal cancer
DMSO Dimethylsulfoxid
DNA Desoxyribonukleinsäure
dNTP Desoxynukleotidtriphosphat
EtBr Ethidiumbromid
EtOH Ethanol
EDTA Ethylendiamintetraacetat
FAP familiäre adenomatöse Polyposis
FKS fötales Kälberserum
HNPPC hereditäres non-polypöses kolorektales Karzinom
MMR mismatch repair
PBS phosphat buffered saline
PCR Polymerase-Chain-Reaction
PEG Polyethylenglycol
p53 Protein 53
Taq Termophilus aquaticus
TBE Tris-Borsäure-EDTA
Tris Tris-(hydroxymethyl)-aminomethan
TSR Template Suppression Reagent
7

II. EINLEITUNG
II.1 Tumorentwicklung und Tumorprogression
In manchen populärwissenschaftlichen Veröffentlichungen wird der Begriff „Tumor“
fälschlicherweise stets als Oberbegriff für alle Formen obligat maligner Erkrankungen
verwandt. Nach wissenschaftlicher Definition aber beinhaltet der Begriff „Tumor“
lediglich die abnorme Vergrößerung eines Gewebes, welche durch autonome,
progressive und überschießende Proliferation von körpereigenen Zellen entsteht (Riede
et al, 1989).
Der Begriff „Tumor“ sagt allerdings nichts über das biologische Verhalten (=Dignität)
dieser Geschwulst (=Neoplasie) aus, was sich am besten durch den klinischen Verlauf
beurteilen lässt. Diesbezüglich unterscheidet man gutartige und bösartige Tumoren.
Gutartige (=benigne) Tumoren sind dadurch gekennzeichnet, dass sie langsam,
verdrängend und expansiv wachsen, in vielen Fällen kommt es kaum zur
Beeinträchtigung des Gesamtorganismus und histologisch bestehen sie meistens aus
ausgereiftem Gewebe, das sich kaum vom Ursprungsgewebe unterscheiden lässt.
Bösartige (=maligne) Tumoren hingegen zeichnen sich durch infiltratives Wachstum und
Destruktion des umgebenden Gewebes, durch die Fähigkeit zur Metastasenbildung aus
und sie neigen zu Rezidivbildung. Klinische Symptome fehlen nie, treten aber meist erst
im fortgeschrittenen Stadium auf. Histologisch bestehen bösartige Tumoren aus einem
Gewebe, das je nach Differenzierungsgrad nur noch annähernd dem Ursprungsgewebe
gleicht.
8

Die Zellen und ihre Zellkerne weisen dabei die für Malignome typische Veränderungen
auf wie Zell- und Kernpolymorphie, Kernpolychromasie, Verschiebung der Kern-
Plasma- Relation zugunsten des Zellkerns und Nukleolenvergrößerung (Riede et al.,
1989).
Die kausale Pathogenese menschlicher Tumoren ist bislang nur in ersten Ansätzen
geklärt.
Bei manchen Tumoren beobachtet man eine familiäre Häufung. Es gibt Tumoren, die
nach den Mendelschen Regeln vererbt werden, wie z.B. die Familiäre Polyposis Coli
(FAP). Anderseits gibt es Tumorerkrankungen mit familiärer Häufung, ohne dass ein den
Mendelschen Regeln entsprechender Erbgang erkennbar ist, wie häufig bei kolorektalen
Karzinomen; hier ist das Zusammenspiel von genetischer Disposition und
Umweltfaktoren evident (Perera, 1997).
Eine Fülle tierexperimenteller Untersuchungen und epidemiologischer Beobachtungen
weisen darauf hin, dass chemische Verbindungen (wie z.B. polyzyklische aromatische
Kohlenwasserstoffe, Nitrosamine oder Aflatoxine), ionisierende Strahlen,
Sauerstoffradikale und Viren krebserzeugend oder krebsfördernd sind. Solche Noxen
werden als Karzinogene (=Kanzerogene) bezeichnet. Karzinogene können zu
Mutationen in der DNA führen (Wagener, 1999).
Der Gedanke, dass die maligne Entartung einer Zelle auf Veränderungen des Genoms,
d.h. auf einer Mutation, beruht, wurde bereits von Boveri (1914) und Bauer (1928)
formuliert.
Strukturelle Veränderungen der DNA wie z.B. Punktmutationen, Deletionen oder
Frameshift-Mutationen führen zu einer Beeinträchtigung der DNA-Synthese oder der
Transkription, zur Änderung der DNA-Konformation, zur Genamplifikation wie auch zu
genetischem Rearrangement (Riede et al., 1989).
9

Versagen die zellulären physiologischen Reparatur- und Tumorsupressormechanismen
so ist mit einer genetisch induzierten Tumorentstehung zu rechnen. So weisen Patienten
mit hereditären DNA-Reparaturstörungen ein stark erhöhtes Krebsrisiko auf (Wiestler et
al., 1989).
Maligne Tumoren wachsen in der Regel klonal, d.h. sie entstehen aus einer einzelnen
maligne entarteten Zelle. Von einer malignen Progression spricht man bei Ausbreitung
solcher transformierten Zellen im Organismus. Auf der Basis von histologischen,
zytologischen und zellbiologischen Untersuchungen lassen sich verschiedene Schritte
der malignen Progression abgrenzen. Der Übergang von normalem Gewebe zu
invasiven Karzinomen ist durch eine zunehmende Entdifferenzierung gekennzeichnet,
die sich u.a. in veränderter Zellform, gestörter Position der Zellen zueinander und
zunehmendem Verlust der Gewebsstruktur äußert (Wagener et al., 1999).
Invasiv wachsende Karzinome weisen Tumorzellnester oder einzelne Tumorzellen auf,
die sich aus dem Zellverband gelöst haben. Voraussetzung dafür ist der Verlust der Zell-
Zell-Adhäsion, die für den Zusammenhalt des normalen Epithels verantwortlich ist. Das
invasive Wachstum bedingt eine Auseinandersetzung der Tumorzellen mit der
extrazellulären Matrix und der vaskulären Basalmembran. Die Tumorzellen bedienen
sich dabei extrazellulär wirksamer Proteasen und Hyaluronidasen. Darüber hinaus
können Tumorzellen auch zytotoxische Substanzen bilden, mit denen sie normale,
gesunde Zellen zerstören, und sich damit weiter aggressiv und invasiv verbreiten (Klein
et al, 1989).
Da offensichtlich einer der ersten Schritte im Rahmen der Ausbreitung von malignen
Tumoren der Verlust des Zell-Zell-Zusammenhalts ist, stand die Rolle der
Zelladhäsionsmoleküle bereits früh im Zentrum der Krebsforschung.
10

II.2 Zelladhäsionsmoleküle
Der Kontakt von Zellen multizellulärer Organismen wird durch Zelladhäsionsmoleküle
vermittelt. Zelladhäsionsmoleküle regulieren die dynamischen Prozesse in der
Morphogenese während der Embryonalentwicklung und in der Regeneration von
Geweben. Sie bestimmen ferner die Gewebs- und Organarchitektur. Sie vermitteln
sowohl den Kontakt von Zellen untereinander als auch die Adhärenz von Zellen an
Bestandteile der extrazellulären Matrix (Wagener et al., 1999).
Mobile Zellen, wie z.B. Granulozyten, bewegen sich mittels Zelladhäsionsmolekülen an
denjenigen Ort des Körpers, an dem die Zellen in physiologischen und pathologischen
Situationen benötigt werden (Gumbiner, B.M., 1996).
Zelladhäsionsmoleküle sind an allen Schritten der malignen Progression beteiligt. Durch
Verlust und Dysregulation von Zelladhäsionsmolekülen geht die geordnete
Gewebsstruktur verloren, wodurch sich Zellen aus dem Gewebsverband lösen können.
Voraussetzung für die Infiltration bindegewebiger Strukturen ist die Expression von
Adhäsionsmolekülen, die an die Bestandteile der extrazellulären Matrix binden können.
Die Bindung von Zellmembranrezeptoren lymphogen metastasierender Tumorzellen an
Liganden der Lymphgefäße von Lymphknoten ist eine wichtige Voraussetzung für die
Ausbildung von Lymphknotenmetastasen.
Hämatogen metastasierende Tumorzellen können über Zelladhäsionsmoleküle an
Endothelzellen und die endotheliale Basalmembran binden und damit die Ausbildung
von Fernmetastasen einleiten (Brodt, P., 1996; Hendrix et al., 2001).
Die bisherigen Forschungsergebnisse zeigen, dass verschiedene Gruppen der
Zelladhäsionsmoleküle, wie z.B. die Integrine (Ruiz et al., 1993), Mitglieder der
Immunglobulin-Superfamilie wie MCAM (Xie et al., 1997), die CD44 Proteoglykan-
Gruppe (Sy et al., 1992), die Selectine (Mannori et al., 1997), die Matrix-
Metalloproteinasen (Mignati et al., 1986) und auch die Cadherine (Bracke et al., 1996) in
der malignen Transformation und Metastasierung beteiligt sind.
11

II.3 E-Cadherin
E-Cadherin gehört zu einer Familie strukturell verwandter Proteine, die zu den
wichtigsten Zelladhäsionsmolekülen zählen. Weitere Mitglieder der Familie sind die
sogenannten klassischen Cadherine und Adhäsionsproteine von Desmosomen
(Desmogleine, Desmocolline) (Suzuki et al., 1996).
Zu den klassischen Cadherinen zählen E-Cadherin (Epitheliales-Cadherin, früher auch
als Uvomorulin bezeichnet), P-Cadherin (Plazentares-Cadherin) und N-Cadherin
(Neurales-Cadherin). Auf dem Aminosäurenniveau beträgt die Homologie zwischen E-,
P- und N-Cadherin etwa 50%. Die Bindung die sie eingehen ist homophil, d.h. E-
Cadherin bindet nur an E-Cadherin, nicht aber an P- oder N-Cadherin (Wagener et al.,
1999).
E-Cadherin wird im Verlauf der Embryonalentwicklung bereits im Blastomer-Stadium
exprimiert und findet sich im weiteren Verlauf in allen Epithelien. Die Abwesenheit von
E-Cadherin ist mit dem Leben nicht vereinbar, so sterben beispielsweise Embryonen
von Knock-out-Mäusen im Stadium der Blastozyste ab (Marrs et al., 1996).
12

Strukturell besitzt E-Cadherin einen extrazellulären, einen transmembranösen und einen
intrazellulären Anteil. Der extrazelluläre Anteil, der die Zelladhäsion vermittelt, ist in fünf
Domänen unterteilt, die Bindungsfunktion liegt in der N-terminalen Domäne. Essentiell
für die adhäsive Funktion ist eine Sequenz von drei Aminosäuren
(His-Ala-Val) (Abb. II.3.1)
Abb. II.3.1 Schematischer Aufbau von E-Cadherin. Das HAV (His-Ala-Val)-der N-terminalen
Bindungsdomäne ist allen klassischen Cadherinen gemeinsam. Die Bindungsspezifität wird durch die
flankierenden Aminosäuren bestimmt. (Wagener et al., 1999).
13

E-Cadherin vermittelt die Zelladhäsion nur in Anwesenheit von Calcium-Ionen. Diese
Adhäsion ist temperaturabhängig und bei Körpertemperatur maximal.
E-Cadherin-Domänen besitzen charakteristische Calcium-bindende Aminosäuremotive.
Eine Bindung von Calcium-Ionen ermöglicht die Zusammenlagerung von E-Cadherin-
Monomeren zu Dimeren, wodurch gegenüberliegende Cadherine multiple Bindungen
eingehen können (Abb. II.3.2) (Takeichi, 1995).
Abb. II.3.2 Die N-terminalen Domänen eines E-Cadherin-Dimers können zwei gegenüberliegende Dimere
binden. Hierdurch werden multimere Bindungen ermöglicht. N, N-terminale Domäne; C, zytoplasmatische
Domäne. (Wagener et al., 1999).
14

