Inaktivierung von Proteinen und Zellen durch Laserbestrahlung von ...

Aus der Medizinischen Laserzentrum Lübeck GmbH,
wissenschaftliche Einrichtung an der Universität zu Lübeck
Forschungsleiter und Geschäftsführer:
Prof. Dr. phil. nat. Reginald Birngruber
Inaktivierung
von
Proteinen und Zellen
durch
Laserbestrahlung von Mikropartikeln
Inauguraldissertation
zur
Erlangung der Doktorwürde
der Universität zu Lübeck
Technisch-Naturwissenschaftliche Fakultät
vorgelegt von
Benno Radt
aus Istanbul
Lübeck 2002

Radt, Benno:
Inaktivierung von Proteinen und Zellen durch Laserbestrahlung von
Mikropartikeln / Benno Radt. –
Als Ms. gedr.. – Berlin : dissertation.de – Verlag im Internet GmbH, 2003
Zugl.: Lübeck, Univ., Diss., 2002
ISBN 3-89825-617-0
1.Berichterstatter: Prof. Dr. phil. nat. Reginald Birngruber
2.Berichterstatter: Prof. Dr. rer. nat. Johannes Gerdes
Tag der mündlichen Prüfung: 17.01.2003
Zum Druck genehmigt Lübeck, den 17.01.2003
gez. Prof. Dr. math. Rüdiger Reischuk
-Dekan der Technisch-Naturwissenschaftlichen Fakultät-
Bibliografische Information Der Deutschen Bibliothek
Die Deutsche Bibliothek verzeichnet diese Publikation in der Deutschen
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URL: http://www.dissertation.de

Inhaltsverzeichnis
1 Einleitung 1
2 Theorie 9
2.1 Struktur und Stabilität von Proteinen . . . . . . . . . . . . . . . . 9
2.1.1 Struktur der Proteine . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 11
2.1.2 Stabilität und thermische Denaturierung von
Proteinen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 13
2.1.3 Photochemie . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 20
2.1.4 Grenzflächendenaturierung . . . . . . . . . . . . . . . . . . 22
2.2 Enzyme als Modellsystem für
thermische Proteinschäden . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 22
2.2.1 α-Chymotrypsin . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 23
2.2.2 alkalische Phosphatase . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 25
2.3 Verdampfung und Sieden in Tropfen oder Blasen . . . . . . . . . . 26
2.3.1 Verdampfen und Sieden um Nanopartikel . . . . . . . . . . 26
2.4 Wärmeleitung von Partikeln
in die Umgebung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 32
2.5 Eigenschaften von
Nano- und Mikroabsorbern . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 38
2.5.1 Gold-Nanoabsorber . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 38
2.5.2 Magnetit-Mikroabsorber . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 49
3 Material und Methoden 53
3.1 Lasersysteme . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 53
3.1.1 Mikrosekundenpuls-Laser . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 54
3.1.2 Nanosekundenpuls Nd:YAG Laser . . . . . . . . . . . . . . 62
3.1.3 Pikosekundenpuls Nd:Ylf Laser . . . . . . . . . . . . . . . 63
iii

iv
3.2 Bestrahlung der Proben . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 65
3.2.1 Homogenisierung durch Fasern . . . . . . . . . . . . . . . . 65
3.2.2 Raumfrequenzfilterung des
Nanosekundenpuls Lasers . . . . . . . . . . . . . . . . . . 69
3.2.3 Bestrahlung mit einem TEM00 Laser . . . . . . . . . . . . 70
3.2.4 Bestrahlung der Mikroabsorber-Konjugate . . . . . . . . . 75
3.2.5 Bestrahlung der Goldkonjugate . . . . . . . . . . . . . . . 76
3.3 Zusammenfassung der
Bestrahlungsparameter . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 79
3.4 Aufbau zur Probenherstellung und
Bestrahlung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 81
3.4.1 Nanoliterproben . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 81
3.4.2 Optimierter Aufbau zur Handhabung von
Nanoliterproben . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 94
3.4.3 Mikroliter-Probenplatten und Druckkammer . . . . . . . . 99
3.5 Herstellung der Enzym-Absorberkonjugate
und Ablauf der Experimente . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 102
3.5.1 Enzymassays . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 102
3.5.2 Goldkonjugate . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 105
3.5.3 Ablauf der Experimente mit Goldkonjugaten . . . . . . . . 110
3.5.4 Mikroabsorber-Konjugate . . . . . . . . . . . . . . . . . . 111
3.5.5 Ablauf der Experimente mit Mikrometerkonjugaten . . . . 113
3.5.6 Parameterübersicht Enzym-Absorber-Konjugate . . . . . . 114
3.6 Mikroskopische Blasendetektion . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 114
3.7 Wasserbadexperimente . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 116
3.8 Zellexperimente . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 116
4 Ergebnisse 121
4.1 Absorber-Fragmentierung und
Blasenbildungsschwelle . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 121
4.1.1 Mikrometer-Partikel . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 121
4.1.2 Gold-Nanoabsorber . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 125
4.2 Sekundentemperatursprünge im Wasserbad . . . . . . . . . . . . . 130
4.2.1 Denaturierungsrate von alkalischer Phosphatase . . . . . . 130
4.2.2 Einfluß der Enzym-Konjugatbindung . . . . . . . . . . . . 132
4.3 Photostabilität der Enzyme . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 134

4.4 Bestrahlung der Mikrometerkonjugate . . . . . . . . . . . . . . . . 135
4.4.1 Polystyren-Magnetitabsorber . . . . . . . . . . . . . . . . . 136
4.4.2 Silika-Magnetitabsorber . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 138
4.5 Bestrahlung der Gold-Nanometerkonjugate . . . . . . . . . . . . . 143
4.5.1 Nanosekundenpuls-Bestrahlung der Goldkonjugate . . . . . 143
4.5.2 Pikosekundenpuls-Bestrahlung der Goldkonjugate . . . . . 146
4.5.3 Abstandsabhängigkeit der Inaktivierung . . . . . . . . . . 149
4.5.4 Diffusion der Konjugate . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 151
4.6 Selektive Schädigung von Zellen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 152
4.6.1 Selektivität und Effizienz der Zellschädigung . . . . . . . . 155
4.6.2 Zellschädigung in Abhängigkeit
von den Inkubationsbedingungen . . . . . . . . . . . . . . 155
4.6.3 Zelluläre Effekte innerhalb von 24h . . . . . . . . . . . . . 157
4.6.4 Einfluß der Inkubationstemperatur . . . . . . . . . . . . . 158
5 Modellierung der Schäden 167
5.1 Partikeltemperaturen und -fragmentierung . . . . . . . . . . . . . 167
5.1.1 Temperaturverlauf auf Mikropartikeln . . . . . . . . . . . 169
5.1.2 Temperaturverlauf auf Gold-Nanopartikeln . . . . . . . . . 171
5.2 Berechnung der Proteinschäden . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 174
5.2.1 Berechnung der Schäden an Nanogoldkonjugaten
nach der Arrheniusgleichung . . . . . . . . . . . . . . . . . 177
5.2.2 Berechnung der Schäden an Nanogoldkonjugaten
nach einem Schwellwertprozeß . . . . . . . . . . . . . . . . 183
6 Diskussion 185
6.1 Thermische Mikroeffekte . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 185
6.1.1 Einfluß der Protein-Partikel-Bindungen auf die
thermische Denaturierungskinetik . . . . . . . . . . . . . . 187
6.1.2 Temperaturen an Mikroabsorbern . . . . . . . . . . . . . . 188
6.1.3 Inaktivierung nach dem Arrheniusmodell . . . . . . . . . . 190
6.2 Inaktivierung von Proteinen
durch Gold-Nanopartikel . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 196
6.2.1 Fragmentierung und Blasenbildung . . . . . . . . . . . . . 196
6.2.2 Photochemie . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 201
6.3 Selektive Schädigung von Zellen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 204
v

vi
6.3.1 Schadensreichweite der Goldkonjugate . . . . . . . . . . . 205
6.3.2 Mechanismen der Zellschäden . . . . . . . . . . . . . . . . 206
7 Ausblick 209
7.1 Thermische Proteindenaturierung . . . . . . . . . . . . . . . . . . 209
7.2 Biologisch beschichtete Absorber
als Mikroreaktoren . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 210
7.3 Selektive Proteininaktivierung
oder Zellabtötung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 212
7.4 Handhabung von Nanoliterproben . . . . . . . . . . . . . . . . . . 214
8 Zusammenfassung 217

Kapitel 1
Einleitung
Laser ermöglichen Materialbearbeitung mit höchster Präzision. Dies ist ein Anreiz,
auch in der Medizin feinste Strukturen mit einer räumlichen Präzision von
zellulären bzw. subzellulären Ausmaßen zu manipulieren und damit in den Bereich
der Zellchirurgie vorzustoßen.
Hierfür bestehen zwei Ansätze: Erstens können mit fokussierten Lasern Strukturen
in Zellen geschädigt werden. Zweitens können Schäden an Strukturen induziert
werden, wenn diese eine deutlich höhere Absorption aufweisen als ihre
Umgebung.
Im ersten Fall der Manipulation von Zellen durch fokussierte Bestrahlung wird
die Präzision durch die beugungsbegrenzte Fokusgröße von sichtbarem Licht begrenzt,
die bei ca. 500 nm liegt. Dies entspricht ca. 5% der lateralen Ausdehnung
einer Zelle, so dass man im günstigsten Fall damit rechnen kann, ganze
Zellorganellen zu schädigen. Durch nichtlineare Absorptionsprozesse wie 2-
Photonenabsorption oder Plasmabildung kann eine laserinduzierte Veränderung
auch etwas unterhalb der beugungsbegrenzten Fokusgröße liegen [93, 94, 100,
175, 176, 193]. Ein Problem dieses Ansatzes stellt das notwendige Zielen dar, da
eine so feine Zielstruktur nur aufwendig immobilisiert werden kann. Medizinische
Anwendungen mit einem zu behandelnden Areal von nur einigen Quadratzentimetern
Größe an einer Vielzahl von Zellen sind deshalb kaum vorstellbar. Selbst
zur Behandlung von aus dem Körper gewonnenen Zellen ist eine Zieleinrichtung,
die alle Zellen verändert, technisch so aufwendig und die Behandlung so langwierig,
dass Zellchirurgie durch fokussierte Laserstrahlung nur in der zellbiologischen
Forschung denkbar ist. Im zweiten Ansatz wird die Selektivität durch eine
1

2 Einleitung
lichtabsorbierende Struktur, die sich selektiv am Zielort anreichert bzw. schon
vorhanden ist, erreicht. Sind solche Stoffe in den Zellen oder im Gewebe vorhanden,
so können diese mit einem Laser bestrahlt werden, der nur von den Stoffen
absorbiert wird und lokal zu einem Effekt führt.
Beispiele sind die photodynamische Therapie (PDT), Chromophore Assisted Laser
Inactivation (CALI) und die selektive Thermolyse. PDT und CALI basieren
auf photochemisch aktiven Stoffen, die als künstliche lichtabsorbierende Strukturen
in die Zielregion gebracht werden. PDT wird als medizinisch-therapeutische
Anwendung z. B. für die Behandlung von Tumoren [75, 82] eingesetzt oder für die
Behandlung der altersbedingten Makuladegeneration klinisch getestet [23, 166].
Bei CALI werden photochemisch wirksame Farbstoffe über Antikörper an ihr Antigen
gebracht, um dieses durch eine photochemische Reaktion zu inaktivieren.
Verschiedene photochemisch wirksame Substanzen wurden getestet, die häufig
über eine sauerstoffabhängige photochemische Reaktion wirken. Die räumliche
Präzision wird durch die Diffusion der photochemischen Reaktionsprodukte bestimmt
und ist stark von der Mikroumgebung der Reaktionsorte abhängig.
Die selektive Thermolyse [6, 7] basiert auf einer thermisch induzierten Zerstörung
der Zielstruktur. Natürlich vorkommende lichtabsorbierende Strukturen wie z. B.
Melaningranula [160] oder Hämoglobin in Gefäßen [104] wurden genutzt, um diese
zu erhitzen und so deren Umgebung thermisch zu schädigen. Der thermische
Schaden wird hier auf die mikrometer- bis millimetergroßen Strukturen begrenzt,
indem die Bestrahlungsdauer an die Wärmeleitungsdauer in dem erhitzten Areal
angepaßt wird. Die Bestrahlung muss für eine hohe Präzision demnach dann
abgebrochen werden, wenn die direkte Umgebung der Absorber erhitzt wurde.
Die tolerable Bestrahlungsdauer kann durch die thermische Relaxationszeit τ
des zu erhitzenden Volumens abgeschätzt werden, wobei κ die Diffusivität des
Mediums und d der Durchmesser des Absorbers ist [85].
Heizdauer ≤ τ ≈ d2
(1.1)
27κ
Die thermische Relaxationszeit der Absorber begrenzt somit die Zeit, innerhalb
derer der thermische Schaden stattgefunden haben muss. Für Gefäße mit einigen
10 µm Durchmesser liegt die Bestrahlungsdauer bei Millisekunden. Bei mikrometergroßen
Strukturen im Mikrosekundenbereich. Will man eine höhere räumliche
Auflösung erreichen, so muss sowohl die absorbierende Struktur verkleinert als
auch die Heizdauer verkürzt werden. Dieser Zusammenhang von Absorbergröße

Einleitung 3
und Bestrahlungszeit ist in Abbildung 1.1 dargestellt, der die thermischen Eigenschaften
von Wasser zugrundeliegen. Wählt man sehr kurze Heizdauern, so
können durch thermoelastische Expansion erzeugte Unterdrücke zu einer Kavitationsblasenbildung
führen. Diese akustischen Phänomene werden im akustischen
Einschluß relevant, wenn ein Volumen schneller aufgeheizt wird als die durch die
Wärmeausdehnung induzierte Druckwelle braucht, um das geheizte Volumen zu
verlassen. Die Zeiten für den akustischen Einschluß in Wasser, die beim Erhitzen
eines Volumens zur Vermeidung von Kavitation nicht unterschritten werden
sollten, sind ebenfalls in Abbildung 1.1 dargestellt.
Abbildung 1.1: Zusammenhang zwischen Absorbergröße und Bestrahlungszeit, in
der eine selektive Thermolyse ohne thermoelastisch induzierte Kavitation möglich erscheint;
Dargestellt ist der Bereich des thermischen Einschlusses nach Gleichung 1.1
und des akustischen Einschlusses nach (τakust ≤ d ). Bestrahlt man mit Pulsdau-
vSchall
ern länger als der thermische Einschluß, so kommt es aufgrund der Wärmeleitung zu
einem räumlich wachsenden Schaden. Bestrahlt man mit zu kurzen Dauern, so gelangt
man in den Bereich des akustischen Einschlusses, in dem mechanische Schäden
durch Druckwellen und Kavitationsblasen zu erwarten sind. Auf der zweiten Ordinate
sind Lasertypen aufgetragen, mit denen Heizdauern gut erzeugt werden können, die zu
den jeweiligen thermischen Relaxationszeiten passen.(Er: Erbium; Nd: Neodym; YAG:
Yttrium Aluminium Granat; Ylf: Yttrium Lithium Fluorid).
Proteindenaturierung spielt als Schadensmechanismus bei thermisch induziertem
Zelltot eine zentrale Rolle [18, 109, 128, 161]. Gleichzeitig sind Proteine ein
wichtiger Ansatzpunkt zum Verständnis von Zellfunktionen. Für eine Induktion
von zellulären oder auch subzellulären Effekten stellt sich deswegen die Frage,

4 Einleitung
in welchen Zeiten und bei welchen Temperaturen eine thermische Denaturierung
von Proteinen innerhalb des thermischen Einschlusses möglich ist [84].
Die Beschreibung der Denaturierungskinetik von Proteinen, Zellen und Gewebe
nach einem einfachen Ratenprozeß und damit nach der Arrheniusgleichung hat
sich bis 100◦Cbewährt. Danach steigen die Schädigungsraten exponentiell mit
der reziproken Temperatur.
Um einen präzisen Effekt zu induzieren, darf die thermische Relaxationszeit des
zu schädigenden Areals von der Laserpulsdauer nicht wesentlich überschritten
werden. D. h. für präzise Schäden nimmt die Zeit, in der der Effekt induziert
werden muss, ab. Um die kurze Zeit zu kompensieren, muss eine höhere Temperatur
an der Partikeloberfläche induziert werden, so dass die biochemischen
Reaktionen in dem geheizten Areal schneller ablaufen.
In Abbildung 1.2 sind extrapolierte thermischen Schädigungsdauern von Proteinen
und Gewebe [145] in einer Arrheniusdarstellung aufgetragen. Zusätzlich ist
die thermische Relaxationszeit nach Gleichung 1.1 von möglichen Zielvolumen auf
der 2. Ordinate aufgetragen, die die Zeit, in der die Reaktion stattfinden muss,
begrenzt. Man kann demnach aus dieser Auftragung ablesen, in welchem Zeitund
Temperaturbereich eine Inaktivierung von Proteinen nach den extrapolierten
Daten erwartet werden kann.

Einleitung 5
Schädigungszeit [s]
10 -10
10 -9
10 -8
10 -7
10 -6
10 -5
10 -4
10 -3
10 -2
10 -1
10 1
10 2
10 0
10 -11
10 -12
Temperatur [°C]
180 160 140 120 100 80 60 40 20
0.0022 0.0024 0.0026 0.0028 0.003 0.0032 0.0034
1/Temperatur [1/K]
1
3
4
2
5
1 Retina
2 Haut
3 Hühnereiweiß
4 Chymotrypsin
5 Photobakterien
-2
10
-3
10
-4
10
-5
10
10 -6
10 -7
10 -8
Abbildung 1.2: Arrheniusdarstellung der extrapolierten Denaturierungskinetik verschiedener
Proteine in Zusammenhang mit der Absorbergröße, an der eine Denaturierung
innerhalb der thermischen Relaxationszeit zu erwarten ist. Der Bereich, in dem
eine thermische Denaturierung zu erwarten ist, ist hinterlegt. Der Bereich, in dem die
Denaturierung gemessen wurde, ist in den einzelnen Graphen fett gezeichnet. Nach dieser
Darstellung existiert ein Parameterbereich hoher Temperaturen und kurzer Zeiten,
in dem eine thermische Denaturierung innerhalb von Nanosekunden bei Temperaturen
unter 200◦C ohne Blasenbildung möglich ist. (Daten aus: Retina (1) [19], Haut (2)
[77], Hünereiweiß (3) [202], Chymotrypsin (4) [149], Photobakterien (5) [89]).
Nach dieser Extrapolation sollte es möglich sein, innerhalb von Mikrosekunden
einige Proteine thermisch bei ca. 100◦Czuschädigen. Dies sollte eine Schadensreichweite
im Mikrometerbereich ermöglichen. Innerhalb von Nano- bis Pikosekunden
kann eine thermische Inaktivierung erwartet werden, sobald Temperaturen
im Bereich von 150 bis 200◦C induziert werden. Nach der Wärmeleitung liegt
die Größe des erhitzen Volumens dann bereits im Bereich von 100 nm.
Temperaturen im Bereich von 150 bis 200 ◦Ckönnen in der Umgebung von Partikeln
ohne Kavitation oder Sieden des Wassers induziert werden, da die Oberflächenspannung
von Wasser eine Blasenbildung in diesem Temperaturbereich bei
Heizdauern bis zu Mikrosekunden verhindert. Überhitzungen bis zum spinodalen
Durchmesser der Struktur [m]

6 Einleitung
Punkt bei ca. 300 ◦ C sind bei Nanopartikeln denkbar.
Da thermisch induzierte Effekte eine Additivität besitzen, können die notwendigen
Temperaturen durch mehrfache Bestrahlung gesenkt werden. Hierdurch
kann eine längere effektive Heizzeit bei gleichzeitiger Lokalisierung der Temperatur
erreicht werden. Dieser Ansatz der selektiven Thermolyse der Umgebung
von Melaningranula mit Mehrfachpulsen ist für eine selektive Schädigung des retinalen
Pigmentepithels (RPE) von Birngruber vorgeschlagen worden [20]. In
Analogie dazu ist es denkbar, mit Pikosekundenpulsen an der Oberfläche von nanometergroßen
Absorbern einen Proteinschaden mit einer Ausdehnung von nur
10 nm bei einer Temperatur von ca. 180◦C zu induzieren. Ein neuer vielversprechender
Ansatz zur Inaktivierung von zellulären- bis hin zu subzellulären
Strukturen ist demnach, Absorber, die als stark lokalisierte Hitzequellen wirken,
für eine Inaktivierung der Proteine oder Zellen zu nutzen.
Für eine praktische Anwendung müssen die Absorber zwei Voraussetzugen erfüllen:
Die Absorber müssen stark absorbierend und photostabil sein, so dass Temperaturen
bis 300◦C induziert werden können, ohne Schäden durch die Restabsorption
des Gewebes bzw. der Zellen zu erzeugen. Außerdem müssen die Absorber derart
beschichtet werden können, dass sie selektiv an ein Zielantigen binden können.
Die Voraussetzungen werden von einer zunehmenden Anzahl von anorganischen
Partikeln erfüllt. Metall-, Halbleiter- und Magnetitpartikeln besitzen eine hohe
Absorption und können mit Antikörpern oder Antikörperfragmenten beschichtet
werden, so dass eine selektive Anreicherung solcher Partikel an Zielstrukturen gut
vorstellbar ist.
Ziel der vorliegenden Arbeit war es, Partikel mit Durchmessern im Mikrometerund
Nanometerbereich daraufhin zu untersuchen, inwieweit man mit ihrer Hilfe
Proteine laserinduziert inaktivieren kann, und welche Partikel- und Laserparameterbereiche
für eine Nutzung der Partikel zur Modifikation von zellulären oder
subzellulären Strukturen sinnvoll sind. Als erste Fragestellungen wurde formuliert:
• Ist eine thermische Inaktivierung von Proteinen innerhalb von Mikrosekunden
möglich ?
• Folgt die Inaktivierungskinetik der Arrheniuskinetik, die für Schäden bei
längerenZeiteninAbhängigkeit von der Temperatur beobachtet wurde ?

Einleitung 7
Der experimentelle Ansatz zur Bearbeitung der Fragestellungen bestand darin,
proteinbeschichtete Absorber mit jeweils zur Absorbergröße passenden Pulsdauern
zu erhitzen und anschließend die Proteinfunktion zu messen (Abbildung 1.3).
Durch die Bestrahlung der Absorber werden an den Absorberoberflächen Temperatursprünge
im Mikrosekunden- bis in den Pikosekundenbereich induziert.
Als Modellsystem zur Untersuchung von Proteininaktivierung wurden mit Enzymen
beschichtete Absorber genutzt (Abbildung 1.3).
Protein (aP)
4MUP
denaturiertes Protein
Fluoreszenz
4MU
E
[mJ]
1 2 3 4
Laserpuls
4MUP: Enzymsubstrat
t [µs]
Mikro- Nanoabsorber
Abbildung 1.3: Modellsystem zur Untersuchung laserinduzierter Mikroeffekte. Dargestellt
ist ein Absorber mit Enzymbeschichtung, der während des Laserpulses die Proteinschicht
heizt. Die Enzymaktivität, die nach dem Erhitzen dauerhaft erhalten bleibt,
kann mit Enzymsubstraten quantitativ gemessen werden. Dargestellt ist stellvertretend
alkalische Phosphatase (aP) mit dem Fluoreszenzsubstrat 4-Methyl-Umbelliferyl-
Phosphat 4MUP.
Der endgültige Verlust der Enzymaktivität der Enzym-Absorber-Konjugate wurde
als Maß für die Proteindenaturierung benutzt. Aus der Abhängigkeit der Inaktivierung
von der Bestrahlung, der Pulslänge und der Pulszahl sollte geschlossen
werden, ob die Proteindenaturierung dem Arrheniusgesetz auch bei kurzen Heizraten
folgt.
Noch während der Bearbeitung der ersten Fragestellung zeigte sich, dass eine
Inaktivierung im Temperaturbereich der erwarteten Schäden nach der Arrheni-
4MUP
X

8 Einleitung
usgleichung nur in Zusammenhang mit Aggregationseffekten beobachtet werden
konnte und damit stark von der Umgebung und dem betrachteten System abhing.
Deshalb orientierten sich weitere Experimente an der zweiten Fragestellung:
• Können durch die hohen, kurz anhaltenden Temperaturen, die sich in der
Umgebung vor allem von Gold-Nanopartikeln erzeugen lassen, selektiv Proteine
inaktiviert und Zellen geschädigt werden?
Für die experimentellen Untersuchungen wurden Laser mit Pulslängen von 35
Pikosekunden bis 15 Mikrosekunden eingesetzt, die zum Teil für die Arbeit aufgebaut
bzw. modifiziert wurden.
Um die Konjugate auch bei hohen Bestrahlungsstärken untersuchen zu können,
wurde ein Aufbau zur Erstellung, Bestrahlung und Auswertung von Proben mit
Nanolitervolumina entwickelt.

Kapitel 2
Theorie
2.1 Struktur und Stabilität von Proteinen
Die für das Verständnis von biochemischen Reaktionen, die eine Denaturierung
von Proteinen zur Folge haben, wichtigen Strukturen und die Größenordnungen
der beteiligten physikalischen Parameter Ort, Zeit und Energie werden im Folgenden
kurz beleuchtet.
Zeit-, Größen- und Energieskalen
Wichtig ist, eine Vorstellung von den Größenordnungen der für Proteine relevanten
Strukturen zu bekommen (Abbildung 2.1).
C-C Bindung Hämoglobin
Lichtmikroskopische
Auflösung
Bakterium Erythrocyt
Glucose
Ribosom
0,1 nm
3
1 nm 10 nm 100 nm 10 nm
4
10 nm
Abbildung 2.1:
[183](verändert).
Größe verschiedener biologischer Strukturen. Abbildung nach
Proteine sind ca. 2 bis 3 Größenordnungen größer als C-C Bindungen. Die maximale
Ausdehnung der meisten Proteine umspannt einen Bereich von 5 bis 50 nm.
9

10 Theorie
Dabei existiert eine Vielzahl an Proteinformen. Proteine, die nicht ortsfest in der
Zelle sind, besitzen meist eine globuläre Struktur. Einige Strukturproteine wie
z.B. Kollagen sind langgestreckt und haben ein Längen-zu-Durchmesserverhältnis
von 1/10. Proteine sind somit ein bis zwei Größenordnungen kleiner als Zellorganellen
oder die lichtmikroskopische Auflösung.
Um eine Vorstellung von den Geschwindigkeiten möglicher Reaktionen, die bei
der Denaturierung von Proteinen eine Rolle spielen, zu bekommen, ist in Abbildung
2.2 eine Skala von verschiedenen für die Arbeit wichtigen Reaktionsdauern
bei physiologischen Temperaturen aufgetragen [183, 147].
Thermalisierung von
-
e Zuständen
in Nanogold
-15
10 s
(fs)
therm. Relaxation
von Nanogold
Photochemie
in
Rhodopsin
-12
10 s
(ps)
Bewegung von
"Scharnierbezirken"
in Proteinen
-9
10 s
(ns)
Entspiralisierung
der DNA- Helix
-6
10 s
(µs)
enzymatische
Reaktionen
-3
10 s
(ms)
1s
Proteinsynthese
Abbildung 2.2: Dauer von verschiedenen Reaktionen unter physiologischen Temperaturbedingungen.
Abbildung nach [183](verändert).
Zu den schnellsten Reaktionen, die gemessen wurden, gehört die photochemische
Strukturänderung der lichtabsorbierenden Gruppe Retinal von Rhodopsin in der
Retina mit 0.5 ps [78]. Die Bewegung von Scharnierbezirken in Proteinen findet
im Nanosekundenbereich statt [132]. Die enzymatische Entspiralisierung der
DNA im Mikrosekundenbereich ist eine der schnellsten enzymatisch ablaufenden
Reaktionen. Die Dauer anderer enzymatisch katalysierter Reaktionen erstreckt
sich bis in den Millisekundenbereich.
Die Energien, die bei biologischen Reaktionen involviert sind, spannen sich über
mehrere Größenordnungen [183]. Mit am stabilsten sind die kovalenten C-C Bindungen.
Eine Energie von 384 kJ/mol wird benötigt, um Kohlenstoffbrücken
direkt zu trennen. Die meisten anderen Reaktionen benötigen weniger Energie,
um ablaufen zu können. Mit einer Energie von 239 kJ/mol können Photonen