Der intrazelluläre Anteil ist über die Catenine (intrazelluläre Proteine) mit den
Aktinfilamenten verbunden (Abb. II.3.3).
Abb. II.3.3 Die zytoplasmatische Domäne von E-Cadherin geht eine direkte Bindung entweder mit β-
Catenin oder Plakoglobin (γ-Catenin) ein. α-Catenin bildet die Brücke zwischen β-Catenin bzw.
Plakoglobin und Aktinfilamenten. (Wagener et al., 1999).
α-Catenin ist ein Aktin-bindendes Protein, welches dadurch eine direkte Bindung mit
dem Zytoskelett hat.
β-Catenin bindet direkt an E-Cadherin. Da es auch mit α-Catenin assoziiert, bildet es
eine Brücke zwischen E-Cadherin und α-Catenin.
γ-Catenin ist identisch mit Plakoglobin und ist mit β-Catenin strukturell verwandt. Wie β-
Catenin bindet auch Plakoglobin sowohl an E-Cadherin als auch an α-Catenin. Man
nimmt an, dass entweder β-Catenine oder Plakoglobin die Brücke zwischen E-Cadherin
und dem Zytoskelett herstellen. Durch diese Bindung wird die Übertragung
extrazellulärer Signale in die Zelle über die zytoplasmatische E-Cadherin-Domäne
ermöglicht. E-Cadherin ist dadurch nicht nur ein Adhäsions- sondern auch ein wichtiges
Signalmolekül (Aberle et al., 1996).
15

E-Cadherin ist durch die Verbindung mit dem β-Catenin Teil des Signalweges, in der β-
Catenin eine zentrale Rolle spielt. β-Catenin assoziiert mit einer als TCF/LEF
bezeichneten Gruppe von Transkriptionsfaktoren (TCF „T-Cell Factor“; LEF „Lymphoid
Enhancer Factor“). Im Komplex mit TCF induziert β-Catenin die Transkription
entsprechender Zielgene (Wagener et al., 1999). Fehlregulierungen auf diesem
Signalweg führen zu einer dauernden Aktivierung der β-Catenin/LEF/TCF Zielgene, zu
denen auch unter anderem c-myc und cyclin D1 gehören. Solche Fehlregulierungen
wurden bei verschiedenen malignen Tumoren beobachtet (Poser et al., 2001).
16

II.4 Rolle des E-Cadherin in der Tumorinvasion
Untersuchungen zum divergent aggressiven Verhalten von Tumoren prinzipiell
histologisch gleicher Entität weckten das wissenschaftliche Interesse an E-Cadherin.
In Experimenten an epithelialen Zelllinien wurde nachgewiesen, dass E-Cadherin eine
entscheidende Rolle für die epitheliale Differenzierung besitzt. Mit Hilfe eines
monoklonalen Antikörpers, der gegen E-Cadherin gerichtet war, verloren die Zellen ihre
differenzierte epitheliale Form und nahmen eine undifferenzierte, Fibroblasten-ähnliche
Form an. Umgekehrt kann man in Fibroblasten durch Expression von E-Cadherin eine
epitheloide Form induzieren. Dies zeigt, dass E-Cadherin für die Morphogenese von
Epithelien von zentraler Bedeutung ist (Imhof et al., 1983; Hatta et al.,1988).
Ein Verlust von E-Cadherin beeinflusst nicht nur die Morphogenese, sondern auch die
maligne Progression und damit das invasive Wachstum (Birchmeier et al., 1994; Bracke
et al., 1996).
Bei Experimenten an Zelllinien konnte gezeigt werden, dass Zellen mit starker E-
Cadherin-Expression kaum eine Tendenz zu invasivem Verhalten aufweisen, Zellen mit
geringer oder keiner E-Cadherin-Expression sich hingegen hochmaligne verhalten
(Behrens et al., 1989). Nach Transfektion von E-Cadherin-cDNA in derartig ursprünglich
E-Cadherin negative Zellen verloren diese wiederum ihre vorherige Invasivität
(Vleminckx et al., 1991). Dieses Verhalten konnte auch an Tumorzelllinien
verschiedener menschlicher Tumorarten gezeigt werden (Frixen et al., 1991).
All diese Befunde sprechen dafür, dass E-Cadherin zumindest funktionell als
Tumorsupressor wirkt und somit für weitere Untersuchungen zur Entstehung und
Biologie von malignen Tumoren von großem Interesse ist.
Bis jetzt wurde eine verminderte E-Cadherin-Expression in Leber-, Pankreas-, Magen-,
Dickdarm-, Blasen-, Prostata-, Pharynx-, Oesophagus-, Haut-, Schilddrüse- und
Mamma-Karzinomen beschrieben (Bracke et al., 1990).
17

In den meisten Fällen ist die verminderte Expression von E-Cadherin auf eine
verminderte Transkription des kodierenden Gens zurückzuführen. Im E-Cadherin Gen
wurden jedoch auch somatische Mutationen nachgewiesen, die funktionelle Domänen
des Proteins inaktivieren, wie z.B. bei Magenkarzinomen vom diffusen Typ (Becker et
al., 1994).
Bei lobulären Mammakarzinomen finden sich häufiger Frameshift- oder Nonsense-
Mutationen, die für sezernierte statt Membran-insertierte E-Cadherin Formen kodieren
(Berx et al., 1995; Berx et al., 1996).
Der Mechanismus des in den meisten Fällen vorliegenden E-Cadherin
Transkriptionsverlustes in vielen bösartigen Tumoren ist bislang weitgehend unbekannt.
Eine Möglichkeit beinhaltet die Inaktivierung des Promotors durch Hypermethylierung,
wie sie bei Mamma-, Magen- und Prostata-Karzinomen und auch bei Leukämien
beobachtet werden konnte (Melki et al., 2000; Graff et al., 1995; Tamura et al., 2000).
Weiterhin wurde der Verlust der Expression des AP-2 Transkriptionfaktors, der
möglicherweise das E-Cadherin aktiviert, vermutet (Batsche et al., 1998; Bar-Eli 1999).
Neuere Ergebnisse belegen zudem, dass der Transkriptionsfaktor Snail eine
wesentliche Rolle bei der Repression der E-Cadherin Expression bei Blasen-, Pankreasund
kolorektalen Karzinomen (Battle et al., 2000; Cano et al., 2000) und malignen
Melanomen spielt (Poser,Varnai et al., 2001).
In kolorektalen Karzinomen korreliert die Expression von E-Cadherin mit der
Differenzierung und dem Tumorstadium (Dorudi et al., 1993). In Prostatakarzinomen
nimmt sie ebenfalls mit fortschreitender Entdifferenzierung ab. Da entdifferenzierte
Karzinome häufiger metastasieren, besteht damit auch ein Zusammenhang zwischen E-
Cadherin Expression und Prognose (Umbas et al., 1994).
Ein eindeutiger Zusammenhang zwischen dem Verlust von E-Cadherin und
Tumorprogression besteht sowohl bei malignen Melanomen (Sanders et al., 1999) als
auch bei kolorektalen Karzinomen (Efstathiou et al., 1999) und Plattenepithelkarzinomen
(Birchmeier et al., 1994).
II.5 Das maligne Melanom
18

Maligne Melanome bilden aufgrund ihrer frühzeitigen Metastasierungstendenz
hochgradig maligne Tumoren, die von den melaninbildenden Zellen (Melanozyten) der
Haut ausgehen. Sie metastasieren frühzeitig auf lymphogenem und hämatogenem
Weg.
Die Inzidenz der malignen Melanome hat in den letzten Jahrzehnten stetig
zugenommen; sie liegt heute bei 10 bis 15 Fälle pro 100000 Einwohner und Jahr in
Deutschland. In epidemiologischen Studien wird ein Süd-Nord-Gefälle innerhalb der
Bevölkerung europäischer Herkunft deutlich. Je mehr man sich dem Äquator nähert,
desto größer ist die Morbidität innerhalb der hellhäutigen Bevölkerung. In Neuseeland
und Australien wird sogar von einer Inzidenz von 40-60 pro 100000 Einwohner und Jahr
berichtet. Die asiatische und schwarze Bevölkerung desselben Breitengrades erkrankt
nur in 15-25% der Fälle. Frauen sind fast doppelt so häufig betroffen wie Männer.
Vor der Pubertät tritt ein malignes Melanom extrem selten auf. Nur 2% der Erkrankten
sind unter 20 Jahre alt und ca. 10% unter 30. 80% der Erkrankten befinden sich
zwischen dem 30. und 70. Lebensjahr (Jung et al., 1998) (Abb. II.5.1).
19

Abb. II.5.1 Relative Häufigkeit und Manifestation der verschiedenen Melanomtypen in der Abhängigkeit
vom Lebensalter. (Jung et al., 1998).
Die Ursachen für die Entstehung des malignen Melanoms sind trotz intensiver
Forschung bis heute unklar. Lichtempfindliche Haut (Hauttyp I und II) ist ein genetisch
determinierter, prädisponierender Faktor sowie eine hohe Anzahl von Pigmentmalen. Es
besteht allerdings keine direkte Kausalität zwischen Sonnenlicht und
Melanomentstehung (Weiß et al., 1990).
Dennoch scheint ein indirekter Zusammenhang zwischen der Menge der UV-Exposition
und der Genese maligner Pigmenttumoren zu bestehen. Dafür spricht die hohe
Morbidität, insbesondere bei Patienten mit lichtempfindlicher Haut in Regionen mit
starker Sonnenbelastung (Jung et al., 1998).
Darüber hinaus kommen ca. 10% der Melanome familiär gehäuft vor (Syndrom der
dysplastischen Nävi, DNS). Es handelt sich hierbei um eine autosomal dominante
Vererbung mit polygenem Erbgang oder unvollständiger Penetranz.
Für die Entstehung von Melanomen aus Melanozyten ist von Clark et al. (1984; 1991)
ein Modell entwickelt worden, welches die Tumorprogression in fünf Stadien unterteilt
und sie schrittweise vom Melanozyten zum metastasierenden Melanom beschreibt.
Melanozytische Naevi werden als benigne Neoplasien von Melanozyten angesehen.
20

Melanozyten und Naevuszellen können in situ verbleiben oder spontan
ausdifferenzieren (Schwannsche Differenzierung). In seltenen Fällen kommt es zu einer
malignen Veränderung von Melanozyten in Naevi und so zur Entstehung von
Melanomen.
Zuerst breiten sich die Melanomzellen meist radial aus und durchdringen nicht die
Basalmembran („radial growth phase“), anschließend kommt es zur „vertical growth
phase“, wobei die Melanomzellen die Basalmembran überschreiten und bis in die
Subkutis eindringen. Damit wird auch der Weg zur Metastasierung frei.
Die terminale Differenzierung und damit Regression von Melanomzellen kommt nur sehr
selten vor. Beschrieben wird auch die spontane Melanomentstehung ohne die
Zwischenstufe der Naevusentwicklung (Abb. II.5.2).
Abb. II.5.2 Modell der Tumorprogression bei Melanomen (nach Clark). RGP (radial growth phase); VGP
(vertical growth phase). (Clark et al., 1984).
21

Maligne Melanome sind in der Regel in ihrer Farbintensität unterschiedliche, tiefbraune
bis blauschwarze Tumoren. Durch verschieden schnelles horizontales und vertikales
Wachstum sowie sekundäre Veränderungen wie Erosion, Ulzeration, Blutung und
Verkrustung oder regressive Veränderungen entstehen klinisch in Farbe, Form und
Größe sehr variable Tumoren. Mitunter finden sich im Tumor pigmentfreie Areale. Selten
ist ein Tumor völlig pigmentfrei (amelanotisches malignes Melanom, AMM). Die meisten
Melanome finden sich im Bereich des Rückens, der Brust und der Extremitäten; Lentigomaligna-Melanome
(LMM, s.u.) finden sich bevorzugt im Gesicht, an Hals, Armen und
Unterschenkeln.
Man unterscheidet klinisch vier Arten von Melanomen: superfiziell spreitendes malignes
Melanom (SSM, 60%), akrolentiginöses Melanom (ALM, 5%), noduläres malignes
Melanom (NM, 20%) und Lentigo-maligna-Melanom (LMM, 10%). 5% der Malignen
Melanome sind Sonderformen (Jung et al., 1998).
Die Prognose für den Patienten richtet sich nach der Tumordicke und Eindringtiefe des
Primärtumors. Dafür wird die Einteilung der Invasionstiefe nach Clark (Clark-Level I-V)
benutzt (Abb. II.5.3).
Abb. II.5.3 Tumoreindringtiefen der Melanome nach Clark I-V. Damit wird die Invasionstiefe des
Melanoms in das Korium mit seinen verschiedenen Gefäßflechten und in das Unterhautfettgewebe
bezeichnet. Die enormen Dickenunterschiede des Koriums an verschiedenen Körperstellen können auf
diese Weise besser berücksichtigt werden als bei der Angabe der vertikalen Tumordicke in mm (Jung et
al., 1998).
22

Bei einer Tumordicke von 4,0mm
(pT4) beträgt die 10-JÜR 43%. Sind Lymphknoten- oder Fernmetastasen vorhanden,
sinkt die 10-JÜR auf ca. 3% (Jung et al., 1998)(Abb. II.5.4).
Abb. II.5.4 Stadieneinteilung bei malignen Melanomen. (Jung et al., 1998).
Ein weiteres prognostisches Kriterium ist die Lokalisation des Primärtumors. Melanome
an den Extremitäten haben eine bessere Prognose als Melanome im Bereich des
Rumpfes oder des Kopfes. Prognostisch besonders ungünstig sind Melanome im
Anogenitalbereich wegen der meist späten Diagnosestellung.
Eine kurative Behandlung durch Resektion ist nur in frühen Tumorstadien möglich
solange noch keine Metastasierung vorliegt. Melanome erweisen sich als resistent
gegenüber konventionellen Chemo- oder Radiotherapien. Bereits bei kleinen
Primärtumoren kommt es häufig zu Metastasierung, bevorzugt in Lymphknoten, Haut,
Lunge, Leber, Gehirn und Knochen und in diesen Fällen ist eine kurative Therapie nach
dem heutigen Stand des medizinischen Wissens nicht mehr möglich.
23

II.6 Das kolorektale Karzinom
Das kolorektale Karzinom ist der häufigste maligne Tumor des Darmtraktes und die
zweithäufigste Tumorerkrankung bei Männern (nach dem Bronchialkarzinom) und
Frauen (nach dem Mammakarzinom). Diese Tumoren manifestieren sich meistens nach
dem 45. Lebensjahr, mit einem Häufigkeitsgipfel um das 70. Lebensjahr. 90% der
kolorektalen Karzinome gehen aus Adenomen hervor. 60% der Karzinome sind im
Rektum, 20% im Colon sigmoideum, 10% im Coecum/Colon ascendens und 10% im
übrigen Kolon lokalisiert (Herold et al., 1999).
Während sich die Inzidenz des kolorektalen Karzinoms von 1960 bis 1980 verdoppelt
hat (Schmiegel et al., 2000), verzeichnet die Arbeitsgemeinschaft
Bevölkerungsbezogener Krebsregister in Deutschland seit Mitte der 80er Jahre keinen
weiteren Anstieg. Die Inzidenz beträgt 15-25 Neuerkrankungen pro 100000 Einwohner
und pro Jahr (Schumpelick et al.,1999). Den Angaben des Statistischen Bundesamtes
1998 zufolge stellt das Kolonkarzinom mit 30460 Todesfällen die zweithäufigste
karzinombedigte Todesursache dar.
Ernährungsfaktoren wie hoher Fett- und Eiweißkonsum, Übergewicht, niedriger
Ballaststoffgehalt der Nahrung gelten als begünstigende Faktoren in der Entstehung des
kolorektalen Karzinoms. Den Gallensäuren wird ein cokarzinogener Effekt
zugeschrieben. Bei ca. 20% der Erkrankten besteht eine genetische Disposition. Zu den
hereditären Karzinomen zählen z.B. die familiäre Adenomatosis coli oder das hereditäre,
nichtpolypöse Kolonkarzinom-Syndrom (HNPCC) (Schumpelick et al., 1999).
Kolorektale Karzinome entstehen aus Epitheldysplasien, wobei über 95% aller
Dysplasien in Form von Adenomen auftreten. Manchmal können auch sog. „flache
Adenome“ im Schleimhautniveau entstehen, wie bei langjähriger Colitis ulcerosa.
Für die Entwicklung kolorektaler Karzinome sind zwei molekulargenetische Wege
bekannt. Einerseits spielen proto-Onkogene und Tumorsuppressorgene eine wichtige
Rolle, alternativ sind DNA-mismatch-repair-Gene (MMR-Gene) entscheidend in der
Karzinogenese (Bruch et al., 1999).
24

Proto-Onkogene sind normale Bestandteile des Genoms und dabei besonders an der
Regulation des Zellwachstums und der Zellteilung beteiligt (z.B. k-ras Onkogen). Die
Mutation eines solchen Gens kann über spezielle Rezeptoren, veränderte
Signalübertragung oder durch den Verlust wichtiger Regulationsmechanismen zum
übermäßigen Wachstum eines Zellklons führen.
Tumorsuppressorgene (z.B. APC-Gen oder p53) sind zellulär rezessiv wirksame Gene
und spielen erst dann eine Rolle, wenn beide Allele von Mutation oder Verlust betroffen
sind.
Bei hereditären Karzinomen wird ein mutiertes Allel vererbt; das normale (wild-Typ) Allel
verhindert jedoch zunächst noch eine maligne Entartung. Geht dieses Allel in einer
einzelnen somatischen Zelle auch noch funktionell verloren, kann die
Karzinomentwicklung beginnen.
In den sogenannten sporadischen Fällen (Mehrzahl aller kolorektalen Karzinome, nicht
familiär gehäuft) müssen hingegen beide Allele in einer einzelnen Zelle mutieren oder
verloren gehen, um eine maligne Transformation und Karzinomwachstum zu induzieren.
DNA-MMR-Gene (z.B. MSH2, MLH1) sind verantwortlich für die Identifikation
bestimmter DNA Mutationen und deren Reparatur. Liegen hier Mutationen vor, führt dies
zu charakteristischen Instabilitäten repetitiver DNA-Sequenzen als folge von
Replikationsfehlern. Das Genom kann als „RER+“ (replication error positive) oder, falls
repetitive Sequenzen in sog. Mikrosatelliten Regionen nachgewiesen werden, als
„Mikrosatelliten instabil“ (MIN) klassifiziert werden.
Von Vogelstein et al. (1988) wurde folgendes Tumorprogressions-Modell entwickelt, das
als sog. Dysplasie-Karzinom-Sequenz bezeichnet wird: das normale Epithel geht durch
die Mutation oder Verlust des APC-Gens in ein hyperproliferatives Epithel über. Durch
eine Methylierungsstörung der DNA entwickelt sich ein frühes Adenom mit
geringgradiger Dysplasie. Eine Mutation des k-ras-Onkogens führt dieses in ein
intermediäres Adenom mit mittelgradiger Dysplasie über. Folgt darauf ein Verlust des
DCC-Tumor-Supressor-Gens entsteht ein spätes Adenom mit hochgradiger Dysplasie.
Die Deletion des p53-Gens führt schließlich zur Entstehung des Karzinoms. Weitere
Alterationen wie nm23-Deletion führen dann zur Metastasierung. (Abb.II.6.1)
25

Abb. II.6.1 Genetisches Modell der kolorektalen Karzinogenese mit bekannten Mutationen oder
Deletionen spezifischer Kolonkarzinom-assoziierter Gene. (Schumpelick et al., 1999).
26

Als Risikogruppen für ein kolorektales Karzinom gelten: familiäre Adenomatosis coli
(100%), Colitis ulcerosa (20%), Morbus Crohn (3%), Zustand nach
Ureterosigmoidostomie (10%), Patienten mit kolorektalem Adenom (10-50%), Patienten
mit positiver Familienanamnese (10%), Normalbevölkerung (3-5%) (Baenkler et al.,
1999).
Aufgrund des histologischen Differenzierungsmusters lassen sich Dickdarmkarzinome
einteilen in: Adenokarzinome (70%), muzinöse Karzinome (20%), anaplastischese
Karzinome und in seltene Formen wie Adenoakanthome und Plattenepithelkarzinome.
Sie wachsen meist langsam, meist exophytisch, polypös, häufig zentral zerfallend, an
den Wandstrukturen orientiert zirkulär und zunächst gut begrenzt.
Die lymphogene Ausbreitung erfolgt oft relativ spät entlang unipolaren
Metastasenstraßen im Mesocolon und je nach Sitz des Primärtumors zusätzlich in
paraaortale, iliakale oder inguinale Lymphknoten. Die hämatogene Metastasierung
erfolgt zunächst meistens in die Leber, von dort in die Lunge, erst dann ist eine
generalisierte Ausbreitung möglich. Bei tiefsitzenden Karzinomen ist eine primäre
Lungenmetastase möglich (Abstrom über V. rectalis inf., V. iliaca, V. cava) (Herold et al.,
1999).
Die Therapie des kolorektalen Karzinoms besteht aus chirurgischer Resektion sowie
adjuvanter Radio- und Chemotherapie.
Insgesamt wird die Prognose von der lokalen Ausbreitung, Lymphknotenmetastasierung
und Tumordifferenzierung bestimmt. Daran sind die gebräuchlichen Klassifikationen
nach Dukes und TNM orientiert (Abb. II.6.2. und II.6.3.).
27

Abb.II.6.2 Aktuelle Klassifikation, Grading und Staging kolorektaler Karzinome. (Schumpelick et al., 1999)
28

Abb.II.6.3 Überlebenszeit beim Kolonkarzinom in Abhängigkeit von der Dukes-Klassifikation.
(Schumpelick et al., 1999).
Die 5-Jahre-Überlebensrate beim kolorektalen Karzinom beträgt ca. 50% und ist sehr
stark vom Stadium abhängig: Stadium I 85%, Stadium II 50-60% (mit Radiotherapie
70%), Stadium III 25-35% (mit (Radio-)Chemotherapie >50%), Stadium IV

III. AUFGABENSTELLUNG
Die bisherigen Literatur- und Forschungsergebnisse zeigen, dass das epitheliale
Adhäsionsmolekül E-Cadherin eine wichtige Rolle in der Tumorprogression spielt.
Verschiedene maligne Tumoren zeigen im Rahmen der Invasion von umgebenden
Strukturen und der weiteren Metastasierung einen Verlust oder eine reduzierte
Expression des E-Cadherins.
Ziel dieser Arbeit war es, das vollständige humane E-Cadherin Gen hinsichtlich von
Mutationen zu analysieren, die dem Verlust bzw. der verminderten Expression des E-
Cadherins zugrunde liegen, wie sie sowohl bei malignen Melanomen als auch bei
kolorektalen Karzinomen beschrieben wurden.
Dafür wurde aus fünf Melanom- und fünf kolorektalen Karzinom-Zellinien genomische
DNA isoliert, die E-Cadherin Exone und Intron-Exon-Übergänge mittels PCR amplifiziert
und in einer direkten Cycle-Sequenzierung-Reaktion mit kapillärer Elektrophorese
analysiert.
30