Theorie 11
im grünen Spektralbereich biochemische Reaktionen initieren, sofern die beteiligten
Moleküle dort absorbieren. Die Energie von nichtkovalenten Bindungen und
Schwingungsfreiheitsgraden liegt im Bereich von wenigen kJ/mol. Damit reicht
die thermische Energie bei 25◦C aus, sie entstehen zu lassen und zu brechen.
In der Biochemie sind die reversiblen Wechselwirkungen mit geringer Bindungsenergie
pro Bindung: elektrostatische Bindungen, Wasserstoffbrückenbindung
und Van der Waals Bindungen wichtig. Sie liefern die entscheidenden Beiträge
zur Proteinfaltung, Koppelung von Substraten an Enzyme und der DNA Replikation
[37].
Sie werden dabei durch das die Biomoleküle umgebende Wasser beeinflußt. Wassermoleküle
als polare Moleküle haben eine große Affinität zueinander und bilden
eine teilweise geordnete Struktur. In der Nähe geladener Strukturen von Proteinen
und anderen Makromolekülen liegt das Wasser als geordnete Struktur um
die Proteine mit einem Radius von ca. 100 nm vor [136]. Wasser schwächt die
elektrostatische Wechselwirkung von polaren Molekülen oder Molekülteilen und
beeinflußt wesentlich die Wasserstoffbrückenbindungen. Wasser hat auch einen
Einfluß auf unpolare Moleküle. Um die Wechselwirkungsenergie bei der Assoziation
der Wassermoleküle untereinander zu maximieren, wird der Kontakt zu
unpolaren Molekülen minimiert, so dass diese sich zu größeren Aggregaten zusammenschließen.
Dieser Prozeß wird als hydrophobe Wechselwirkung bezeichnet.
Der Grund für die Aggregation ist primär die starke Wechselwirkung von
Wassermolekülen untereinander und nicht eine Wechselwirkung von unpolaren
Gruppen untereinander [37, 89, 183].
2.1.1 Struktur der Proteine
Der Aufbau von Proteinen läßt sich in verschiedene Strukturebenen gliedern. Die
unterste Strukturebene sind die 20 Aminosäuren, die bei neutralem pH als dipolare
Ionen vorliegen. In einem Protein schließen sich die Aminosäuren über Peptidbindungen
zu Aminosäureketten zusammen. Die Peptidbindung ist in der Rotation
durch die Seitengruppen eingeschränkt, so dass sich die Polypeptidketten
nicht beliebig falten können. Die Wechselwirkungen, die die räumliche Struktur
der Proteine bestimmen, sind nach Stärke sortiert: die Schwefelbrückenbindungen
zwischen den schwefelhaltigen Aminosäuren Cystein und Methionin, Wasserstoffbrückenbindungen
und hydrophobe Wechselwirkungen. Die Polypeptidketten

12 Theorie
können zwei periodische Strukturen bilden, die als Sekundärstruktur bezeichnet
werden: Die plane β-Faltblattstruktur und die α-Helices. Der Anteil dieser
Strukturen in Proteinen, die in den verschiedenen Konformationen vorliegen,
ist sehr unterschiedlich. In den meisten globulären Proteinen liegt die Länge
der α-Helices bei ca. 4 nm und die Strukturen wechseln sich innerhalb des Proteins
ab. Der Übergang zwischen Helices und Faltblattstrukturen wird durch
β-Haarnadelschleifen ermöglicht. Diese führen nahezu zu einer Umkehrung der
Raumrichtung der Polypeptidkette. Ständige Richtungsänderungen in der Polypeptidkette
bewirken die globulären Strukturen vieler Proteine. Die Anordnung
der Helices bzw. Faltblattstrukturen wird als Tertiärstruktur bezeichnet.
Entscheidend für die Funktion der Proteine sind Konformationsänderungen, die
teilweise zwischen entfernten Orten innerhalb von Proteinen übertragen werden
[183]. Konformationsänderungen, die eine gewissen Labilität voraussetzten, sind
zum Beispiel für die Bindung eines Substrats an das aktive Zentrum eines Enzyms
nach dem Schlüssel- Schloss Prinzip unerläßlich, das bei völlig starren Molekülen
schon geometrisch gesehen meist nicht möglich wäre.
Die Polypeptidketten der Proteine falten sich selbständig. Dies erfolgt in den meisten
Fällen reversibel. Während der Faltung kommt es zu einer Assoziation von
Polypeptidsegmenten, die vorübergehend eine α-Helix oder β-Faltblattstruktur
annehmen. Die starke Tendenz hydrophober Reste, dem Wasser auszuweichen,
treibt die Faltung voran. Die genannten schwachen, nichtkovalenten Wechselwirkungen
stabilisieren die gefalteten Strukturen [37, 76, 95, 183]. Es gibt verschiedene
Ansätze zur Bestimmung der möglichen Freiheitsgrade, die für eine
theoretische Betrachtung zur Faltung von Proteinen vorgeschlagen wurden. Der
Ansatz, dass sich die unterschiedlichen Aminosäuren sequentiell ausrichten und
es zu einer zeitlich geordneten Faltung kommt, kann ausgeschlossen werden, wenn
man die Freiheitsgrade einer Peptidkette betrachtet. Bei drei möglichen Rotationsfreiheitsgraden
in der Polypeptidkette und einer Rotationsgeschwindigkeit
von 1/ps würde es bereits mehr als 1075 Jahre dauern, um eine Faltung von 100
Aminosäuren zu erhalten [41].
Für einfache Proteine aus einer Polypeptidkette wurde experimentell wie theoretisch
bestätigt, dass die Proteine unabhängig vom Faltungsweg das Energieminimum
als nativen Zustand annehmen (thermodynamische Hypothese) [43, 96, 66].
Es existieren jedoch ebenso Proteine, die im nativen Zustand nicht im Zustand
der minimalen freien Enthalpie gefaltet sind, so dass es zu einer Weiterfaltung in

Theorie 13
den Zustand minimaler Energie, der biologisch inaktiv ist, kommen kann. Beispiele
hierfür sind der Plasminogen-Aktivator-Inhibitor (PAI-1), dessen aktive
d.h. native Form metastabil ist und innerhalb von 6 Stunden in eine stabile inaktive
Form übergeht [14]. Weitere Beispiele aus der Gruppe der Serpine lassen sich
anführen, die dafür verantwortlich gemacht werden können, dass es zu Proteinfehlfaltungen
kommt, die für die Alzheimer- , Creutzfeldt-Jakob Krankheit oder
BSE verantwortlich sind [188]. Die schnelle und in der Regel fehlerfreie Faltung
der Peptidketten ist eins der erstaunlichsten Phänomene der Biochemie.
2.1.2 Stabilität und thermische Denaturierung von
Proteinen
Proteine sind gegenüber Störeinflüssen wie Wechsel in der Ionenstärke, dem pH
oder der Temperatur empfindlich. Eine Erhöhung der Temperatur führt in der
Regel zu einem Verlust der räumlichen Proteinstruktur. Schon sehr früh wurden
Versuche unternommen [89], beobachtete Reaktionskonstanten kD mit der
sogenannten Arrheniusgleichung über zwei empirische Konstanten(A0, Ea) zubeschreiben,
wobei R die allgemeine Gaskonstante und T die Temperatur ist.
Ea
−
kD = A0e RT (2.1)
Ebenso wurde von Anfang an der Versuch unternommen Größenzubestimmen,
die die Vielzahl möglicher Reaktionsvorgänge in Proteinen global über thermodynamische
Größen charakterisieren. Zur Berechnung der thermodynamischen
Größen über die statistische Mechanik muss über die Bewegungsfreiheitsgrade
der Moleküle eine Zustandssumme für ein Protein bestimmt werden. Das einfachst
mögliche Modell für die thermisch induzierte Proteinentfaltung ist ein
Zwei-Zustands-Modell [89, 125]. Darin findet eine Reaktion von einem nativen
Proteinzustand (N) über eine Energiebarriere (G # ) in einen denaturierten Zustand
(D) statt. Die Gleichgewichtsverteilung der Anzahl der Moleküle in den
jeweiligen Zuständen richtet sich nach der Differenz der potentiellen Energie in
den Zuständen. Die potentielle Energie in Abhängigkeit einer abstrakten Reaktionskoordinate,
die vom nativen zum entfalteten Zustand führt, ist schematisch
in Abbildung 2.3 dargestellt.

14 Theorie
G
TT stab
N
�G #
D
Konformationen
Abbildung 2.3: Schematische Darstellung der temperaturabhängigen potentiellen
Energie, die die Gleichgewichtsverteilung von nativem Zustand (N), einem Zwischenzustand
und einem denaturierten Zustand (D) beschreibt; a) für Temperaturen unterhalb
der Stabilitätsgrenze Tstab, b)für Temperaturen oberhalb dieser Temperatur.
Die Höhe der Energiebarriere ∆G # bestimmt die Geschwindigkeit, mit der sich
dieses Verhältnis einstellt. Bei einer Erhöhung der Temperatur verschieben sich
die Energieniveaus, so dass der denaturierte Zustand stärker bevölkert wird. Unter
den Rahmenbedingungen eines konstanten Drucks und einer konstanten Temperatur
bestimmen die Unterschiede in der freien Enthalpie ∆G das Verhältnis
der Konzentration von nativem zu denaturiertem Protein.
Vernachlässigt man die Rückreaktion von dem denaturierten Zustand in den Zwischenzustand,
was bei der Hydrolyse, der Aggregation der entfalteten Proteine
oder einer großen Differenz in der freien Enthalpie gerechtfertigt ist [109], so
erhält man das Drei-Zustands-Modell
N
kZ(T )
⇀↽
kN (T )
Z
kD(T )
⇀ D. (2.2)
Die Ratenkonstante kD läßt sich mit Hilfe des genannten Zwischenzustands [64,
89, 157] unter der Annahme herleiten, dass zwischen dem nativen Zustand und
dem Zwischenzustand ein Gleichgewicht besteht. Die Denaturierungsrate kann
dann mit
kD = kbT [Z]
(2.3)
h [N]
als Funktion der Temperatur und der Konzentration von N und Z ausgedrückt
werden [64]. Hierin bezeichnet kb die Boltzmannkonstante und h das Planck’sche

Theorie 15
Wirkungsquantum. Setzt man für den Konzentrationsquotienten in Gleichung 2.3
eine der freien Aktivierungsenthalpie ∆G entsprechende Boltzmannverteilung an,
so folgt
kD = kbT
h exp
�
− ∆G
�
. (2.4)
RT
Drückt man mit ∆G =∆H−T∆S die freie Enthalpie als Funktion von Enthalpie
und Entropie aus, so kann Gleichung 2.4 auch als
kD = kbT
h exp
� � �
∆S
exp −
R
∆H
�
(2.5)
RT
geschrieben werden. Experimentell ist die im ersten Term von Gleichung 2.5 auftretende
lineare Abhängigkeit der Reaktionsrate von der Temperatur gegenüber
dem Exponentialterm vernachlässigbar, so dass der erste und zweite Faktor zu
einem in erster Näherung temperaturunabhängigen Faktor A0 zusammengefaßt
werden kann. Da die Rahmenbedingungen einer konstanten Temperatur und eines
konstanten Drucks experimentell meist nur eine gute Näherung darstellen,
wird statt der Enthalpie meist die experimentell bestimmbare Aktivierungsenergie
Ea angegeben. In dieser Form entspricht die Temperaturabhängigkeit der
Ratenkonstante der Arrheniusgleichung (Gleichung 2.1), die eine exponentielle
Abhängigkeit der Reaktionsrate von der reziproken Temperatur postuliert [9].
Der Schaden, der durch thermisch induzierte Proteinentfaltung verursacht wird,
kann über das Schädigungsintegral beschrieben werden und anhand der Reaktionseduktkonzentration
c(t) gemessen werden [18]:
dc(t)
�
dt
�
c(t)
→ ln
c0
= −k(t)c(t) (2.6)
= −
� t
k(t
0
′ )dt ′
(2.7)
mit der Arrheniusabhängigkeit der Raten von der Temperatur ergibt sich das
Schädigungsintegral Ω(t) zu:
k(t ′ Ea
−
) ∼ e RT (t ′ ) (2.8)
Ω(t) = A0 ·
� t
0
Ea
−
e RT (t ′ ) dt ′
(2.9)
Wie im vorhergehenden Abschnitt beschrieben, kommt es durch eine Erhöhung
der Temperatur zu exponentiell mit der Temperatur steigenden Reaktionsraten

16 Theorie
in Ratenprozessen. Für eine thermische Denaturierung von Proteinen versuchten
Johnson, Eyring und Stover [89] eine Verbindung von temperaturabhängigen
Ratenprozessen mit den einzelnen Strukturelementen von Proteinen herzustellen.
Die Verknüpfung von verschiedenen Reaktionen mit einzelnen beobachteten Kinetiken
wurde unter anderem von Klibanov und Volkin für hohe Temperaturen
fortgesetzt [2, 98, 197].
Das einfachste Modell einer irreversiblen Denaturierung ist eine Entfaltung der
Polypeptidketten mit einer verhinderten Rückfaltung in den nativen Zustand,
wobei entfalteten Peptidketten durch eine fehlerhafte Rückfaltung, Aggregation
oder kovalente Veränderungen der Peptidketten an einer Renaturierung gehindert
werden können.
Die Entfaltungsraten, die sowohl gemessen als auch berechnet wurden, sind für
einzelne Polypeptidketten sehr schnell. Von Mayor wurde die Entfaltung des En-
”
grailed Homeodomain Protein”, das mit die schnellsten bekannten Entfaltungsraten
aufweist, gemessen und theoretisch für Temperaturen bis 225◦C berechnet
[120]. Die Ergebnisse der Rechnung sind in Abbildung 2.4 dargestellt.