IV. MATERIAL UND METHODEN
Alle Arbeiten wurden mit sterilen Gefäßen und Pipettenspitzen durchgeführt, sämtliche
Puffer und Medien sterilfiltriert oder autoklaviert. Zur Herstellung von Puffern und
Medien wurde destilliertes Wasser verwendet.
IV.1 PUFFER, MEDIEN UND LÖSUNGEN
2% Agarose-Gel 10 g Agarose
500 ml 1x TBE
auf 500ml Agarose kommt 75 µl EtBr
Ethidiumbromid 1 mg/ml (1 Tablette auf 10 ml Aqua dest.)
Fällungslösung für die
Sequenzierung 80 µl HPLC-Aqua dest.
10 µl NaOAc (3M, pH 4,6)
250 µl 100% EtOH
6x Loading Buffer 0,03 g Bromphenol blue
0,03 g Xylencycanol FF
1,8 g Ficoll
12 ml Aqua dest.
31

PBS 8 g NaCl
1,15 g Na2HPO4
0,2 g KH2PO4
0,2 g KCl
mit Aqua bidest. auf 1000 ml auffüllen
PEG- Mix 52,4 g PEG 8000
40 ml NaOAc (3M, pH 5,2)
1,32 ml MgCl2
bis 200 ml mit Aqua dest. Auffüllen
PUC- Marker 5 µl 6x Loading Buffer
2 µl pUC
5 µl Aqua dest.
TBE- Puffer 89 mM Tris / HCl
89 mM Borsäure
2 mM EDTA (pH 8,0)
32

IV.2. MATERIALIEN
IV.2.1 Chemikalien und Enzyme
ABI, Weiterstadt DNA Sequencing Kit, TSR
Biozym, Oldendorf Agarose
Falcon,Heidelberg Zellkulturartikel
Life Technologies,
Eggenstein
100bp DNA Ladder, PBS Tablets
Merck, Darmstadt HPLC-Aqua dest., Ethanol abs.,
Borsäure, Natriumacetat, DMSO
MBI Fermentas,
St.Leon-Rot
PUC 19 DNA/MspI, 6xLoading Buffer
Qiagen, Hilden QIAamp Mini Kit
PAA, Linz Zellkulturmedien
Roche, Mannheim dNTPs, MgCl2, 10xPCR Puffer, Taq-Polymerase
Serva, Bergneustadt Tris, EDTA
Sigma, Steinheim PEG, EtBr, fötales Kälberserum
33

IV.2.2 Molekulargewichtsstandard
Verwendet wurden die DNA Längenstandards READY-LOAD 100bp DNA Ladder von
GIBCO BRL und der pUC19 DNA/MspI (HpaII) Marker von MBI Fermentas.
100 bp Ladder: 2072 bp pUC Marker: 501 bp
1500 489
1400 404
1300 331
1200 242
1100 190
1000 147
900 111
800 110
700 67
600 34
500
400
300
200
100
26
34

IV.2.3 Geräte und Materialien
Autoklav -H+P Labortechnik, Oberschleißheim
Brutschrank -Heraeus, Hannau
Eppis -Biozym, Oldendorf
Elektrophoreseapparaturen -Serva, Heidelberg
Pipetten -Eppendorf, Hamburg
Pipettenspitzen -Biozym, Oldendorf
Thermocycler -Applied Biosystems, Weiterstadt
-Hybaid, Heidelberg
pH-Meter -WTW, Weilheim
Photo-Geräte -MWG-Biotech, Ebersberg
Sequenziergerät -Applied Biosystems, Weiterstadt
Vortex -IKA Labortechnik, Staufen
Zentrifugen -Eppendorf, Hamburg
-Heraeus, Hannau
IV.2.4 Primer
35

Die folgende Tabelle enthält die für die PCR und Cycle Sequencing benutzten Primer,
ihre Annealing-Temperaturen, die für die PCR benötigte MgCl2 Konzentration und die
Länge des jeweiligen E-Cadherin PCR- Produkts.
Die Positionen des S (sense) und AS (antisense) Primers sind durch die Anzahl der
Nukleotiden hinwärts (-y) oder rückwärts (+y) von dem nächsten Exon (bzw. Stop-
Codon für der AS-Primer von Exon 16).
Tabelle IV.2.4
Exon No. S Primer ( 5´ - 3´ ) AS Primer (5´- 3´ )
36
PCR-
Produkt(bp)Ann.Temp.(°C) MgCl2 (mM)
1 (-53)tacggggggcggtgctccgg (+59)ctggggcgcggagcttgcgg 282 70 2
2 (-34)tcacccggttccatctac (+229)caacctcctcttctttat 378 55 0
3 (-54)gctcttgtctttaatctgtc (+75)gtaccaaggctgagaaacct 360 60 2
4 und 5 (-25)cttgttcctcatcttctttc (+151)cccatcacttctccttagca 603 55 0
6 (-18)ctcacttggttctttcag (+60)aacctttgggcttggaca 246 55 3
7 (-37)agcttgtctaaaccttcatc (+116)gcttagaccatcactgtatt 329 60 2
8 (-24)ttggttgtgtcgatctctc (+70)cagtggtacccttagttcat 223 55 2
9 (-33)gtacttgtaatgacacatct (+36)tgccagtttctgcatcttgc 252 55 2
10 (-24)acttcattgtttctgctctc (+41)aaccagttgctgcaagtcag 311 60 2
11 (-47)gttgtttgctggtcctattc (+48)gaactagctaggaggtcgag 253 60 2
12 (-54)tggggattcattactgttgc (+27)gctaggcagttggagcaaag 326 60 2
13 (-44)tttcctcccctggtctcatc (+25)tgagtcacttgccagctgga 302 60 2
14 (-36)ctctcaacacttgctctgct (+22)agagatcaccactgagctac 209 60 2
15 (-67)catagccctgtgtgtatgac (+33)cggatgctttggctttccac 248 60 2
16 (-57)agatgacaggtgtgcccttc (+51)atttctgcatttcccagcac 315 60 2

IV.2.5 Zelllinien
Melanomzelllinien Mel Im
Mel Im si
Mel Wei
Mel Ju
Mel Ho (DSM ACC 109)
Die Melanomzelllinien wurden von Jacob et al. (1995 und 1998) näher beschrieben und
charakterisiert. Die Zelllinie Mel Ho stammt von der DSMZ (Deutsche Sammlung von
Mikroorganismen und Zellkulturen, Braunschweig).
Kolon-Karzinom Zelllinien HCT 116 (ATCC- CCL- 247)
SW 48 (ATCC- CCL- 231)
HT 29 (ATCC- HTB- 38)
CaCo (ATCC- HTB- 37)
LoVo (ATCC- CCL-229)
Die Kolon-Karzinom Zelllinien stammen von der American Type Culture Collection
(ATTC, Rockville, USA).
37

IV.3 MOLEKULARBIOLOGISCHE METHODEN
IV.3.1 Kultivierung von eukaryontischen Zellen
Alle verwendeten Zelllinien wurden in DMEM mit 10% FKS und 1% Penicillin/
Streptomycin bei 37°C und 8% CO2 in T75 Zellkulturflaschen kultiviert. Zur Passage
der Zellen wurden diese nach Waschen mit PBS für 5 Minuten mit 0,05% Trypsin/ 0,2%
EDTA bei 37°C inkubiert, in DMEM mit FKS aufgenommen und 1:5 bis 1:10 verdünnt in
neue Zellkulturflaschen verteilt. Ein Mediumwechsel erfolgte jeden zweiten Tag.
IV.3.2 DNA- Isolierung
Das Zellkulturmedium wurde abpipettiert. Die Zellen wurden mit 5ml PBS gewaschen
und in 1 ml PBS mit einem Zellschaber abgekratzt. Diese Zellsuspension wurde 5
Minuten bei 3000 rpm zentrifugiert, der Überstand entfernt und das Zellpellet für die
DNA- Isolierung weiterbenutzt.
Die DNA-Isolierung erfolgte entsprechend dem in QIAamp DNA Mini Kit (250), QIAGEN
vorhandenen Protokoll für die DNA Fällung.
Zum Zellpellet wurde 400µl AL Puffer, 50µl Protease K, 80µl Rnase A (10mg/ml)
gegeben und vorsichtig gemischt. Diese Mischung wurde für 15 Minuten bei 70°C
inkubiert, danach mit 100% Ethanol aufgefüllt und auf die QIAamp Säule aufgetragen.
Nach 2 minütiger Zentrifugation bei 8000 U/ Min wurde der Überstand verworfen und
500µl AW1 Puffer dazugegeben. Dies wurde wieder bei 8000 U/ Min für 2 Minuten
zentrifugiert, der Überstand wurde verworfen und AW2 Puffer dazugefügt. Für 2 Minuten
38

wurde diese Mischung bei 14000 U/ Min zentrifugiert, der Überstand verworfen und die
Säule getrocknet. Nach zweimaligem Waschen mit 200µl Tris (10mM, pH 7,6) und
Inkubation bei 70°C für jeweils 5 Minuten wurde die Säule in ein sauberes Eppi
überführt, mit 200µl Aqua dest. aufgefüllt, 1 Minute bei Raumtemperatur inkubiert und
anschließend für 1 Minute bei 8000 U/ Min zentrifugiert.
Die so isolierte DNA Lösung wurde für die PCR weiterverwendet.
IV.3.3 Polymerase- Ketten- Reaktion ( Polymerase- Chain- Reaction (PCR))
Zur spezifischen Amplifikation der E-Cadherin Exone wurde die Polymerase-Chain-
Reaction (Mullis et al., 1986), angelehnt an die von Berx et al. (1995) beschriebene
Modifikation, verwendet. Eingesetzt wurden jeweils 100 ng der aus den Zelllinien
isolierten DNA, 50 pmol des jeweiligen Primers, 0.5 µl 5U Taq-Polymerase, 1 µl 10 mM
dNTPs, 5µl 10xPCR Puffer, 2-3 mM MgCl2 (siehe Tabelle IV.2.4). Das
Reaktionsgemisch wurde auf 50 µl mit destilliertem Wasser aufgefüllt. Nach der initialen
Denaturierung bei 95°C für 2 min erfolgte die Amplifikation der DNA durch 35 repetitive
Zyklen von Denaturierung (30 Sekunden 94°C), Annealen (30 Sekunden 55-70°C s.
Tabelle IV.2.4) und Verlängerung (45 Sekunden 72°C). Bei Exon 1 wurde zusätzlich zu
dem PCR- Reaktionsgemisch 2,5% DMSO zugefügt. Die Exone 2 und 4+5 wurden ohne
MgCl2 amplifiziert.
39

IV.3.4 Gelelektrophorese
Für die Elektrophorese wurden 2%ige Agarose-Gele mit Zusatz von 75µl/ 500ml
Ethidiumbromid verwendet. 10 µl des PCR- Templates gemischt mit 3 µl 6x Loading
Buffer pipettierte man in die Geltaschen. Die elektrophoretische Auftrennung erfolgte
bei 100 Volt. Zum Nachweis der DNA wurden die Gele anschließend unter UV-
Beleuchtung photographiert. Als DNA-Längenstandard wurde die 100bp DNA Ladder
benutzt.
IV.3.5 PEG-Fällung
Um die PCR-Produkte für die Sequenzierung vorzubereiten, wurden sie nach folgender
Methode gefällt: gleiche Menge PCR-Produkt und PEG-Mix (je 40 µl) wurden
zusammengegeben, gemischt und 10 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert.
Anschließend wurde diese Mischung für 10 Minuten bei 13000 rpm zentrifugiert. Der
Überstand wurde verworfen, in das Eppi wurden 100 µl 100% Ethanol dazugegeben und
erneut bei 13000 rpm 10 Minuten zentrifugiert. Der Überstand wurde erneut verworfen,
der Rest bei Raumtemperatur ca. 20 Minuten getrocknet und in 40 µl destilliertem
Wasser aufgenommen.
Um die für die Sequenzierung benötigte Menge des PCR-Templates zu bestimmen,
wurden 5 µl des Templates mit 5 µl 6x Loading Buffer gemischt und auf ein 2%iges
Agarose-Gel aufgetragen. Als Referenzmarker wurde der pUC19/MspI (HpaII) Marker
für die DNA-Mengen Bestimmung benutzt.
40