Theorie 17
Entfaltung bei 100°C
Entfaltung bei 225°C
Abbildung 2.4: Von Mayor berechneter Entfaltungsverlauf für das Engrailed Homeo-
domain Protein (En-HD) bei 100 ◦ C und 225 ◦ C . In dem Beispiel wird deutlich, dass
man mit einer Inaktivierung von Proteinen im Bereich von 260 ps bis 10 ns rechnen
kann, da sich kurze Polypeptidstränge oder Substrukturen eines Proteins in dieser Zeit
entfalten können. Abbildung nach Mayor [120](verändert).
Nach seinen Messungen und Rechnungen ist die Entfaltung des kleinen Proteins,
das die Größe einer Domäne größerer Proteine besitzt, ein sehr schneller Prozeß,
der schon bei 100◦C zu einer Entfaltung innerhalb von Nanosekunden führt.
Für die hohe Temperatur von 225◦C sagt Mayor Raten im Pikosekundenbereich
voraus. Die Inaktivierung kann nach diesen Rechnungen bei 225◦C schon nach
260 ps erwartet werden. Die Proteine falten jedoch reversibel zurück, so dass nach

18 Theorie
kurzen Temperatursprüngen keine irreversible Schädigung zu erwarten ist. Die
vollständig reversible Entfaltung wurde von Dinner [44] für ein 125 Aminosäuren
langes Polypeptid ebenfalls theoretisch bestätigt. Dinner kommt in seiner Arbeit
zu dem Schluß, dass für kurze Polypeptidketten die Rückfaltung der umgekehrte
Prozeß einer Entfaltung ist. Dies gilt nach Dinner für einen eingeschränkten Temperaturbereich
hoher Temperaturen für einfache Polypeptidstränge auch für die
Kinetik der Ent- und Rückfaltung. Pande [142] hat für eine β-Haarnadelschleife
des Proteins G eine Entfaltung über zwei Zwischenzustände vorhergesagt, die
bei 400 K insgesamt 1500 ps dauert. Munoz hat die Entfaltung von solch einer
β-Haarnadelschleife experimentell über Tryptophanfluoreszenzänderungen beob-
achtet [132]. Die von ihm beobachteten Entfaltungsraten liegen für 12◦Cbis50◦C zwischen 105 1/s und 106 1/s.
Unter physiologischen Bedingungen ist die Aggregation der entfalteten Peptide
mit in der Umgebung vorhandenen entfalteten Peptiden der wichtigste Schritt
einer thermischen Zerstörung von Zellen, sofern die ganze Zelle erhitzt wird. In
diesem Fall entfalten so viele Peptide, dass die Proteine untereinander aggregieren
und bereits ein Anteil von ≤5% denaturierter Proteine in einer Zelle zum Zelltod
führt [110].
Schließt man diesen Schritt einer Aggregation aus, der stark von den Umgebungsbedingungen
der erhitzten Proteine abhängt, führen nach Ahern und Klibanov
die in folgender Tabelle aufgelisteten kovalenten chemischen Modifikationen der
Polypeptidkette zu einer irreversiblen Inaktivierung von Proteinen [2].
Inaktivierung Ratenkonstante (hr −1 )
pH4 pH6 pH8
Deamidierung von Asn/Gln Bindungen 0.45 4.1 18
Hydrolyse von Asn-X Peptidbindungen 0.12
Zerstörung von Cysteinresten 6
Fehlfaltungen 32
Tabelle 2.1: Irreversible thermische Modifikationen, die bei 100◦C zu einer irreversiblen
Inaktivierung von Enzymen führen [2].
Die Reaktionen sind zusammen mit Raten aufgelistet, die für Lysozym aus Hühnereiweiß
bei 100◦C gemessen wurden. Die einzelnen Reaktionen weisen Besonder-

Theorie 19
heiten auf, die für eine Inaktivierung von Proteinen in sehr kurzen Zeiten entscheidend
sein können:
Die Deamidierung von Asparagin-Glutamin Bindungen ist um den Faktor 50
schneller als von Asparagin-Prolin oder Asparagin-Leucin Bindungen. Die Reaktion
ist jedoch stark von der Proteinkonformation abhängig, so dass sie in
bestimmten gefalteten oder Zwischenzuständen nicht abläuft [101].
Bei der Veränderung der Schwefelbrückenbindungen und Cysteingruppen kommt
es auf einem Reaktionsweg zur Bildung von freien Thiolgruppen, die wiederum
den Bruch der Disulfidbrücken katalysieren [196]. Zusätzlich können die Cysteingruppen
oxidiert werden.
Für die irreversible Denaturierung von Proteinen unter physiologischen Bedingungen
ist somit entscheidend, wie schnell die Proteine entfalten, Untereinheiten
dissoziieren und Reaktionspartner für eine Aggregation vorhanden sind, da diese
Prozesse je nach Umgebung bei Temperaturen bis 100◦C sehr viel schneller
ablaufen können als Veränderungen kovalenter Bindungen, die zur Inaktivierung
führen. Bei schnellen Temperatursprüngen im Pikosekundenbereich und hohen
Temperaturen über 250◦C oder in Systemen, in denen Aggregation nicht möglich
ist, können die kovalenten Veränderungen eine entscheidende Rolle spielen, da
die Entfaltung dort entweder nicht so weit erfolgt, wie bei langen Temperatursprüngen
oder reversibel ist. Die Raten der kovalenten Veränderungen steigen
jedoch weiter.
Sie stellen die Grenze für Leben bei hohen Temperaturen dar und wurden dort
von White [199] detailliert untersucht, um zu verstehen, wie das Bakterium ‘black
smoker’ bei 250◦C existieren kann. Von White wurde ebenfalls die Deamidierung
der Asn-Gln Gruppe bei den hohen Temperaturen als der schnellste Prozeß
identifiziert. White zeigt die wichtige Ergänzung auf, dass die Inaktivierung
von Proteinen, die man durch die kovalenten Veränderungen erhält, größenund
zusammensetzungsabhängig ist, da die Wahrscheinlichkeit für eine kovalente
Veränderung an einzelnen Peptidbindngen in erster Linie von der Anzahl dieser
Bindungen in einem Protein abhängt. Für ein Protein mit einem Molekulargewicht
≥ 48000 kDa liegt die Inaktivierungsdauer bei 250◦C damit im Bereich von
Millisekunden oder darunter. Eine temperaturabhängige Rate für die Deaminierung
von Asparaginsäure wurde von Bada mit logkdeam.(s−1 )=14.35 − 8047.5/T
bei pH 7 angegeben [11].

20 Theorie
Da die Deamidierung vom Faltungszustand abhängig ist aber z.B. die Cysteinoxidation
nicht, kann das einfache Modell der thermischen Denaturierung folgendermaßen
erweitert werden:
N
k1(T )
⇀↽
k2(T )
D
k3(T ) ↓ ↓k4(T )
I1
I2
(2.10)
Darin stellen I1 und I2 unterschiedliche thermisch denaturierte Zustände dar, N
den nativen Zustand und D den entfalteten. Schon für einen nur um den einen
Schritt modifizierten Reaktionsweg ist jedoch zu erwarten, dass man eine Nicht-
Arrheniusabhängigkeit der Denaturierungsraten von der Temperatur erhält, wenn
ein großer Anteil der Proteine im Zwischenzustand D gefangen ist und nicht an
der Reaktion in den Zustand I1 teilnehmen kann. Eine Inaktivierungskinetik in
dieser Form wurde von Siksnis [178] für chemisch modifizierte Enzyme u.a. für
α-Chymotrypsin beobachtet und mit dem dargestellten Reaktionsablauf erklärt.
2.1.3 Photochemie
Unter Bestrahlung mit Licht können photochemische Veränderungen eine Denaturierung
von Proteinen bewirken. Proteine ohne Metallgruppen absorbieren bei
527 nm und längeren Wellenlängen nicht. Photochemische Schäden an Proteinen
können jedoch durch Zweiphotonenabsorption und durch Photochemie der
Partikel verursacht werden. Aufgrund der absorbierten Photonen können direkt
kovalenten Bindungen zerstört werden, die einen Bruch der Polypeptidketten zur
Folge haben, ohne dass eine starke Ladungsverschiebung auftritt. Es können
modifizierte Gruppen entstehen, die durch Ladungsverschiebungen zu Proteinstrukturveränderungen
führen können. Schliesslich können Radikale oder freie
Ladungsträger gebildet werden, die weiterdiffundieren können und an vom Absorptionsort
entfernten Proteinstrukturen zu einer Veränderung führen können.
Im ersten Fall der direkten Zerstörung der Polypeptidkette durch eine Modifikation
einer Aminosäure kann eine Vielzahl von solchen chemischen Modifikationen
stattfinden, ohne dass es zu einer starken Veränderung der Proteinstruktur und
der Funktion kommt, wenn die Proteine vorher richtig gefaltet sind [131]. Dies

Theorie 21
wird besonders an dem Beispiel deutlich, dass posttranslationale Modifikation
von Proteinen häufig, wie auch im Fall von Chymotrypsin, aus der Unterbrechung
der Polypeptidkette bestehen. Dies führt zwar zu einer Veränderung des
Enzyms, nicht aber zu einer grundsätzlichen Umstrukturierung. Anschaulich
wird dies, wenn man sich ein Protein wie ein Wollknäuel vorstellt. Trennt man
einen Faden durch, so bleibt das Knäuel als solches bestehen.
Die Entfaltung und Inaktivierung von Proteinen durch photochemische Veränderungen
wird in erster Linie nach Reaktionen erwartet, die zu einer Veränderung
der Ladungen innerhalb des Proteins führen. Solche Ladungsverschiebungen haben
einen starken Einfluß auf die nichtkovalenten Bindungen, die Struktur und
Stabilität der Proteine bestimmen. Verantwortlich für Ladungsverschiebungen
innerhalb eines Proteins können langlebige Radikale oder ionisierende Prozesse
sein [90]. Die Lebensdauer von Radikalen ist in einer Proteinumgebung allerdings
so kurz, dass Radikale in hohen Konzentrationen vorliegen müssen, um
direkt eine Inaktivierung zu verursachen. Wahrscheinlicher ist, dass die Radikale
oder auch andere angeregte Gruppen mit den Aminosäuren derart weiterreagieren,
dass diese ihre Eigenschaften in Hinblick auf die nichtkovalenten Bindungen
verändern. Diese Veränderungen sind in der Regel irreversibel und führen damit
schließlich zu einer Strukturveränderung. Diese Prozesse sind in erster Näherung
proportional zur Anzahl der absorbierten Photonen und damit zur Gesamtenergie,
mit der die Proben bestrahlt wurden. Sind jedoch Reaktionsedukte aus dem
Puffer wie z.B. Sauerstoff an der Reaktion beteiligt, so spielen die Pufferzusammensetzung
und die äußeren Bedingungen eine Rolle. Die lineare Abhängigkeit
der Denaturierung von der Bestrahlung kann eine nichtlinear mit der Bestrahlung
zunehmende Form annehmen, wenn Reaktionen, die ein Reaktionsedukt für eine
Weiterreaktion erst hervorbringen, beteiligt sind. Ein Beispiel hierfür, das für die
irreversible Proteindenaturierung wichtig ist, ist die genannte Thiol katalysierte
Cysteinzerstörung [2, 90, 197].
Zusammenfassend kann gesagt werden, dass Reaktionen, die zu lokalisierten Ver-
änderungen der kovalenten Bindungen der Aminosäurekette führen, meist keine
Inaktivierung der Proteine zur Folge haben. Am stärksten denaturierend wirken
Reaktionen, in denen es zu Ionisierung oder starken Ladungsverschiebungen
innerhalb der Proteine kommt, so dass die strukturgebenden nichtkovalenten
Wechselwirkungen, die stark von der räumlichen Ladungsverteilung abhängig
sind, gestört werden.

22 Theorie
2.1.4 Grenzflächendenaturierung
Ein weiterer Mechanismus, der zu einer Proteindenaturierung führen kann, ist
die Denaturierung an Grenzflächen [106]. Selbst wenn Proteine wasserlöslich
sind, können sie an Grenzflächen unlösliche monomolekulare Filme bilden. Dieser
Effekt führt z.B. bei zu schnellem Zugeben oder Mischen von Proteinlösungen
zu Schaumbildung [33, 34]. Dabei richten sich die normalerweise innen liegenden
hydrophoben Gruppen an der Grenzfläche aus, so dass sich die Proteine
entfalten und schnell eine große Fläche mit einer kleinen Dicke einnehmen
und in dem geringen Volumen entsprechend schnell aggregieren können. Eine
Oberflächendenaturierung kann an Flüssigkeit-Flüssigkeit, Flüssigkeit-Gas oder
Festkörper-Flüssigkeit Grenzflächen stattfinden. Für fast alle Proteine ist diese
Denaturierung vollständig irreversibel, wenn ein Film gebildet wurde [90, 106].
Eine experimentelle Bestimmung der Kinetik der Oberflächendenaturierung ist
schwierig, da in der Regel die Diffusionsdauer der Proteine zu einer Oberfläche
im Millisekundenbereich liegt. Eine Ausnahme könnten Kavitationsblasen bilden,
da die Grenzfläche Blase-Wasser innerhalb von Nanosekunden erzeugt werden
kann. Untersuchungen zu Oberflächendenaturierung an Kavitations- und
Gasblasen sind jedoch nicht bekannt.
2.2 Enzyme als Modellsystem für
thermische Proteinschäden
Für die Untersuchung der schnellen Denaturierungskinetik von Proteinen sollten
Proteine genutzt werden, deren Eigenschaften in Hinblick auf die thermische
Denaturierungskinetik bereits gut untersucht worden sind und die experimentell
einfach handhabbar sind. Da Signale aus indirekten Meßverfahren zur
Proteindenaturierung wie Raman-Streuung, Änderung der optische Eigenschaften
wie Absorption, Streuung, Eigenfluoreszenzänderung oder Änderungen der
Wärmekapazität [52, 54, 68, 123, 158] noch keine direkten Aussagen über eine
biologische Inaktivierung machen, die schon durch eine kleine Veränderung
z.B. an der Bindungsstelle eines Antikörpers oder Antigens erfolgen kann, wurden
Enzyme als Modellsystem gewählt, deren biologische Funktion leicht messbar
ist.

Theorie 23
Es wurden die Enzyme alkalische Phosphatase und α-Chymotrypsin als relativ
gut charakterisierte Proteine gewählt. Diese werden im Folgenden beschrieben:
2.2.1 α-Chymotrypsin
α-Chymotrypsin ist ein strukturell einfaches Protein und stellt in den Untersuchungen
das Modellprotein dar, bei dem aufgrund der einfachen Struktur aus
einer Polypeptidkette eine thermisch induzierte reversible Entfaltung erwartet
werden kann. Chymotrypsin ist in Hinblick auf die thermische Denaturierung
[115, 149, 150, 151, 131, 189], die druckabhängige Denaturierung [130, 129], die
chemisch induzierte Denaturierung [118] und die Denaturierung an Grenzflächen
[26, 51, 137, 210] untersucht worden. Der Aufbau von α-Chymotrypsin ähnelt
stark Chymotrypsinogen, einem Vorläufermolekül, das posttranslational in der
Form modifiziert wird, dass die Polypeptidkette zweimal unterbrochen wird. Bei
einer vollständigen Entfaltung und räumlichen Trennung der einzelnen Polypeptidketten,
die über Disulfidbrücken miteinander verbunden sind, kann demnach
nicht von einer einfachen Rückfaltung, wie im Fall des Chymotrypsinogens, ausgegangen
werden. Das Molekül besitzt einen hohen Anteil an Haarnadelschleifen
und nur eine β-Faltblattstruktur [191, 15]. Biologisch kommt Chymotrypsin bei
stark unterschiedlichen pH-Werten vor [189]. Die Funktion von α-Chymotrypsin
als Verdauungsenzym besteht darin Peptidbindungen zu trennen. Die maximale
Aktivität entfaltet es außerhalb der Lysosomen im Zytosol bei pH 7.6 [209, 208].
Auf dieser Funktion bauen die Substrate auf, die aus einem entsprechenden Polypeptid
bestehen, das an ein Fluorochrom gekoppelt ist und dessen optische
Eigenschaften sich dadurch spektroskopisch verändern. Chymotrypsin trennt die
Peptidkette des Fluorochroms, so dass sich die Fluoreszenz ändert.
Die Stabilität von Chymotrypsin wird durch 2 Schwefelbrücken und einen stark
hydrophoben Kern verursacht. Seine Struktur ist in Abbildung 2.5 dargestellt
[191, 15].
Aufgrund der Struktur erwartet man eine vollständige Inaktivierung, sobald sich
die Lage der Polypeptidketten geometrisch verändert, da unterschiedliche Bereiche
der Kette an der Bildung des aktiven Zentrums beteiligt sind und deshalb
das aktive Zentrum nicht als besonders stabiler Bereich gelten kann, der während
einer Entfaltung konserviert bleibt.

24 Theorie
Die thermische Denaturierung wurde von Pohl in Temperatursprungexperimenten
mit einer Temperaturanstiegszeit von ca. 1 s [149, 150, 151] eingehend untersucht.
Als Meßgröße nutzte er die Absorption im Spektralbereich von 230 nm bis
300 nm, die vor allem Tryptophan zugeordnet werden kann. Da die Kinetik der
beobachteten Absorptionsänderungen nicht von der Wellenlänge abhing, folgerte
Pohl, dass die Denaturierung durch eine weitgehend reversible Entfaltung und
Rückfaltung zwischen lediglich zwei Zuständen beschrieben werden kann.
Es existiert nach diesem Modell ein Gleichgewicht zwischen einem denaturierten
und einem nativen Zustand mit jeweils spezifischen Absorptionsspektren. Die
Temperaturabhängigkeit der Ratenkonstante für die Entfaltung lässt sich sich
aus den Messungen von Pohl entsprechend der Arrheniusgleichung ablesen:
kD =8.2810 39 250·103
−
· e RT [1/s] (2.11)
Der Einfluß von erhöhtem Druck auf die Stabilität und die Entfaltungskinetik
beruht auf der Volumenänderung, die eine Proteinentfaltung mit sich bringt.
Nach dem Prinzip des kleinsten Zwanges von le Chatelier erwartet man, dass
ein erhöhter Druck zu einer Stabilisierung der Proteine führt. Unterhalb von
1 kbar sind diese Einflüsse jedoch in der Regel klein. Im Fall von α-Chymotrypsin
wurde dies bestätigt [90, 130]. In Arbeiten von Mozhaev [130, 129] konnte eine
Druckabhängigkeit der Aktivität der Enzyme für Drücke im Bereich von 5 kbar
festgestellt werden.
Gegenüber chemischen Veränderungen und pH-Änderungen ist α-Chymotrypsin
vergleichsweise stabil. Der Stabilitätsbereich reicht von pH 1 bis pH 9 [189] und eine
hohe Stabilität gegenüber chemisch induzierter Denaturierung in Abhängigkeit
von Harnsäure wurde beobachtet [118].
Zusammenfassend erlaubt α-Chymotrypsin als relativ einfaches Molekül die Untersuchung
der Frage, ob eine weitgehend reversible Entfaltung der Polypeptidkette
zu einer irreversiblen Veränderung des Proteins auch im Zeitbereich von
Pikosekunden bis Mikrosekunden führt, sofern die Temperatur dafür ausreichend
hoch ist.

Theorie 25
a)
Abbildung 2.5: Struktur der Enzyme: a) alkalische Phosphatase und b) α-
Chymotrypsin im Maßstab zueinander. a) Protein Data Bank Eintrag 1ELZ [182, 15]
b) 4CHA [191, 15]). Die für die Goldkonjugation wichtigen geladenen Gruppen sind
gelb hervorgehoben.
2.2.2 alkalische Phosphatase
Alkalische Phosphatase (aP) wurde als ein komplexeres Modellprotein gewählt,
das aus zwei gleichen nicht kovalent miteinander verbundenen Untereinheiten besteht
(Homodimer). Die Struktur von bakterieller alkalische Phosphatase ist in
Abbildung 2.5 dargestellt [182], die nach der Charakterisierung von Manes [117]
der bovinen alkalische Phosphatase entspricht. Im Inneren sind die Metallio-
nen Mg 2+ und Zn 2+ eingebaut. Aufgrund der größeren Anzahl an Subdomänen
und aufgrund der Eigenschaft als Homodimer sollten die Einflüsse der Dissoziation
und Aggregation der einzelnen Gruppen deutlich werden. In Hinblick auf
die thermische Denaturierung ist alkalische Phosphatase ein weniger gut untersuchtes
Enzym. Das hat seinen Grund in der komplizierteren Struktur, die eine
Zuordnung der Effekte zu einzelnen Strukturen erschwert (siehe Abbildung 2.5).
Alkalische Phosphatase ist jedoch bezüglich seiner Funktion ein gut untersuchtes
Molekül, da es in einer Vielfalt von enzymatischen Nachweisen genutzt wird.
Es ist unter Laborbedingungen einfach zu handhaben und stabil. Das Molekül
besitzt im Gegensatz zu α-Chymotrypsin einen hohen Anteil an α-Helices. Alkalische
Phosphatase kommt mit pI-Werten von 4.5 bis 5.8 vor [16, 57]. Die Funktion
von alkalische Phosphatase besteht darin Phosphat-Monoester zu hydrolysieren.
Die maximale Aktivität entfaltet es bei pH 9.6 [31, 127].
Für die Stabilität von alkalische Phosphatase ist sicherlich entscheidend, dass es
ein Homodimer ist. Außerdem spielen die Metallionen Mg 2+ und Zn 2+ , ohne
b)

26 Theorie
die alkalische Phosphatase weder eine starke enzymatische Aktivität noch eine
stabile Konformation erhält, eine Rolle. Wie bei α-Chymotrypsin sind am aktiven
Zentrum unterschiedliche Polypeptidkettenabschnitte beteiligt, so dass bei einer
Entfaltung mit einer Inaktivierung gerechnet werden kann. Trennt sich nur das
Dimer, so kann eine Restaktivität erhalten bleiben [35].
2.3 Verdampfung und Sieden in Tropfen oder
Blasen
2.3.1 Verdampfen und Sieden um Nanopartikel
Eine mögliche Dampf- oder Kavitationsblasenbildung um die Partikel spielt für
diese Arbeit eine wichtige Rolle, da sich durch Blasen die optischen und thermischen
Randbedingungen um die Partikel soweit ändern, dass eine Temperaturabschätzung
mit analytischen Modellen nicht mehr möglich ist. Durch die
Blasenbildung könnte es zu einer Denaturierung oder Abtrennung der Proteine
von der Partikeloberfläche kommen. Zusätzlich ist auch eine Veränderung der
Denaturierungskinetik der Proteine innerhalb der Blase möglich, da die Reaktion
nicht mehr in wässriger Umgebung erfolgt.
Die Temperatur und Druckbereiche, in denen Wasser sich im flüssigen, gasförmigen
oder festem Zustand befindet, kann aus dem Phasendiagramm (Abbildung 2.6)
abgelesen werden.

Theorie 27
p [bar]
1000
100
10
1
0.1
0.01
0.001
FEST
FLÜSSIG
Tripelpunkt
GASFÖRMIG
kritischer Punkt
spinodaler Punkt
p,T; 5 bar p,T; 10bar p,T; spinodalen Punkt 1 bar
-50 0 50 100 150 200
T [°C]
250 300 350 400 450
Abbildung 2.6: Phasendiagramm von Wasser (p-T-Diagramm ; Daten aus [112]). Es
lassen sich für Druck und Temperatur die Phasen fest, flüssig und gasförmig angeben.
Die flüssige und die gasförmige Phase ist durch die Binoidale getrennt, die den Tripelpunkt
und den kritischen Punkt verbindet. Bei Temperaturen oberhalb der Binoidalen
kommt es zum Sieden. In dem Diagramm sind zusätzlich für die Arbeit wichtige Parameter
markiert: Siedetemperatur bei 5 und 9 bar und der spinodale Punkt bei 1 bar.
An den Phasengrenzen können zwei Phasen koexistieren. Da die Phasen sich
dort im Gleichgewicht befinden, müssen ihre chemischen Potentiale gleich sein:
µg = µf, wobeiµgdas chemische Potential des Gases und µf das chemische
Potential der Flüssigkeit ist.
Der Druck des Gases, das sich im Gleichgewicht mit der Flüssigkeit bei einer
bestimmten Temperatur einstellt, wird als Dampfdruck bezeichnet. In Abbildung
2.6 ist die Dampfdruckkurve als durchgezogene Linie in Verbindung vom
Tripelpunkt bis zum kritischen Punkt dargestellt. Sie wird auch als Binoidale
bezeichnet. Ist der Partialdruck von Wasserdampf über einer Wasseroberfläche
geringer als der Dampfdruck, so kommt es zur Verdunstung von Wasser. Umgekehrt
kommt es zur Kondensation, wenn der Partialdruck von Dampf im Gas
höher als der Dampfdruck ist. Übersteigt der Dampfdruck von der Flüssigkeit
den Umgebungsdruck, der auf der Flüssigkeit lastet, so kommt es zum Sieden.
Dann entwickelt sich der Dampf nicht nur an der Oberfläche sondern im gesam-

28 Theorie
ten Flüssigkeitsvolumen. Die Siedetemperatur hängt demnach wie in Abbildung
2.6 gezeigt vom Außendruck ab. Sind keine Siedekeime im Wasser vorhanden,
so ist eine Überhitzung des Wassers in einem metastabilen Zustand möglich. In
einer thermodynamischen Beschreibung des Siedevorgangs äußert sich dies in einer
Barriere im Verlauf der freien Enthalpie ∆G zwischen dem flüssigen und dem
gasförmigen Zustand (siehe Abbildung 2.7). In der Abhängigkeit ∆G von der
spezifischen Dichte gibt es weit oberhalb der Siedetemperatur zwei Minima.
G
Flüssigkeit
Dam pf
T spin
Abbildung 2.7: Schematische Darstellung der freien Enthalpie G von Wasser über
dem Volumen V .Für Temperaturen unterhalb des spinodalen Punktes Tspin existieren
zwei Minima in der freien Enthalpie mit unterschiedlicher spezifischer Dichte, so dass
Wasser ab der Siedetemperatur Tsat (100 ◦ C bei 1 bar) in einem metastabilen Zustand
überhitzt werden kann. Abbildung nach Venugopalan [195](verändert).
Mit steigender Temperatur verändert sich das Potential so weit, bis die Barriere
in der freien Enthalpie zwischen Flüssigkeits- und Gasphase verschwindet. Diesen
Ort im p-T-Diagramm bezeichnet man als spinodalen Punkt. Das Wasser
wird ab dieser Temperatur nicht mehr in der Phasenumwandlung gebremst, so
dass es zu einer sogenannten Phasenexplosion kommt und sich das überhitzte
Wasser schlagartig in Wasser und Wasserdampf verwandelt. Man kann Wasser
demnach maximal bis zum spinodalen Punkt überhitzen, ohne dass es zu einer
Blasenbildung kommt. Nach theoretischen Berechnungen der Temperatur für den
spinodalen Punkt bei Umgebungsdruck beträgt dieser 305 bis 312◦C [179, 180].
T sat
T
v