IV.3.6 Sequenzierung (cycle sequencing)
Die Sequenzierungsreaktion basiert auf der von Sanger et al. (1977) beschriebenen
Didesoxy-Methode, entsprechend dem von der Firma ABI PRISM 310 modifizierten
Protokoll.
In die Sequenzierunsreaktion wurden 30-90 ng (maximal in 8 µl Volumen) des
aufgereinigten PCR- Produkts, 4 µl des DNA-Sequencing Kit (Big Dye Terminator, ABI
PE Biosystems), 10 pmol des jeweiligen Primers eingesetzt und mit destilliertem
Wasser auf 20 µl Reaktionsvolumen aufgefüllt.
Die Cycle Sequencing Reaktion erfolgte in 25 repetitiven Zyklen von 96°C für 10
Sekunden, 55-70°C für 5 Sekunden (abhängig von dem jeweiligen Primer, s. Tabelle
IV.2.4) und 60°C für 4 Minuten.
Die fertigen Reaktionsprodukte wurden in die Fällungslösung, bestehend aus 80 µl
HPLC-Aqua dest., 10 µl 3M Natriumacetatlösung ( pH 4,6 ) und 250 µl 100% Ethanol,
überführt und bei Raumtemperatur 15 Minuten bei 15000 rpm zentrifugiert. Der
Überstand wurde verworfen und durch 250 µl 75% Ethanol ersetzt. Nach 5 Minuten
Zentrifugieren bei 15000 rpm wurde dieser Überstand auch abgenommen und
verworfen und die Pellets wurden bei Raumtemperatur ca. 30 Minuten getrocknet.
In 25 µl TSR ( Template Suppression Reagent, ABI ) gelöst, wurden die Produkte in
Sequenzier-Gefässe überführt, zentrifugiert und 5 Minuten bei 95°C denaturiert.
Die Auftrennung und Auswertung der Sequenzierreaktion erfolgte in dem 310-Gerät von
ABI PE Biosystems.
41

V. ERGEBNISSE
Das humane E-Cadherin Gen ist auf Chromosom 16q22.1 lokalisiert. Es wurde von Berx
et al., 1995. isoliert und charakterisiert. Das Gen besteht aus 16 Exonen (Abb.
V.1/ Tab. V.1). Die Abbildung V.1 zeigt einige der bisherig gefundenen relevanten
Mutationen im E-Cadherin Gen.
Abb. V.1 Schematische Darstellung einiger bekannten Mutationen im humanen E-Cadherin Gen.
N, Amino-terminales Ende; C, Carboxy-terminales Ende; SIG, Signal-Peptide; PRE, Vorläufer-Sequenz;
EC, extrazelluläre Domäne mit Calzium-bindenden Motiven; TM, transmembranäre Domäne; CP,
zytoplasmatische Domäne. Die Zahlen unter dem Protein bezeichnen die zugehörige Exons, die Zahlen
über dem Protein die Nummer der angrenzenden Codons.
Die Reihe a beinhaltet die Mutationen für infiltrative lobuläre Mamma-Karzinome (Berx et al., 1995); die
Reihe b für Magen-Karzinome (Becker et al., 1993,1994); die Reihe c für Magen-Karzinom Zelllinien (Oda
et al., 1994); die Reihe d für Endometrium- und Ovarial-Karzinome (Risinger et al., 1994) und die Reihe e
für lobuläre Mamma-Karzinome (Kania et al., 1994).
(STOP, Stop-Codon; FR, frame-shift Mutation; AS, Aminosäure-Substitution; DL, Deletion; SK, Exon-
Skipping ). (Berx et al., 1995).
42

Für die Polymerase-Kettenreaktion (PCR) wurden die von Berx et al. (1995)
entwickelten Primer, die die Intron-Exon-Übergänge beinhalten benutzt.
Aus allen Zelllinien wurde die genomische DNA isoliert und für die PCR
weiterverwendet. Bei allen Zelllinien konnten alle 16 Exone amplifiziert werden und auf
dem Agarosegel nachgewiesen werden.
Als Beispiel zeigt die Abbildung V.2 das Bild von den PCR-Produkten für Exon 1 für die
Zelllinien HTC116, Mel Im si, SW48, CaCo, LoVo, Mel Im und HT29. In den Abbildungen
V.3 und V.4 sind die PCR-Produkte für die Exone 3, 7,10-16 für die Zelllinien Mel Im und
HT 29 dargestellt.
Abb. V.2 Agarose-Gel von den PCR-Produkten für Exon 1 von den Zelllinen HTC 116, Mel Im Si, Sw 48,
CaCo, LoVo, Mel Im und HT 29.
43

Abb. V.3 Agarose-Gel von den PCR-Produkten für die Exone 3, 7, 10-16 von der Zelllinie Mel Im und für
Exon 16 von der Zelllinie CaCo.
Abb. V.4 Agarose-Gel von den PCR-Produkten für die Exone 3, 7, 10-16 von der Zelllinie HT 29 und für
die Exone 13 und 16 von der Zelllinie SW 48.
Nachdem diese PCR-Produkte aufgereinigt wurden, konnten sie für die Sequenzierung
verwendet werden.
44

Bei den Melanom-Zelllinien konnte keine Mutation im Exon-Bereich nachgewisen
werden.
Bei den kolorektal Karzinom-Zelllinien wurde bei der Zelllinie HTC 116 im Exon 3 die
heterozygote Deletion der Base 196 (Guanin) gefunden (Abb.V.5). Weiterhin fand sich
bei allen fünf kolorektal Karzinom-Zelllinien im Exon 13 die Punktmutation der Base 139
(Cytosin zu Thymin). Diese Punktmutation war homozygot bei den Zellinien CaCo und
HT 29 (Abb. V.6) und heterozygot bei LoVo, SW 48 und HCT 116. Diese Punktmutation
führt zu keiner Veränderung in der Aminosäuresequenz, denn sie kodiert weiterhin die
Aminosäure Alanin.
Abb. V.5 Sequenz von Exon 3 der Zelllinie HTC 116 mit der heterozygoten Deletion der Base 196
(Guanin). Im Bild ist das die Base 226.
45

Abb. V.6 Sequenz von Exon 13 im Beispiel von der Zelllinie HT 29 mit der homozygoten Punktmutation
der Base 139 (Cytosin zu Thymin). Im Bild ist das die Base 165.
In den Intron-Bereichen fanden sich zwei neue Punktmutationen und eine Insertion der
Base G in allen Zelllinien, sowie eine zusätzliche Punktmutation bei der Zelllinie HT 29.
Obwohl diese Veränderungen in der Nähe der Intron-Exon-Übergängen sind, haben sie
keinen Einfluss auf die Transkription oder Translation des E-Cadherins. Die Ergebnisse
sind in der Tabelle V.2 dargestellt.
Diese Ergebnisse zeigen, dass mit Ausnahme der Zelllinie HTC 116 weder bei den
Melanom- noch bei den kolorektal Karzinom-Zelllininen Mutationen zu finden sind, die
zu einem Verlust des E-Cadherins führen.
46

Tabelle V.1: Die Exone des E-Cadherin Gens
Kursiv dargestellt sind die Intron-Bereiche.
Exon 1: gcttgcggaa gtcagttcag actccagccc gctccagccc ggcccgaccc gaccgcaccc
ggcgcctgcc ctcgctcggc gtccccggcc agccatgggc ccttggagcc gcagcctctc
ggcgctgctg ctgctgctgc aggtacctcg ga
Exon 2: ttcccccacc ccaggtctcc tcttggctct gccaccacgg ggagccctgc caccctggct
ttgacgccga gagctacacg ttcacggtgc cccggcgcca cctggagaga ggccgcgtcc
tgggcagagg tgagggcgc
Exon 3: atttctccct gcagtgaatt ttgaagattg caccggtcga caaaggacag cctatttttc
cctcgacacc cgattcaaag tgggcacaga tggtgtgatt acagtcaaaa ggcctctacg
gtttcataac ccacagatcc atttcttggt gtacgcctgg gactccacct acagaaagtt
ttccaccaaagtcacgctga atacagtggg gcaccaccac cgccccccgc cccatcaggt
atgttggc
Exon 4: ttctttcctt ttaggcctcc gtttctggaa tccaagcaga attgctcaca tttcccaact
cctctcctgg cctcagaaga cagaagagag actgggttat tcctcccatc agctgcccag
aaaatgaaaa aggcccattt cctaaaaacc tggttcaggt agagaaac
Exon 5: cattttgtct tcagatcaaa tccaacaaag acaaagaagg caaggttttc tacagcatca
ctggccaagg agctgacaca ccccctgttg gtgtctttat tattgaaaga gaaacaggat
ggctgaaggt gacagagcct ctggatagag aacgcattgc cacatacact gtaagtatct
Exon 6: cttggttctt tcagctcttc tctcacgctg tgtcatcca cgggaatgca gttgaggatc
caatggagat tttgatcacg gtaaccgatc agaatgacaa caagcccgaa ttcacccagg
aggtctttaa ggggtctgtc atggaaggtg ctcttccagg tatatccac
Exon 7: ttgaactctt ccaggaacct ctgtgatgga ggtcacagcc acagacggcgg acgatgatgt
gaacacctac aatgccgcca tcgcttacac catcctcagc caagatcctg agctccctga
caaaaatatg ttcaccatta acaggaacac aggagtcatc agtgtggtca ccactgggct
ggaccgagag gtcaggggtc
Exon 8: cgatctctct gcagagtttc cctacgtata ccctggtggt tcaagatgct gaccttcaag
gtgaggggtt aagcacaaca gcaacagctg tgatcacagt cactgacacc aacgataatc
ctccgatctt caatcccacc acggtaattc tat
Exon 9: tctttgctct gcagtacaag ggtcaggtgc ctgagaacga ggctaacgtc gtaatcacca
cactgaaagt gactgatgct gatgccccca ataccccagc gtgggaggct gtatacacca
tattgaatga tgatggtgga caatttgtcg tcaccacaaa tccagtgaac aacgatggca
ttttgaaaac agcaaaggtt tgtatgg
Exon 10: tttctgctct ctagggcttg gattttgagg ccaagcagca gtacattcta cacgtagcag
tgacgaatgt ggtacctttt gaggtctctc tcaccacctc cacagccacc gtcaccgtgg
atgtgctgga tgtgaatgaa gcccccatct ttgtgcctcc tgaaaagaga gtggaagtgt
ccgaggactt tggcgtgggc caggaaatca catcctacac tgcccaggag ccagacacat
ttatggaaca gaaaataacg taagtgtga
Exon 11: ttgtccccgt tcagatatcg gatttggaga gacactgcca actggctgga gattaatccg
gacacaggtg ccatttccac tcgggctgag ctggagaccc aggattttga gcacgtgaag
aacagcacgt acacagaaat aatcatagct acagacaatg gtaagggggc
47