Theorie 29
Experimentell wurde er zu 279.5◦Cbeiüber Sekunden bis Minuten anhaltender
Temperatur bestimmt [8].
Physikalische Ursache für die Barriere ist die Tatsache, dass bei der Ausbildung
von Blasen in Wasser die Oberflächenspannung von Wasser einen wichtigen Beitrag
liefert, der der Verdampfung entgegensteht. Für eine korrekte Beschreibung
muss zu dem chemischen Potential des Dampfes und der Flüssigkeit ein Term für
die Oberflächenspannung eingefügt werden:
∆G = 4πr3
(µg − µf)+4πr
3
2 γ (2.12)
mit r dem Blasenradius und γ der Oberflächenspannung von Wasser [195, 1]. Der
Term der Oberflächenspannung hängt quadratisch vom Radius der Blasenkeime
ab, wohingegen der Beitrag des chemischen Potentials vom Volumen d.h. kubisch
vom Radius abhängt. Um eine gekrümmte Wasseroberfläche wie einen Tropfen
oder eine Blase mit einer Oberfläche σ bilden zu können, muss Arbeit w aufgewendet
werden.
dw = γdσ (2.13)
Die Oberflächenenergie der Fläche σ ist γσ, was4πr2γ entspricht, wenn es sich
um eine Sphäre handelt. Daraus läßt sich wie von Adkins [1] beschrieben herleiten,
dass der Druck innerhalb einer gekrümmten Fläche um 2γ/r größer ist als
außerhalb. Dieser Druckbeitrag wirkt sich auf die Phasengrenze aus.
Dampfblasen können deshalb erst wachsen, wenn sie den kritischen Radius rk
überwunden haben, d.h. wenn die Differenz der chemischen Potentiale die Oberflächenspannung
von Wasser übersteigt. Mit wachsender Temperatur steigt die
Differenz der chemischen Potentiale von Wasserdampf in der Blase und Wasser
außerhalb und sinkt die Oberflächenspannung, so dass der kritische Radius, der
überwunden werden muss, kontinuierlich sinkt. Der kritische Blasenradius, der
erreicht werden muss, damit eine Blase weiterwachsen kann, ist in Abbildung 2.8
dargestellt.

30 Theorie
kritischer Blasenradius [nm]
10 4
10 3
10 2
10 1
10 0
spinodaler
Punkt
kritischer
Punkt
s]
-3 -1
log Nukleationsrate [cm
10
50 100 150 250 300 160 180 200 220 240 260
T-T sat [°C]
T-T sat [°C]
50
0
-100
-150
-200
spinodaler
Punkt
2,8 µm 15 nm
8µm
kritischer
Punkt
Abbildung 2.8: a) Kritischer Radius einer Blase in Abhängigkeit von der Temperatur,
die erreicht werden muss, damit eine Blase wachsen kann. b) Nukleationskeimrate
bei einer Temperatur T oberhalb der Siedetemperatur Tsat von 100◦C durch Dichteschwankungen
im Wasser pro Volumen und Zeit in Abhängigkeit von der Temperatur.
Abbildung nach [195](verändert).
Für ein Sieden bei Temperaturen unterhalb vom spinodalen Punkt sind somit Siedekeime
mit einer Ausdehnung oberhalb des kritischen Radius notwendig. Dies
können zum einen Verunreinigungen sein (heterogene Nukleation) als auch statistische
Dichteschwankungen in Wasser. Die Dichteschwankungen wirken als
Nukleationskeim. Dies wird als homogene Nukleation bezeichnet [180]. Die
Nukleationsrate pro Volumen und Zeit, die durch solche Dichteschwankungen
hervorgerufen wird, ist in Abbildung 2.8 nach Vogel und Venugopalan [195] dargestellt.
Aus ihr läßt sich abschätzen, ob es in der Umgebung erhitzter Mikround
Nanopartikel zur Blasenbildung durch homogene Nukleation kommt. Danach
ergibt sich für ein Volumen, das von 15 nm Partikeln, die mit ca. 10 nm
Protein beschichtet sind, eingenommen wird, eine Temperatur von 328◦C, bei
der schon innerhalb von 35 ps eine Blasenbildung zu erwarten ist. Partikel mit
einem Radius von 1.5 µm bis4µmnehmen ein entsprechend größeres Volumen
ein, so dass die Temperatur, nach der homogene Nuklation innerhalb von 15 µs
erwartet werden kann, auf 308◦Csinkt. Die Temperaturen, bei denen Blasenbildung durch homogene Nukleation erwartet
werden, liegen oberhalb der spinodalen Temperatur bei Normaldruck. Homogene
Nukleation ist deshalb für ein Sieden um die Partikel nicht relevant. Kommt es
bei Erreichen des spinodalen Punktes zum schlagartigen Verdampfen des Wassers
in der Umgebung der Partikel, wird aufgrund der Zustandsgleichung von
Wasser ein Druck von ca. 90 bar erwartet [133], der die Blasenentstehung treibt.

Theorie 31
Diesem Druck steht die Trägheit des Wassers entgegen. Das überhitzte Wasser
bildet eine Lage von ca. 5 bis 10 nm um den Goldpartikelkern. Das Volumen
ist somit extrem gering. Bei extrem schneller Abkühlung ist es deshalb möglich,
dass es trotz Überschreitung des spinodalen Punktes nicht zu einer vollständigen
Ablösung des Wassers von den Partikeln, d.h. zu einer Blasenbildung kommt. Eine
Abschätzung, ob die Entstehung von Blasen um 15 nm Gold verhindert werden
kann, erlaubt das Rayleigh-Modell, das Kavitationsblasenentstehung beschreibt.
Hiernach stellt sich bei konstantem Innendruck nach einer kurzen Beschleunigungsphase
eine konstante Blasenwandgeschwindigkeit ein [194, 156, 124], so dass
die Blasengröße nach folgender Formel berechnet werden kann:
� �1/2 2(pg − P∞)
r(t) =
· t (2.14)
3ρf
Darin sind ρf dieDichtedesWassers,pg der Druck innerhalb der Blase und p∞
der Umgebungsdruck.
Nach dieser Formel kann man bei einem maximalen Anfangsdruck von 90 bar
bei der Temperatur am spinodalen Punkt mit einem Blasendurchmesser von

32 Theorie
2.4 Wärmeleitung von Partikeln
in die Umgebung
Die Temperatur an der Absorberoberfläche und in der Absorberumgebung wurde
auf der Basis der Wärmeleitung einer homogen absorbierenden Kugel berechnet.
Diese Annahme ist bei Goldpartikeln vernünftig, da aufgrund der hohen
Wärmeleitung von Gold der Ausgleich der Temperatur innerhalb der Partikel
sehr viel schneller erfolgt als die Wärmeleitung ins Wasser. Mikropartikel, für
die der Absorptionskoeffizient klein im Verhältnis zum reziproken Durchmesser
ist (µabs≤1/d), werden ebenfalls homogen erwärmt.
Die räumliche und zeitliche Entwicklung der Temperatur in der Umgebung der
absorbierenden Partikel hängt von den Wärmeleitungseigenschaften und der Geometrie
der Absorber sowie von der Laserpulsform ab. Sie kann als Lösung der
Differentialgleichung
∂T
− κ∆T (r,t) = 0 (2.16)
∂t
berechnet werden. Dabei bezeichnen t und der Vektor r die zeitlichen und
räumlichen Koordinaten, ρ die Dichte, κ die Diffusivität und cp die Wärmekapazität
des Mediums. T bezeichnet die Temperatur, K die Wärmeleitfähigkeit
und κ die thermische Diffusivität. Die Wärmeleitfähigkeit K beschreibt den
Wärmefluß durch eine Fläche als Funktion des Temperaturgradienten. In die
thermische Diffusivität geht zusätzlich die Wärmekapazität und die Dichte des
Mediums mit ein, so dass sie die zeitliche Temperaturänderung, verursacht durch
einen Temperaturgradienten, beschreibt [28].
Das Aufheizen der Partikel durch die Laserpulse wird mit einem zeitabhängigen
Quellterm q(r,t)berücksichtigt [28].
∂T
∂t
− κ∆T (r,t)=q(r,t)
ρcp
(2.17)
Für die Lösung der Wärmeleitungsgleichung für Absorber, die durch eine zeitlich
modulierte Quelle geheizt werden, ist entscheidend, dass es für homogene Medien
aufgrund der Linearität der Wärmeleitungsgleichungen möglich ist, gefundene
Lösungen zu superponieren und damit die Lösung für die Summe der Einzelquellterme
zu erhalten. Die Lösung von Gleichung 2.17 für den elementarsten

Theorie 33
denkbaren Quellterm δ(r − r ′ )δ(t − t ′ )führt unter den Randbedingungen
zur sogenannten Greenfunktion.
g(r,t,r ′ ,t ′ )=
lim
t→t ′ g(r,t,r′ ,t ′ ) = 0 ∀ r �= r ′
(2.18)
lim
|r|→∞ g(r,t,r′ ,t ′ ) = 0 (2.19)
1
8ρcp[πκ(t − t ′ exp
)] 3/2
� � ′ 2 |r − r |
−
4κ(t − t ′ ��
)
(2.20)
MitdieserFunktionläßt sich die Lösung der inhomogenen Wärmeleitungsgleichung
im unendlich ausgedehnten homogenen Medium für einen beliebigen Quellterm
als Faltung der Greenfunktion mit q(r,t)
T (r,t)=
� t
0
dt ′
� ∞
dr
−∞
′ g(r − r ′ ,t− t ′ )q(r ′ ,t ′ ) (2.21)
berechnen. Insbesondere lassen sich mit Hilfe eines Quellterms der Form
q(r ′ ,t)=q(r ′ )δ(t) (2.22)
feste Randbedingungen für die Temperatur zur Zeit t = 0 vorgeben und damit
auch die durch die homogene Wärmeleitungsgleichung beschriebenen Probleme
als Spezialfall von Gleichung 2.21 behandeln.
Punktquelle
Eine instantane Punktquelle bei r = 0 erzeugt eine kugelsymmetrisch gaußförmige
Temperaturverteilung der Form
�
q
T (r, t) =
exp −
8ρcp(πκt) 3/2 r2
�
, (2.23)
4κt
wie aus der Gleichung 2.20 direkt abgelesen werden kann. Nach einer Zeit von
t = ω2 0/(4κ) erreicht diese Verteilung eine Breite (1/e Abfall) von ω0. Die Zeit
τ1/2, diefür eine Halbierung der Temperatur bei r =0benötigt wird, errechnet
sich gemäß Gleichung 2.23 zu:
τ1/2 = ω2 0
4κ (22/3 − 1) ≈
(2ω0) 2
27κ
(2.24)
Zurückgehend auf Anderson [7] wird diese Beziehung häufig als Richtwert für die
thermische Relaxationszeit einer kugelförmigen absorbierenden Struktur mit dem
Durchmesser 2 ω0 genommen.

34 Theorie
Wärmeleitung in ausgedehnten Kugeln und an Mediengrenzen
Für Medien, bei denen die thermischen Materialeigenschaften nicht unabhängig
vom Ort sind, verliert das Superpositionsprinzip in Bezug auf den Raum seine
Gültigkeit, und der Green-Formalismus kann nur noch auf die zeitliche Temperaturentwicklung
angewendet werden. Trotzdem können für einfache Geometrien
analytische Lösungen gefunden werden.
Dies gilt auch für absorbierende Partikel in Wasser. Speziell betrachtet sei hier
zuerst das eindimensionale Problem, das sich ergibt, wenn zwei verschiedene Medien
bei x=0 aneinanderstoßen, die zum Zeitpunkt t=0 unterschiedliche aber
homogene Temperaturen besitzen:
�
T0 : x>0
T (x, 0) =
(2.25)
0 : x < 0
Für die Grenzfläche gelten folgende Randbedingungen für alle Zeiten t,
K1
T1(0,t) = T2(0,t) (2.26)
∂T1(0,t)
∂x
= K2
∂T2(0,t)
∂x
, (2.27)
wobei mit 1 die Medieneigenschaften für x0 indiziert werden. K1,K2 sind die Wärmeleitfähigkeiten
der Materialien. Das Problem wird also durch ein System von zwei gekoppelten
Differentialgleichungen beschrieben. Die Lösung läßt sich mit Hilfe der so
genannten Errorfunktion
K1κ −1/2
1
Erf(x) = 2
√ π
+ K2κ −1/2
2
� x
0
exp[−ξ 2 ]dξ (2.28)
ausdrücken und wird von Carslaw [28] wie folgt angegeben:
T1(x, t) =
K1κ −1/2
1 T0
K1κ −1/2
�
−1/2
K2κ2 1+ −1/2
1 + K2κ2 K1κ −1/2
�
x
Erf
2
1
√ �
κ1t
�
T2(x, t) =
K1κ −1/2 � �
1 T0
|x|
1 − Erf
2 √ ��
κ2t
(2.29)
(2.30)
Für eine ausgedehnte homogene Kugel, die von Wasser umgeben ist, wurde das
Problem von Goldenberg [65] für folgende Randbedingungen gelöst: Zur Zeit
t=0 befinden sich sowohl die Kugel als auch die Umgebung auf einer Temperatur

Theorie 35
T = 0. Die Kugel mit dem Radius R stellt eine Wärmequelle dar, die mit einer
konstanten Rate A Wärme erzeugt. Die Temperatur an der Kugeloberfläche muss
stetig sein.
Die Größen, welche die Kugel beschreiben, sind mit dem Index 1 versehen, die
physikalischen Größen des umgebenden Mediums besitzen den Index 2.
Innerhalb der Kugel wird die Temperaturentwicklung durch die inhomogene Wärmeleitungsgleichung
mit Quellterm und außerhalb der homogenen Wärmeleitungsgleichung
ohne Quellterm beschrieben. Die genannten Randbedingungen werden
durch folgende Gleichungen ausgedrückt:
∂T1
K1
∂r
T1 = T2 =0 , für t =0für alle r (2.31)
T1 = T2 , für r = R für alle t (2.32)
∂T2
= K2
∂r
, für r = R für alle t (2.33)
Die Temperatur außerhalb einer Kugel mit Radius R kann nach Goldenberg [65]
für einen konstanten Quellterm
T2(r) = R3 �
A 1 K1
− J
rK1 3 K2
2
�
(2.34)
π
J =
�∞
0
e −y2t γ1 y3 (sin y − y cos y)[by sin y cos σy − (c sin y − y cos y)sinσy]
[(c sin y − y cos y) 2 + b2y2 sin2 dy (2.35)
y]
b = K2
K1
� κ1
κ2
, c =1− K2
K1
,γ1 = R2
κ1
,σ=
�
r
�
− 1
R � κ1
κ2
(2.36)
berechnet werden, wobei y die Integrationsvariable darstellt und r die Entfernung
von der Kugeloberfläche, für den die Lösung berechnet ist, in der Variable
σ enthalten ist. Die Heizrate A erhält man aus dem pro Volumen und Zeit absorbierten
Laserlicht. Die Gleichung 2.4 beschreibt die Temperatur T nach einer
Zeit t, wenn zum Zeitpunkt t =0dieWärmequelle A angeschaltet wird und bis
zur Zeit t der Kugel Wärme mit einer konstanten Rate zugeführt wird. Da die
thermische Diffusivität von Gold fast 900 mal höher ist als die von Wasser, kann
davon ausgegangen werden, dass die Partikel räumlich homogen geheizt werden.
Da die Wärmeleitungsgleichung in der Zeit linear verläuft, kann die Temperatur
nach einem kurzen Laserpuls der Länge ∆t d.h. einem zeitlich endlichen Quellterm
berechnet werden:

36 Theorie
Es wird die Lösung mit eine Heizrate A+ mit der um ∆t verschobenen Kühlrate
A− addiert.
T∆t = T2(t, A) − T2(t − ∆t, −A) (2.37)
Man erhält damit eine Funktion, die den Temperaturverlauf nach einem zeitlich
rechteckförmigen Temperatursprung für einen bestimmten Ort beschreibt.
Läßt man den Zeitabstand ∆t gegen 0 laufen, erhält man die Temperaturantwort
auf einen infinitesimal kurzen Laserpuls, d.h. man kann die Lösung als zeitliche
Greenfunktion zur Berechnung der Temperatur bei nicht konstanter Heizrate
A(t) nutzen. Da das Problem kugelsymmetrisch ist, beschreibt die Lösung den
Temperaturverlauf nach einem Deltapuls in einem bestimmten Abstand von der
Partikeloberfläche. Eine Lösung, bei der die Absorption der 15 nm Goldpartikel
eingesetzt wurde, ist beispielhaft für einen infinitesimal kurzen Puls in Abbildung
2.9 dargestellt. Der Absorptionsquerschnitt wurde wie in Abschnitt 2.5.1
näher ausgeführt über die Mie-Theorie berechnet. Die Temperatur nimmt mit
der Entfernung von der Oberfläche ab. Die Spitzentemperatur wird an der Oberfläche
am Ende des Heizpulses erreicht. In der Entfernung wird aufgrund der
Wärmeleitung die Spitzentemperatur erst später erreicht.

Theorie 37
Greenfkt. [K m²/J²]
. -10
110
10 -11
110
. -12
0
0nm
5nm
10 nm
2´ 10 -9
4´ 10 -9
Zeit [s]
6´ 10 -9
8´ 10 -9
1´ 10 -8
Abbildung 2.9: Lösung der Greenfunktion, in der bereits die Absorption
berücksichtigt wurde (siehe Gleichung 2.4) für 15 nm Goldpartikel an der Partikeloberfläche,
in 5 nm Entfernung und in 10 nm Entfernung für eine Bestrahlung mit einem
infinitesimal kurzen Puls von 1 J/m2 .
In Abbildung 2.10 ist durch Faltung mit der Lösung aus Abbildung 2.9 die Temperatur
bei einer Bestrahlung von 1 mJ/cm2 auf der Goldoberfläche, in 5 nm und
10 nm Abstand eines 15 nm Goldkolloids mit gaußförmigen Pulsen der Halbwertsbreite
von 26 ps als Funktion der Zeit zu sehen.

38 Theorie
�T[K/(mJ/cm²)]
100
50
20
10
5
2
0
5nm
25
0nm
10 nm
50 75
100
Zeit [ps]
125 150 175 200
Abbildung 2.10: Durch Faltung mit der Greenfunktion aus Abbildung 2.9 berechneter
Temperaturverlauf für einen 26 ps Puls auf der Oberfläche eines 15 nm Goldpartikels
in 5 nm und 10 nm Entfernung von der Partikeloberfläche.
2.5 Eigenschaften von
Nano- und Mikroabsorbern
Nanopartikel verhalten sich physikalisch zum Teil anders als makroskopische
Festkörper. Die optischen Eigenschaften sind gegenüber makroskopischen Stoffen
stark verändert. Aufgrund der Größe weit unterhalb der optischen Wellenlänge
können Elektronen von dem kohärenten elektromagnetischen Feld zu kollektiven
Schwingungen angeregt werden. Dies beeinflußt die Absorption und die Lichtstreuung.
Gleichzeitig steigt der Einfluß von Oberflächeneffekten wie z.B. der
Einfluß der Oberflächenspannung des Wassers auf die Verdampfung.
2.5.1 Gold-Nanoabsorber
Die optischen Eigenschaften von Gold-Nanopartikeln interessieren die Menschen
seit der Antike [198]. Der Grund für das frühe Interesse ist die Tatsache, dass

Theorie 39
Glas mit Gold purpurrot gefärbt werden kann. Im Zuge von Untersuchungen
zu kolloidalem Partikelwachstum in chemischen Lösungen wurde die Farbe von
kolloidalen Lösungen u. a. von Faraday und Kirchner verstärkt untersucht [56,
97]. Für die optischen Eigenschaften von Gold-Nanopartikeln spielen kollektive
Schwingungen der Elektronen in einem Band als auch Übergänge zwischen den
Elektronenbändern von Gold eine Rolle.
Die Partikelausmaße sind dabei deutlich kleiner als die Wellenlänge, so dass die
Partikel von dem Feld der elektromagnetischen Wellen vollständig umgeben werden
und alle Elektronen der Partikel in diesen Feldern oszillieren können. Dies
ist in Abbildung 2.11 dargestellt und veranschaulicht die Effekte, vor allem die
resonante Oszillation der Elektronen, die zu den außergewöhnlichen optischen
Eigenschaften der Nanopartikel führen.
Abbildung 2.11: Lokale elektrische Felder E bei der Wechselwirkung von optischer
Strahlung mit Goldkolloiden in einem transparenten dielektrischen Medium. Abbildung
nach Perner [147](verändert).
Mie-Theorie
Mie [122] berechnete die Absorptioneigenschaften von Goldpartikeln durch die
Betrachtung der elektromagnetischen Felder um sphärische Partikel mit Hilfe der
Maxwellgleichung in sphärischen Koordinaten, in dessen Zentrum sich das Partikel
mit einem komplexen Brechungsindex befindet. Aus den Maxwellgleichungen

40 Theorie
läßt sich die Wellengleichung für elektromagnetische Wellen ψ herleiten [83]:
∆ψ + k 2 m 2 ψ = 0 (2.38)
wobei k die Wellenzahl im Vakuum und m der komplexe Brechungsindex des
Mediums sind. Löst man die Wellengleichung in sphärischen Koordinaten unter
Berücksichtigung folgender Randbedingungen,
n × (H2 − H1) =n × (E2 − E1) (2.39)
n · (m 2 2E2 − m 2 1E1) =n · (H2 − H1) (2.40)
so lassen sich elektrische und magnetische Felder innerhalb und außerhalb der
Kugel berechnen. Gleichung 2.39 beschreibt die Bedingungen für die tangentialen
Komponenten der Felder auf der Kugeloberfläche, Gleichung 2.40 die senkrechten
Komponenten. Der Index 1 beschreibt Größen innerhalb der Kugel, der Index 2
außerhalb der Kugel.
Zur Lösung wird die eingestrahlte ebene Welle in Multipole entwickelt [83]. Eine
analytische Lösung ist dann in Form einer unendlichen Reihenentwicklung
möglich. Die Entwicklung kann für kleine Teilchen in schwach brechenden Matritzen
schon nach wenigen Ordnungen abgebrochen werden. Eine Lösung äquivalent
zur Herleitung der Rayleigh-Streuung nach einer elektrostatischen Beschreibung
erhält man, wenn die Reihe bereits nach dem ersten Term abgebrochen wird. Aus
der Lösung für die Feldstärken können die Absorptions- und Streuquerschnitte
bezogen auf den geometrischen Querschnitt (Q-Faktoren) berechnet werden. Die
Q-Faktoren für Absorption und Streuung können wiederum in eine Potenzreihe
von x = ka = 2πa
λ entwickelt werden. Der Parameter x ist das Verhältnis aus
Kugelumfang (2πa) und Wellenlänge λ .DieQ-Faktorenfür Streuung Qscat und
Absorption Qabs könnendannwiefolgtgenähert werden [83]:
Qabs = A
Ageom
= −Im
�
Qscat = x 4
�
8
3
4x m2 − 1
m2 4
+
+2 15 x3
�
m2 − 1
m2 � �
2
+ ... (2.41)
+2
� m 2 − 1
m 2 +2
�2 m4 +27m2 +38
2m2 �
+ ... (2.42)
+3
Für einen Grössenfaktor x ≤ 0.35 wird der Q-faktor Qabs bei 500 nm Wellenlänge
mit der Gleichung 2.42 auf 10% genau berechnet. In Abbildung 2.12 ist der
Q-Faktor in Abhängigkeit der Wellenlänge für verschiedene Absorbergrößen dargestellt.
Er wurde nach den Angaben von van de Hulst [83] berechnet, der für

Theorie 41
527 nm den komplexen Brechungsindex von Gold mit m =0.767676 − i · 2.23919
angibt.
Q-Faktor
3.5
3.0
2.5
2.0
1.5
1.0
0.5
0.0
450
300 nm
500
150 nm
10 nm
20 nm
Wellenlänge [nm]
40 nm
80 nm
550 600 650
Abbildung 2.12: Nach der Mie-Theorie berechneter Q-Faktor für Goldkugeln mit den
Durchmessern 10 nm bis 300 nm in Abhängigkeit von der Wellenlänge. Der höchste Q-
Faktor von 3.5 tritt bei 80 nm Partikeln auf.
Die Absorption hat für Goldkolloide, die kleiner als 100 nm sind, ein ausgeprägtes
Maximum im Bereich von 530 nm bis 550 nm. Bis etwa 80 nm Durchmesser steigt
der Q-Faktor auf 3.5 an. Für größere Partikel sinkt er wieder ab und die ausgeprägte
Absorptionsbande verschwindet. Dieses Maximum entsteht durch den
Resonanzeffekt der Elektronen in den Partikeln und kann für die Edelmetalle
Kupfer, Silber und Gold beobachtet werden.
Der komplexe Brechungsindex in Metallen kann über die Drude-Sommerfeld-
Theorie [102] beschrieben werden. Der komplexe Brechungsindex m hängt über
m = n + ik = � µm · ɛ(ω) (2.43)
mit der dielektrischen Funktion zusammen. Die relative Permeabilität µm des
Mediums kann dabei als 1 angenommen werden. Darin bestimmt das durch
die s-Elektronen gebildete freie Elektronengas die dielektrische Funktion ɛ(ω) in
folgender Weise:
Ω 2 P
ɛ(ω) =1+χDS(ω) mit χDS(ω) =−
ω2 + iωγDS
(2.44)

42 Theorie
Dabei ist ɛ(ω) die dielektrischen Funktion von Gold mit χDS der Intrabandsuszeptibilität
des freien Elektronengases, in der die Dämpfung γDS und die Plasmafrequenz
ΩP eingehen [102, 147].
Für reale Metalle ist die Dämfungskonstante γDS durch den Kehrwert der mittleren
Stoßzeit τ gegeben und liegt für die genannten Edelmetalle in dem Bereich
τ=40 fs. Dieser Wert wurde für Silber bei 273 K gemessen [10]. Die Plasmafrequenz
Ω 2 2 nee
p = (2.45)
ɛ0ɛmeff
wird durch die Elektronendichte ne und die effektive Elektronenmasse meff be-
stimmt, wobei diese als Hilfsgröße betrachtet werden sollte, da die Leitungselektronen
nur quasi-frei sind und teilweise an die Rumpfelektronen und an die
Elektronen der umgebenden Goldatome koppeln. Das Drude-Sommerfeld-Modell
erklärt qualitativ die Absorption durch freie Elektronen im Leitungsband (Intrabandabsorption).
Bei Edelmetallen muss für eine Erklärung des Absorptionsspektrums
im sichtbaren Bereich jedoch zusätzlich die Inter-bandabsorption betrachtet
werden, bei der es zu einem Energieübertrag zwischen den Energiebändern
kommt. Das bedeutet, dass die elektrische Intrabandsuszeptibilität χDS um einen
Interbandsuszeptibilitätsterm ergänzt werden muss [10, 83]. Die Interbandabsorption
kann in Dipolnäherung als eine Summe von Einelektronenübergängen
der Energie hω zwischen dem Ausgangsniveau i und dem Endniveau f mit einem
Bandabstand von hωif aufgefaßt werden [141]. Abbildung 2.13 zeigt ein gemessenes
Absorptionsspektrum von 15 nm Goldpartikeln. Die Beiträge der Intra- und
der Inter-bandabsorption sind schematisch eingezeichnet.