Exon 12: gtattttctc ttaggttctc cagttgctac tggaacaggg acacttctgc tgatcctgtc
tgatgtgaat gacaacgccc ccataccaga acctcgaact atattcttct gtgagaggaa
tccaaagcca caggtcataa acatcattga tgcagacctt cctcccaata catctccctt
cacagcagaa ctaacacacg gggcgactgc caactggacc attcagtaca
acgacccaag tgggtacct
Exon 13: attgctttct ccagcccaag aatctatcat tttgaagcca aagatggcct tagaggtggg
tgactacaaa atcaatctca agctcatgga taaccagaat aaagaccaag tgaccacctt
agaggtcagc gtgtgtgact gtgaaggggc cgccggcgtc tgtaggaagg cacagcctgt
cgaagcagga ttgcaaattc ctgccattct ggggattctt ggaggaattc ttgctttgct
aagtaagtcc ag
Exon 14: ccccaccatc ccagttctga ttctgctgct cttgctgttt cttcggagga gagcggtggt
caaagagccc ttactgcccc cagaggatga cacccgggac aacgtttatt actatgatga
agaaggaggc ggagaagagg accaggtggg ttttg
Exon 15: ttttttctcc aaaggacttt gacttgagcc agctgcacag gggcctggac gctcggcctg
aagtgacacg taacgacgtt gcaccaaccc tcatgagtgt cccccggtat cttccccgcc
ctgccaatcc cgatgaaatt ggaaatttta ttgatgaagt aagtaatc
Exon 16: cccttcttct tgagaatctg aaagcggctg atgctgaccc cacagccccg ccttatgatt
ctctgctcgt gtttgactac gaaggaagca gttccgaagc tgctagtctg agctccctga
actcctcaga gtcagacaaa gaccaggact atgactactt gaacgaatgg ggcaatcgct
tcaagaagct ggctgacatg tacggaggcg gcgaggacga ctaggggact
cgagagaggc gggccccaga cccatgtgct gggaaatgca gaaat
48

Tabelle V. 2: Ergebnisse der Sequenzierung:
Ergebnisse Melanom-Zellinien:
Mel Im : Exon 3: Base7 (Intron) Insertion G
Exon 4: Base 168 (Intron) Punktmutation C→G
Exon 16: Base 12 (Intron) Punktmutation G→T
Mel Im si : Exon 3: Base 7 (Intron) Insertion G
Exon 4: Base 168 (Intron) Punktmutation C→G
Exon 16: Base 12 (Intron) Punktmutation G→T
Mel Ju : Exon 3: Base 7 (Intron) Insertion G
Exon 4: Base 168 (Intron) Punktmutation G→T
Exon 16: Base 12 (Intron) Punktmutation G→T
Mel Wei : Exon 3: Base 7 (Intron) Insertion G
Exon 4: Base 168 (Intron) Punktmutation C→G
Exon 16: Base 12 (Intron) Punktmutation G→T
Mel Ho : Exon 3: Base 7 (Intron) Insertion G
Exon 4: Base 168 (Intron) Punktmutation C→G
Exon 16: Base 12 (Intron) Punktmutation G→T
49

Ergebnisse kolorektal Karzinom-Zelllinien:
CaCo : Exon 3: Base 7 (Intron) Insertion G
Exon 4: Base 168 (Intron) Punktmutation C→G
Exon 13: Base 139 Punktmutation C→T homozygot (Ala-Ala)
Exon 16: Base 12 (Intron) Punktmutation G→T
HCT 116 : Exon 3: Base 7 (Intron) Insertion G
Base 196 Deletion G heterozygot (Frame-shift-Mutation)
Exon 4: Base 168 (Intron) Punktmutation C→G
Exon 10: Base 11 (Intron) Punktmutation C→A
Exon 13: Base 139 Punktmutation C→T heterozygot (Ala-Ala)
Exon 16: Base 12 (Intron) Punktmutation G→T
SW 48 : Exon 3: Base 7 (Intron) Insertion G
Exon 4: Base 168 (Intron) Punktmutation C→G
Exon 13: Base 139 Punktmutation C→T heterozygot (Ala-Ala)
Exon 16: Base 12 (Intron) Punktmutation G→T
LoVo : Exon 3: Base 7 (Intron) Insertion G
Exon 4: Base 168 (Intron) Punktmutation C→G
Exon 13: Base 139 Punktmutation C→T heterozygot (Ala-Ala)
Exon 16: Base 12 (Intron) Punktmutation G→T
HT 29 : Exon 3: Base 7 (Intron) Insertion G
Exon 4: Base 168 (Intron) Punktmutation C→G
Exon 10: Base 11 (Intron) Punktmutation C→A
Exon 13: Base 139 Punktmutation G→T homozygot (Ala-Ala)
Exon 16: Base 12 (Intron) Punktmutation G→T
50

VI. DISKUSSION
Adhäsionsmoleküle sind transmembranöse Glykoproteine, die auf der Zellmembran
nahezu aller Körperzellen vorkommen. Sie besitzen zwei bindende Domänen: eine
extrazelluläre und eine intrazytoplasmatische, funktionelle. Die Adhäsionsmoleküle
treten typischerweise nur zeitlich begrenzt auf der Zellmembranoberfläche auf. Das
Vorhandensein oder Fehlen von Adhäsionsmolekülen kann die Fähigkeit mancher
maligner Tumoren, unkontrolliert zu wachsen, lokal zu invadieren und zu destruieren
oder zu metastasieren, in ganz entscheidendem Ausmaße beeinflussen.
Der durch Adhäsionsmoleküle vermittelte Kontakt zwischen zwei Zellen löst
verschiedene Signale aus: die Aktivierung intrazellulärer Botenstoffe für die Expression
verschiedener Gene, die Veränderungen von Proteinen des Zytoskeletts mit dem Ziel,
Zellbewegungen auszulösen und ferner die Aggregation von Oberflächenproteinen zur
Verstärkung von Zell-Zell-Kontakten und eine Exozytose.
Es werden fünf Hauptfamilien von Adhäsionsmolekülen unterschieden: die Integrine, die
Immunglobulinähnliche Superfamilie, die Selektine, die Cadherine und CD44.
(Oberholzer, 2001).
Das komplexe Zusammenspiel von Adhäsionsmolekülen bestimmt die Struktur und
Dynamik von Geweben. In neoplastischen Geweben ist dieses Zusammenspiel gestört.
Histopathologisch äußert sich dies in einer im Vergleich zum Normalgewebe
verminderten Differenzierung. Mit zunehmender Entdifferenzierung lösen sich einzelne
Zellen aus dem Gewebsverband. Vorausgesetzt, diese Zellen sind mobil und mit den
erforderlichen Bindungsproteinen ausgestattet, invadieren sie Lymphspalten und/oder
das interstitielle Bindegewebe. Der Verlust der Gewebsstruktur und invasives Wachstum
sind daher oft miteinander gekoppelt.
Da Zelladhäsionsmoleküle die Struktur eines Gewebes wesentlich bestimmen, kann der
Verlust adhäsiver Eigenschaften ursächlich für eine verminderte Differenzierung und
invasive Wachstumseigenschaften des Tumors verantwortlich sein.
51

Unter den verschiedenen Typen der Cadherine ist das E-Cadherin am besten
charakterisiert. Das E-Cadherin kommt vor allem in der Zona adhärens von Epithelzellen
vor und ist intrazellulär mit dem Zytoskelett über α-Actin verbunden. In verschiedenen
Geweben wurde E-Cadherin als das entscheidende Zelladhäsionsmolekül identifiziert,
welches für die Gewebsdifferenzierung zuständig ist und häufig bei metastasierenden
und invasiv wachsenden Karzinomen eine fehlende oder verminderte Expression zeigt
(Cowley et al., 1996, Sanders et al., 1999, Moll et al., 1993, Berx et al.,1995).
In der Literatur wurden bis jetzt verschiedene Mutationen des E-Cadherin Gens
beschrieben. So fand man sehr seltene Keimbahn-Mutationen im E-Cadherin Gen bei
Familien mit erblicher Prädisposition für Magen- und Mammakarzinome (Guilford et al.,
1998, Gayther et al., 1998, Keller et al., 1999).
Somatische Mutationen, die zum Verlust der E-Cadherin Expression geführt haben,
wurden weiterhin bei lobulären Mammakarzinomen und Magenkarzinomen vom diffusen
Typ beobachtet (Becker et al., 1994, Berx et al., 1995).
Für die verminderte Expression des E-Cadherins, wie sie häufig bei kolorektalen
Karzinomen beschrieben wurde, fand man keine Mutation (Braungart et al., 1999,
Schuhmacher et al., 1999). Andererseits, wenn Mutationen vorhanden waren, blieben
sie entweder stumm oder befanden sich im Intron-Bereich (Efstathiou et al., 1999).
Bei malignen Melanomen wurden bis jetzt keine Mutationen gefunden, vielmehr ergaben
sich Hinweise, die darauf deuten, dass die Regulation des E-Cadherins über andere
Mechanismen abläuft (Batsche et al., 1998, Poser et al., 2001).
52

Ziel dieser Arbeit war es daher, das vollständige E-Cadherin Gen hinsichtlich von
Mutationen zu analysieren. Dafür wurde aus fünf Melanom- und fünf kolorektalen
Karzinom-Zelllinien genomische DNA isoliert, die E-Cadherin Exone und Exon-Intron-
Übergänge mittels PCR amplifiziert und in einer direkten Cycle-Sequencing-Reaktion mit
kapillärer Elektrophorese analysiert.
Bei den kolorektalen Karzinom-Zelllinien konnte eine heterozygote Frame-shift-Mutation
in einer Zelllinie nachgewiesen werden. Darüber hinaus im Exon 13 eine Punktmutation,
die einen Polymorphismus des Kodons der Aminosäure Alanin darstellt.
Bei den Melanom-Zelllinien war keine Mutation zu finden.
Drei neue Punktmutationen fanden sich im Intron-Bereich bei allen Zelllinien.
Diese Ergebnisse unterstützen die These, dass die sehr häufig zu beobachtende
verminderte oder fehlende E-Cadherin Expression, nur selten mit Mutationen im E-
Cadherin Gen einhergeht, die zu einer strukturellen Inaktivierung des Proteins führen
(Hirohashi S., 1998).
Unter dem Gesichtspunkt der allgemeinen Tumorprogression, ist für die Ausbildung der
Metastasen ein funktionell intaktes E-Cadherin Gen wahrscheinlich sogar günstig. Von
Birchmeier (1994) wurde ein Modell entwickelt, das die epitheliale-mesenchymale
Konversion beschreibt. Demnach ist in Primärtumoren die E-Cadherin Expression
normal oder sogar gesteigert und die Tumorzellen haben ihre epitheliale Form. Wird die
E-Cadherin Expression reprimiert, beginnen die Zellen invasiv zu wachsen und nehmen
eine fibroblastenähnliche Form an. Diese Entdifferenzierung ist für die Tumorzellen
essentiell, um sich im Bindegewebe, entlang der Lymphbahnen oder Richtung
Blutgefässe zu wandern. Um allerdings solide Metastasen ausbilden zu können,
brauchen die Tumorzellen einen festen Zusammenhalt und damit auch E-Cadherin. So
beobachtet man in Metastasen eine erneute Re-Expression des E-Cadherins und eine
epitheliale Redifferenzierung der Tumorzellen.
53

Die Heraufregulierung des intakten Genes hilft bei der Etablierung der Fernmetastase.
Insofern sind komplett inaktivierende Mutationen beider Allele des E-Cadherin Gens in
diesen Tumoren offenbar selten.
Ähnliche Beobachtungen, die den Zusammenhang zwischen dem Verlust der E-
Cadherin Expression bzw. funktionsfähigem E-Cadherin und gleichzeitiger Aktivierung
anderer Proteine wie Fibronektin, Vimentin oder nuklearer β-Catenin und daraus
resultierendem Verlust der epithelialen Differenzierung beschrieben, wurden auch von
Brabletz et al., 2001 und Hirohashi, 1998 publiziert.
Brabletz (2002) wies auf das onkogene Potetial von nuklearem β-Catenin bei
kolorektalen Karzinomen hin. Eine große Gruppe von Genen, die die Umwandlung von
differenzierten, epithelialen zu entdifferenzierten, mesenchymalen Tumorzellen
bewirken, werden durch β-Catenin/TCF reguliert.
Auch bei malignen Melanomen ist die Herabregulation von E-Cadherin im Rahmen von
Invasion und Metastasierung ein transientes, transkriptionell über den
Transkriptionsfaktor Snail reguliertes Phänomen (Poser et al., 2001).
In der überwiegenden Mehrheit der Tumoren ist die Ursache für den Verlust von E-
Cadherin daher sehr heterogen (Moll et al., 1993). Die Herabregulierung des E-Cadherin
Gens wird auch von der „Mikro-Umgebung“ (microenvironment) der Tumorzellen
bestimmt (Vanderbossche et al., 1994, Mareel et al., 1991, Brabletz et al., 2001). Das
den Tumor umgebende Stroma und Stromazellen beeinflussen das Tumorwachstum
und Angiogenese durch verschiedene Enzyme und Zytokine.
Karzinome, bei denen inaktivierende Mutationen auftreten, sind vom
histomorphologischen Typ Tumoren, bei denen die Zellen vereinzelt und diffus wachsen,
wie das lobuläre Mammakarzinom und das diffuse Magenkarzinom. Diesen Tumoren
müssen daher andere molekulare Mechanismen der Metastasierung zugrunde liegen.
Diese Ergebnisse weisen darauf hin, dass sowohl interzelluläre Kontakte, biochemische
Prozesse oder interzelluläre Kommunikation die E-Cadherin Expression beeinflussen
54

können. Wie auch übereinstimmend in der hier vorliegenden Arbeit beobachtet wurde,
liegen irreversible genetische Alterationen der verminderten Transkription des E-
Cadherin Gens bzw. der verminderten E-Cadherin Expression und damit der Invasion
und Metastasierung bei malignen Melanomen und kolorektalen Karzinomen somit nicht
zugrunde.
55

VII. ZUSAMMENFASSUNG
E-Cadherin gehört zu einer Familie strukturell verwandter Proteine, die zu den
Zelladhäsionsmolekülen zählen. Es hat eine zentrale Bedeutung in der
Embryonalentwicklung und vermittelt wichtige Signale für die Morphogenese epithelialer
Gewebe. Darüber hinaus zeigen bisherige Forschungsergebnisse, dass E-Cadherin
eine wichtige Rolle in der Tumorprogression spielt. Verschiedene maligne Tumoren
zeigen bei Invasion der umgebenden Strukturen und auch bei Fernmetastasierung einen
Verlust oder Verminderung der E-Cadherin-Expression.
Der für diesen Verlust bzw. für die Regulation auf molekularer Ebene verantwortliche
Mechanismus ist weitgehend unbekannt. Eine Möglichkeit beinhaltet inaktiverende
Mutationen des E-Cadherin Gens.
In der vorliegenden Arbeit wurde daher untersucht, ob im E-Cadherin Gen Mutationen
zu finden sind, die den Verlust der Expression des E-Cadherins, die sowohl bei
malignen Melanomen als auch bei kolorektalen Karzinomen beobachtet wurden,
belegen würden und ob diese die bisherigen Erkenntnisse stützen.
Für diesen Zweck wurde aus fünf Melanom- und fünf kolorektalen Karzinom-Zelllinien
genomische DNA isoliert, die E-Cadherin Exone und Intron-Exon-Übergänge mittels der
Polymerase-Ketten-Reaktion (PCR) amplifiziert und in einer direkten Cycle-
Sequenzierung-Reaktion mit kapillärer Elektrophorese analysiert.
Bei den kolorektalen Karzinom-Zelllinien konnte eine heterozygote Frame-shift-Mutation
in einer Zelllinie nachgewiesen werden. Darüber hinaus im Exon 13 eine Punktmutation,
die einen Polymorphismus der Aminosäure Alanin darstellt. Bei den Melanom-Zelllinien
war keine Mutation zu finden. Drei neue Punktmutationen fanden sich im Intron-Bereich
bei allen Zelllinien, allerdings keine, die die Transkription oder die Translation des E-
Cadherins beeinflusst.
56

Diese Ergebnisse lassen vermuten, dass Mutationen im E-Cadherin-Gen für die
verminderte E-Cadherin-Expression nicht verantwortlich sind, sondern die
Fehlregulierung auf anderen molekularen oder zellulären Ebenen abläuft.
Die Herabregulierung von E-Cadherin bei der Tumorinvasion ist ein transientes
Phänomen und die Heraufregulierung des intakten Genes ist vielfach bei der Etablierung
von Fernmetastasen zu beobachten. Insofern sind komplett inaktivierende Mutationen
im E-Cadherin Gen offenbar selten und für den Ablauf der systemischen Metastasierung
in den meisten Fällen nicht verantwortlich.
57

VIII. LITERATURVERZEICHNIS
Aberle, H., H. Schwartz, R. Kemler: Cadherin-catenin complex: protein interactions and
their implications for cadherin function. J Cell Biochem: 61 (1996) 514
Baenkler, H.W. et al., Unter Mitarbeit von Clement, U. et al. : Innere Medizin. Stuttgart:
Hippokrates-Verlag im Thieme-Verlag, 1999
Bar-Eli, M. : Role of AP-2 in tumor growth and metastasis of human melanoma. Cancer
Metastasi Rev: 18 (1999) 377
Batsche, E., C. Murhardt, J. Behrens, H.C. Hurst, C. Cremisi: RB and c-Myc activate
expression of the E-Cadherin gene in epithelial cells through interaction with
transcription factor AP-2. Mol Cell Biol: 18 (1998) 3647
Battle, E., E. Sancho, C. Franci, D. Dominguez, M. Monfar, J. Baulida, D.H. Garcia: The
transcription factor Snail is a repressor of E-cadherin gene expression in epithelial tumor
cells. Nat Cell Biol: 2 (2000) 84
Becker, K.F., M.J. Atkinson, U. Reich, H.H. Huang, H. Nekarda, J.R. Siewert, H. Höfler:
Exon skipping in the E-cadherin gene transcript in metastatic human gastric carcinomas.
Hum. Mol. Genet.:2 (1993) 803
Becker, K.F., M.J. Atkinson, U. Reich, J. Becker, H. Nekarda, J.R. Siewert, H. Höfler: E-
cadherin gene mutation provide dues to diffuse type gastric carcinoma. Cancer Res: 54
(1994) 3845
58

Behrens, J., M.M. Mareel, F.M. Van Roy, W. Birchmeyer: Dissecting tumor cell invasion:
epithelial cells aquire invasive properties after the loss of uvomorulin-mediated cell-cell
adhesion. J Cell Biol: 108 (1989) 2435
Berx, G., A.M. Cleton-Jansen, F. Nolet, W.J. de Leeuw, M. van de Vijver, C. Cornelisse,
F. van Roy : E-cadherin is tumor/invasion supressor gene mutated in human lobular
breast cancers. EMBO J: 14 (1995) 6107
Berx, G. A.M. Cleton- Jansen, K. Strumane, W.J. de Leeuw, F. Nollet, F. van Roy, C.
Cornelisse: E-cadherin is inactivated in a majority of invasive human lobular breast
cancers by truncation mutation throughout its extracellular domain. Oncogene: 13 (1996)
1919
Birchmeier, W., J. Behrens: Cadherin expression in carcinomas: role in the formation of
cell juntions and the prevention of invasiveness. Biochem Biophys Acta: 1198 (1994) 11
Brabletz, T., A. Jung, S. Reu, M. Porzner, F. Hlubek, L.A. Kunz-Schughart, R. Knuechel,
T. Kirchner: Variable β-catenin expression in colorectal cancers indicates tumor
progression driven by the tumor environment. PNAS : Vol. 98 Nr. 18 (2001) 10356-
10361
Brabletz, T., A. Jung, T. Kirchner: β-Catenein and the morphogenesis of colorectal
cancer. Wirchows Arch. 441 (2002) 1-11
Bracke, M.E., F.M. van Roy, M.M. Mareel: The E-cadherin/catenin complex in invasion
and metastasis. Curr Top Microbiol Immunol: 213 (1996) 123
Braungart, E., C. Schuhmacher, E. Hartmann, H. Nekarda, K.F. Becker, H. Höfler, M.J.
Atkinson: Functional loss of E-cadherin and cadherin-11 alleles on chromosome 16q22
in colonic cancer. J Pathol: 187 (1999) 530
59

Brodt, P.: Cell Adhesion and Invasion in Cancer Metastasis. Springer, New York, Berlin,
Heidelberg 1996
Bruch, H.P., T.H.K. Schiedeck,, U.J. Roblick, O. Schwander: Was gibt es neues in der
kolorektalen Chirurgie? Meßmer, Wirte (Hrsg.) Was gibt es neues in der Chirurgie-
Berichte in chirurgischer Fort- und Weiterbildung. ecomed- Verlagsgesellschaft,
Landberg/Lech, Grundlagenwerk (1999 )
Cano, A., M.A. Perez-Moreno, I. Rodrigo, A. Locascio, M.J. Blanco, M.G. del Barrio,
M.A. Nieto. Nat Cell Biol: 2 (2000) 76
Clark, W.H., D.E. Elder, D. Guerry, M.N. Eppstein, M.H. Green, M. Van Horn: A study of
tumor progression: the precusor lesions of superficial spreading and nodular melanoma.
Hum Pathol: 15 (1984) 1147
Clark, W.H.: Tumor progrssion and the nature of cancer. Br J Cancer: 64 (1991) 613
Cowley, G.P., M.E.F. Smith: Cadherin expression in melanocytic naevi and malignant
melanomas. J Pathol: 179 (1996) 183
Dorudi, S., J.P. Sheffield, R. Poulson, J.M. Northover, I.R. Hart: E-cadherin expression
in colorectal cancers. An immuno-hystochemical and in situ hybridisation study. Am J
Pathol: 142 (1993) 981
Efstathiou, J.A., D. Liu, J.M.D. Wheeler, H.C. Kim, N.E. Beck et al.: Mutated epithelial
cadherin is associated with increased tumorigenicity and loss of adhesion and of
responsiveness to the motogenic trefoil factor 2 in colon carcinoma cells. Proc Natl Acad
Sci: USA: Vol 96, No.5 (1999) 2316
Frixen, U.H., J. Behrens, M. Sachs, G. Eberle, B. Voss, A. Warda, D. Löchner, W.
Birchmeier: E-cadherin-mediated cell-cell adhesion prevents invasiveness of human
carcinoma cells. J Cell Biol: 133 (1991) 173
60

Gayther, S.A., K.L. Gorringe, S.J. Ramus, D. Huntsman, F. Roviello, N. Grehan, J.C.
Machado, E. Pinto, R. Seruca, K. Halling, P. MacLeod, S.M. Powell, C.E. Jackson,
B.A.J. Ponder, C. Caldas: Identification of germ-line E-cadherin mutations in gastric
cancer families of european origin. Cancer Res: 58 (1998) 4086
Graff, J.R., J.G. Herman, R.G. Lapidus, H. Chopra, R.Xu, D.F. Jarrard, W.B. Isaacs,
P.M. Pitha, N.E. Davidson, S.B. Baylin:E-cadherin expression is silenced by DNA
hypermethylation in human breast and prostate carcinomas. Cancer Res: 55 (1995)
5195
Guilford, P., J. Hopkins, J. Harraway, M. McLeod, N. McLeod, P. Harawira, H. Taite, R.
Scoular, A. Miller, A.E. Reeve: E-cadherin germline mutations in familial gastric cancer.
Nature: 392 (1998) 402
Gumbiner, B.M.: Cell adhesion: the molecular basis of tissue architecture and
morphogenesis. Cell: 84 (1996) 345
Hatta, K., A. Nose, A. Nagafuchi, M. Takeichi: Cloning and expression of cDNA
encoding a neural calcium dependent cell adhesion molecule: its identity in the cadherin
gene family. J Cell Biol: 106 (1998) 873
Hendrix, M.J.C., E.A. Seftor, P.S. Metzer, L.M.G. Gardner, A.R. Hess, D.A. Kirschmann,
G.C. Schatteman, E.R.B. Seftor: Expression and functional significance of VE-cadherin
in aggressive human melanoma cells: Role in vasculogenic mimicry. PNAS: 98 (2001)
8018
Herold, G., et al. : Innere Medizin, Herold 1999
Hirohashi, S.: Inactivation of the E-cadherin-mediated cell adhesion system in human
cancer. AJP: 153 (1998) 333
61

Imhof, B.A., H.P. Vollmers, S.L. Goodman, W. Birchmeyer: Cell-cell interacion and
polarity of epithelial cells: specific perturbation using a monoclonal antybody. Cell: 35
(1983) 667
Jung, E.G., et al.: Dermatologie; Stuttgart: Hypokrates-Verlag, 1998
Kanai, Y., T. Oda, H. Tsuda, A. Ochiai, S. Hirohashi: Point mutation of the E-cadherin
gene in invasive lobular carcinoma of the breast. Jap. J. Cancer Res.: 85 (1994) 1035
Keller, G., H. Vogelsang, I. Becker, J. Hutter, K. Ott, S. Candidus, T. Grundei, K.F.
Becker, J. Mueller, J.R. Siewert, H. Höfler: Diffuse type gastric and lobular breast
carcinoma in a familial gastric cancer patient with an E-cadherin germline mutation. Am
J Pathol: 155 (1999) 337
Klein, P.J., H. Welmer, O. Wiestler, U.N. Riede: Autonomes Zellwachstum
(Tumorpathologie): Allgemeine und spezielle Pathologie; Stuttgart, New York; Thieme
1989
Mannori, G., D. Santoro, L. Carter, C. Corless, R.M. Nelson, M.P. Bevilacqua: Inhibition
of colon carcinoma cell lung colony formation by a soluble form of E-selectin. Am J
Pathol: 151 (1997) 233
Mareel, M.M., J. Behrens, W. Birchmeier, G.K. DeBruyne, K. Vleminckx, A. Hoogewijs,
W.C. Fiers, F.M. Van Roy: Downregulation of E-cadherin expression in madin darby
canine kidney ( MDCK) cells inside tumors of nude mice. Int J Cancer: 47 (1991) 922
Marrs, J.A., W.J. Nelson: Cadherin cell adhesion molecules in differentiaton and
embryogenesis. Int Rev Cytol: 165 (1996) 159
Melki, J.R., P. Vincent, R.D. Brown, S.J. Clark: Hypermethylation of E-cadherin in
leukemia. Blood: 95 (2000) 3208
62

Miguati, P., E. Robbins, D.B. Rifkin: Tumor invasion through the human amniotic
membran: requirement for a proteinase cascade. Cell: 47 (1986) 487
Moll, R., M. Mitze, U.H. Frixen, W. Birchmeier: Differential loss of E-cadherin expression
in infiltrating ductal and lobular breast carcinomas. AJP: 143 (1993) 1731
Mullis, K.B., F. Faloona, S. Scharf, R. Saiki, G.Horn, H. Ehrlich: Specific enzymatic
amplification of DNA in vitro. The polymerase-chain-reaktion. Cold Spring Harbour Symp
Quant Biology: 51 (1986) 263
Oda, T., Y. Kanai, T. Oyama, K. Yoshiura, Y. Shimoyama, W. Birchmeier, T. Sugimura,
S. Hirohashi: E-cadherin gene mutations in human gastric carcinoma cell lines. Proc.
Natl. Acad. Sci. USA. 91 (1994) 1858
Oberholzer, M.J.: Pathologie verstehen. Molekulare Grundlagen der allgemeinen
Pathologie. 2001 Georg Thieme Verlag, Stuttgart
Perera, F.P.: Environment and cancer: who are susceptible? Science: 278 (1997) 1068
Poser, I., D. Dominguez, A.G. Herreros, A. Varnai, R. Büttner, A.K. Bosserhoff: Loss of
E-cadherin expression in melanoma cells involves upregulation of the transcriptional
repressor Snail. J Biol Chem: 267(27) (2001) 24661
Riede, U.N., H.E. Schäfer, H. Wehner : Allgemeine und spezielle Pathologie. Stuttgart,
New York; Thieme 1989
Riesinger, J.I., A. Berchuck, M.F. Kohler, J. Boyd: Mutations of the E-cadherin gene in
human gynecologic cancers. Nature Genet. 7 (1994) 98
Ruiz, P., D. Dunon, A. Sonnenberg, B.A. Imhof: Supression of mouse melanoma
metastasis by EA-1, a monoclonal antybody specific for alpha6 integrins. Cell Adhes
Commun: 1 (1993) 67
63

Sanders, D.S., K. Blessing, G.A. Hassan, R. Bruton, J.R. Marsden, J. Jankowski:
Alteration in cadherin and catenin expression during the biological progression of
melanocytic tumors. Mol Pathol: 52(3) (1999) 151
Sanger, F., S. Nicklen & A.R. Coulson: DNA Sequenzing with chain termination
ihibitors. PNAS USA: 74 (1977) 5463
Schmiegel, W., G. Adler, U. Fölsch et al. : Prävention und Früherkennung in der
asymptomatischen Bevölkerung - Vorsorge bei Risikogruppen. Dt. Ärztebl.: 97 (2000)
2234
Schuhmacher, C., I. Becker, S. Oswald, M.J. Atkinson, H. Nekarda, K.F. Becker, J.
Mueller, J.R. Siewert, H. Höfler: Loss of immunohistochemical E-cadherin expression in
colon cancer is not due to structural gene alterations. Virchows Arch: 434 (1999) 489
Schumpelick, V., N.M. Bleese, U. Mommsen: Chirurgie. Ferdinand Enke Verlag
Stuttgart, 1999
Suzuki, S.T.: Structural and funktional diversity of cadherin superfamily: are new
members of cadherin superfamily involved in signal transduction pathway? J Cell
Biochem: 61 (1996) 531
Sy, M.S., Y.J. Guo, I. Stankovic: Inhibition of tumor growth in vivo with a soluble CD44-
immunoglobulin fusion protein. J Exp Med: 176 (1992) 623
Takeichi, M.: Morphogenetic roles of classic cadherins. Curr Oppin Cell Biol: 7 (1995)
619
Tamura, G., J. Yin, S. Wang, A.S. Fleischer, T. Zou, J.M. Abraham, D.Kong, K.N.
Smolinski, K.T. Wilson, S.P. James, S.G. Silverberg, N. Nishizuka, M Terashima, T.
Motoyama, S.J. Meltzer: E-cadherin gene promoter hypermethylation in primary human
gastric carcinomas. J Natl Cancer Inst: 92 (2000) 569
64

Umbas, R., W.B. Isaacs, P.P. Bringmer, H.E. Schafsma, H.F. Kaarthans, G.O.
Oosterhof, F.M. Debruyne, J.A. Schalken: Decreased E-cadherin expression is
associated with poor prognosis in patients with a prostate cancer. Cancer Res: 54
(1994) 3929
Vandenbossche, G.M.R., G.K. DeBruyne, E.A. Bruyneel, G: Clemminck, K. Vleminckx,
F.M. VanRoy, M.M.Mareel: Int J Cancer: 57 (1994) 73
Vleminckx, K., L.Vakaet, M. Mareel, W. Fries, F. van Roy: Genetic manipulation of E-
cadherin expression by epithelial tumor cells reveals an invasion supressor role. Cell: 66
(1991) 107
Vogelstein, B., E.R. Fearon, S.R. Hamilton, S.E. Kern, A.C. Preisinger, M. Leppert, Y.
Nakamura, R. White, A.M.M. Smith, J.L. Bos: Genetic alterations during colorectal
development. N Engl J Med: 319 (1988) 525
Wagener, C.:Molekulare Onkologie: Entstehung und Progression maligner Tumoren.
Thieme; Stuttgart, New York: 1999
Weiß, J., C. Garbe, J. Bertz: Risikofaktoren für die Entwicklung maligner Melanome in
der Bundesrepublik Deutschland. Hautarzt 41 (1990) 593
Xie, S., M. Luca, S. Huong, M. Gutman, R. Reich, J.P. Johnson, M. Bar-Eli: Expression
of MCAM/MUC18 by human melanoma cells leads to increased tumor growth and
metastasis. Cancer Res: 57 (1997) 2295
65

IX. ANHANG
Danksagung
Die vorliegende Arbeit entstand unter Anleitung von Prof. Dr. med. Reinhard Büttner
am Institut für Pathologie des Universitätsklinikums der RWTH Aachen.
Mein besonderer Dank gehört Prof. Dr. med. Reinhard Büttner für seine Unterstützung,
Hilfe und Verständnis.
Prof. Dr. rer.nat. Anja-Katrin Bosserhoff danke ich für ihre Hilfe, Anregungen und
praktische Hilfeleistung.
Allen Mitarbeitern der Abteilung möchte ich für die Hilfe und das gute Arbeitsklima
danken, ganz besonders Inge Losen, Sandra Reuschenberg und Ellen Paggen.
Mein Dank gehört noch allen Mitarbeitern des Instituts für Pathologie Bonn-Duisdorf,
der IMoGen GmbH und Bollmann.com. Dr. Norbert Speich danke ich für die schnelle
Hilfe bei der Sequenzierung einiger Proben. Oliver Hahn danke ich für die
technische Hilfe am PC.
Besonderer Dank auch meinen Eltern Dr. med. Reinhard Bollmann und
Dr. med. Magdolna Bollmann für ihre Zuversicht und Unterstützung.
Dr.med. Levente Varnai und Kai Händel danke ich für die moralische Unterstützung.
66

Lebenslauf
Persönliche Daten
Name, Vorname: Varnai, Alinda Dalma
Anschrift: Moltkestr.32, 50674 Köln
Telefonnummer: 0179-7072176
Geburtsdatum: 17.05.1976
Geburtsort: Pecs, Ungarn
Nationalität: Niederländisch
Religion: katholisch
Familienstand: ledig
Schulbildung
1982 – 1990 Besuch der Grundschulen in Knezevi Vinogradi, Osijek und
Zagreb, Kroatien
1990 – 1991 Besuch des Naurwissenschaftlichen Gymnasiums Zagreb
1991 – 1995 Besuch des Mathematisch Naturwissenschaftlichen
Gymnasiums Mönchengladbach
1995 Abitur
Studium
Seit 1995 Studium der Medizin an der RWTH Aachen
September 1997 Ärztliche Vorprüfung
September 1998 1. Staatsexamen
März 2001 2. Staatsexamen
Bis März 2002 Praktisches Jahr im Klinikum der RWTH Aachen
25.06.2002 Ärztliche Prüfung (3. Staatsexamen)
01.08.2002 Ärztin im Praktikum in der Chirurgischen Abteilung
Marienhospital, Euskirchen
Publikation
„Loss of E-cadherin expression in melanoma cells involves upregulation of the transcriptional repressor
Snail“ (Poser, I. et al., J Biol Chem: 267(27), April 2001)
Sprachkenntnisse
Ungarisch (Muttersprache)
Deutsch, fließend
Englisch, fließend
Kroatisch, fließend
Serbisch, fließend
Niederländisch, Grundkenntnisse
67