Theorie 43
Absorption [willk. Einh.]
0.6
0.5
0.4
0.3
0.2
0.1
0
200 300 400 500 600 700 800 900 1000 1100
Wellenlänge [nm]
Absorption von
15 nm Gold-Chymotrypsinkonjugaten
Plasmonenabsorption
Interbandabsorption
Abbildung 2.13: Gemessene Absorption von 15 nm Goldpartikeln zusammen mit der
schematischen Darstellung der Beiträge der Interbandabsorption und der Plasmonenabsorption
jeweils als Funktion der Wellenlänge.
Die dielektrische Funktion realer Metalle hängt von der Gitter- und der Elektronentemperatur
ab. Die Plasmaresonanz hΩP [eV ] von Gold verschiebt sich von
2.3 eV bei 283 K zu 2.12 eV 1336 K kaum. Stärker wirkt sich die Temperaturabhängigkeit
in der Dämpfungskonstante γ0[meV ] aus, die von 40 bei 283 K auf 155
bei 1336 K steigt. Die Temperaturabhängigkeit der Interbandabsorption kann
näherungsweise im Energieabstand zwischen der Fermikante und dem d-Band
berücksichtigt werden [22]:
Feldverstärkung
Ed−EF (TL) =2.35eV − 50.6meV/300K · TL
(2.46)
Durch die kollektive Anregung von Elektronenschwingungen kommt es neben
der erhöhten Absorption zur lokalen Feldverstärkung. Die Feldverstärkungen
können einen Einfluß auf nichtlineare chemischen Reaktionen wie Mehrphotonen-
Photochemie haben. Eine Abschätzung dieser Feldverstärkungen unter der An-

44 Theorie
nahme, dass die Partikel einfache Dipole sind, kann mit [86]
Eloc = E + P
3ɛ0
mit (2.47)
ρP = −Pn (2.48)
erfolgen. Wobei Eloc das lokale elektrische Feld, P die Polarisierbarkeit, ɛ die
dielektrische Funktion von Gold und ρ die Flächenladungsdichte ist. Unter
Berücksichtigung von einem äußeren Medium mit der dielektrischen Funktion
ɛm und der dielektrischen Funktion ɛ der Nanopartikel kann eine Berechnung der
Feldverstärkung nach Kreibig [102] erfolgen,
Eloc = fL · E0 (2.49)
fL =
3 ɛm
ɛ
1+2 ɛm
ɛ
(2.50)
wobei für Edelmetalle ɛ(ω) ≤ 0möglich und damit auch eine Verstärkung möglich
ist. fL wird auch häufig als lokaler Feldverstärkungsfaktor bezeichnet. Für vereinzelte
Partikel konnte die Fluoreszenzverstärkung bis zu einem Faktor 200 an Goldmikrostrukturen
gemessen werden [119, 187]. Die Verstärkungen sind abhängig
von dem Abstand zwischen Fluoreszenzfarbstoff und Partikel. Ein Maximum der
Fluoreszenzverstärkung von FITC markierten Antikörpern konnte bei 40 nm Abstand
gemessen werden. Sind die Farbstoffe näher an der Oberfläche, kommt es
zu einer verstärkten Quenchung. Sind die Farbstoffe weiter entfernt, so nimmt
die Fluoreszenz überproportional ab.
Thermalisierung der Energie in Goldpartikeln
Thermalisierung in Goldpartikeln Neben der in den Goldpartikeln absorbierten
Energie ist auch entscheidend, wie schnell und in welcher Form die Energie
weitergegeben wird, d.h. wie schnell sie thermalisiert wird.
Trifft ein ultrakurzer Laserpuls auf ein Metallnanopartikel, so wird zunächst die
Energie von Elektronen absorbiert, die dadurch nicht mehr thermisch im Gleichgewicht
mit dem Gitter stehen. Als erstes erfolgt die Thermalisierung der Energie
innerhalb des Elektronengases, im Laufe derer die Energieverteilung der Elektronen
in die Fermi-Verteilung übergeht. Nach der Thermalisierung des Elektronengases
durch elastische (Elektron-Elektron) und inelastische (Elektron-Phonon)

Theorie 45
Streuprozesse [69] kühlt das Elektronengas durch Emission von Phononen ab
und heizt das Edelmetallkristallgitter auf. Die Energierelaxation heißer Elektronen
und der Temperaturausgleich mit dem Gitter kann mit einem Ratenprozess
modelliert werden. Das dazugehörige Modell wird auch als Two Temperature
”
Model” bezeichnet. Die Thermalisierung von angeregten Elektronen in Goldnanopartikeln
wurde von mehreren Gruppen untersucht [3, 74, 80, 200]. Die
Ergebnisse sind in Abbildung 2.14 dargestellt.
Abbildung 2.14: Typischer Verlauf von Elektronentemperatur Te und der Gittertemperatur
Tl gemäß dem Thermalisierungsmodell nach einer 150 fs Laserpulsanregung.
Deutlich sind drei Zeitbereiche zu sehen: 1.) die Thermalisierung der Elektronen, 2.)
das Elektronenkühlen und Gitteraufheizen und 3.) das Kühlen auf Umgebungstemperatur.
Abbildung nach Perner [147](verändert).
Nach diesem Modell benötigt die Thermalisierung der Energie des Elektronengases
wenige Pikosekunden, während der Temperaturausgleich zwischen Elektronengas
und Gitter ungefähr 10 bis 15 ps benötigt. Entsprechend bestimmt die
Thermalisierung selbst für Experimente mit 30 ps Pulsen nicht den Temperaturverlauf.
Energierelaxation am Übergang Partikel-Wasser Die Thermalisierung an
der Grenzfläche Gold-Protein-Wasser kann nach Nölting [136] mit der Lösung der
Wärmeleitungsgleichung wie in Abschnitt 2.4 beschrieben werden. Aus der Reaktion
von Proteinen an geheizten Grenzflächen oder durch Farbstoffe in Lösung

46 Theorie
kommt Nölting auf eine Thermalisierungszeit von 10 bis 20 ps für Schichten mit einer
Dicke von einem Protein mit 10 nm Durchmesser. Diese Zeit ist demnach noch
schneller als eine Thermalisierung in reinem Wasser, da die Wärmeleitungsgrößen,
die Nölting für Proteine in Wasser ansetzt, mit cp = 1300 J
kg
, ρ = 1400 kg·K m3 eine höhere Diffusivität ergeben.
K =0.17 J
sKm
Goldpartikeltemperaturen Mit Hilfe von Gleichung 2.4 für die Wärmeleitung
um die Partikel und Gleichung 2.42 für den Q-Faktor kann die Temperatur auf
der Partikeloberfläche bei Bestrahlung mit einer bestimmten Pulsenergie berechnet
werden (Abbildung 2.15). Dabei wurden bei der Näherung von Qabs. für
große Partikeldurchmesser Terme höherer Ordnung berücksichtigt. Von großen
Durchmessern aus kommend bis 80 nm nimmt die Temperatur mit kleiner werdenem
Durchmesser proportional zum inversen Durchmesser zu. Unterhalb von
80 nm im Bereich des thermischen Einschlußes bleibt sie annähernd konstant und
nimmt erst bei kleinen Durchmessern, die außerhalb des thermischen Einschlusses
liegen, proportional zum Durchmesser ab. Die höchsten Sprungtemperaturen
erzielt man mit Partikeln von 80 nm Durchmesser, die für 527 nm die stärkste
resonante Absorption aufweisen.

Theorie 47
�T [K/(mJcm²)]
100
1
0.01
. -9
110
1 ps Puls
1 ns Puls
1 µ s Puls
. -8
110
. -7
110
Goldpartikeldurchmesser [m]
. -6
110
Abbildung 2.15: Berechnete maximale Temperaturerhöhung auf der Oberfläche von
Goldpartikeln in Abhängigkeit der Partikelgrösse für Pulse bei 527 nm der Dauer 1 µs,
1ns, 1ps.
Aus Abbildung 2.15 läßt sich ablesen, dass man für 10 nm Partikel und Nanosekundenpulse
mit Bestrahlungen im Bereich von einigen 100 mJ/cm2 schon Temperaturen
im Bereich von 900◦C induziert. Im Fall der Pikosekundenpulse reichen
Bestrahlungen unter 10 mJ/cm2 schon aus, um extrem hohe Temperaturen bei
1000◦C zu induzieren.
Goldkonjugation
Antikörperkonjugate mit Goldnanopartikeln sind seit Ende der 60er Jahre ein
etabliertes Kontrastmittel zur Visualisierung von Proteintypen in der Elektronenmikroskopie.
Aufgrund der hohen Elektronendichte ergeben sie einen hohen
Kontrast und aufgrund der Möglichkeit, die Kolloide über einen langen Zeitraum
von Wochen in entsprechendem Puffer elektrisch geladen zu halten, haben sie
sich als hervorragend geeignet erwiesen, um geladene Gruppen an die Partikel zu
binden.

48 Theorie
Außer Ladungen spielen hydrophobe Gruppen, die sich zu dem Gold hin ausrichten,
bei der Bindung eine Rolle [81]. Die van der Waals Wechselwirkungen
werden durch diese Umstrukturierung ebenfalls beeinflußt. Bei einer Bindung
von Proteinen ist demnach darauf zu achten, dass die Proteine einerseits fest an
die Partikel gebunden sind, andererseits durch die Bindung nicht denaturieren.
Roth [162, 163] hat für die Konjugation, die diesen Kompromiß erfüllt, das Konzept
entworfen, die Proteine in einem Puffer nahe an ihrem isoelektrischen Punkt
zu konjugieren, damit die effektive Ladung der Proteine gering ist und einzelne
stark geladene Gruppen nicht für eine Denaturierung bei der Bindung sorgen.
Auch nahe am isoelektrischen Punkt stehen noch ausreichend viele Ladungen im
Protein für die Bindung zur Verfügung.
Für eine Konjugation sind entsprechend die Ladung einzelner Proteingruppen,
die Gesamtladung und die Verteilung der hydrophoben Gruppen entscheidend.
Eine effektive Konjugation mit noch intaktem Protein ist nur möglich, wenn die
hydrophoben Gruppen und ausreichend viele geladene Gruppen an die Proteinaußenseite
gebracht werden können, ohne dass die Proteinkonformation stark
gestört wird. Es konnte von Bendayan gezeigt werden, dass nicht nur Antikörper,
sondern auch etliche Enzyme wie z.B. Nuklease so weit auf den Goldpartikeln stabilisiert
werden können, dass sie auch nach mehreren Präparationschritten für die
Elektronenmikroskopie an das Partikel gebunden bleiben. Gleichzeitig werden sie
in ihrer Struktur und Beweglichkeit nur so gering beeinflußt, dass sie weiterhin
enzymatisch aktiv sind [13, 162, 163].
Die Bindung kann sowohl elektronenmikroskopisch als auch direkt optisch kontrolliert
werden, da eine hohe Elektrolytkonzentration bei nicht erfolgter Konjugation
zu einer Aggregation der Nanopartikel führt, die zu einer spektralen
Verschiebung der Absorption führt. Aggregate zeigen dabei analog zu großen
Partikeln eine stark ins Rote verschobene Absorption, wohingegen vereinzelte
Partikel unterhalb von 60 nm eine deutlich ins Blaue verschobene Absorption
aufweisen. Sind die Partikel vollständig mit Protein bedeckt und dadurch in der
Ladung neutralisiert, kommt es nicht mehr zu einer Aggregation, so dass ein
Farbumschlag bei Zugabe von einem starken Elektrolyt nicht mehr stattfindet.

Theorie 49
2.5.2 Magnetit-Mikroabsorber
Bei den genutzten Absorbern, in denen Fe3O4 (Magnetit) in Polystyren bzw. Silikat
gleichmäßig verteilt ist, kann man keine resonante Anregung von Bandstrukturen
erwarten, da Magnetit keine metallischen Elektronenbänder aufweist. Die
Absorption gleicht der Absorption von makroskopischem Magnetit und besitzt
im Sichtbaren keine ausgeprägte Struktur. Das Absorptionsspektrum ist in Abbildung
2.16 dargestellt. Für die genutzten 2.8 bis 8 µm großen Absorber ist der
Durchmesser um einen Faktor 4 bis 8 größer als die Wellenlänge. Es wird erwartet,
dass sich die Partikel fast vollständig als makroskopische Absorber verhalten.
Absorption [willk. Einh.]
9
8
7
6
5
4
3
2
1
0
250 300 450 550 650 750 850 950 1050
Wellenlänge [nm]
Abbildung 2.16: Absorptionsspektrum von in Polystyren oder Silikat eingelagertem
Magnetit.
Kovalente Proteinkonjugation
Außer mit Adsorptionsprozessen oder einer ionischen Wechselwirkung kommen
noch affine Bindungen, wie z.B. die Bindung an ein immobilisiertes Substrat
oder kovalente Bindungen zur Kopplung von Proteinen an Absorberoberflächen
in Frage. Der Hauptvorteil von kovalenten Bindungen besteht darin, dass die
Bindungen sehr stabil sind und damit eine einfache Handhabung erlauben. Es
existiert eine Vielzahl von Kopplungsmöglichkeiten, wobei die Bindungen an Ami-

50 Theorie
nogruppen der Proteine sehr häufig genutzt werden, wenn es sich um eine einfache
kovalente Immobilisierung handelt. Die gängigsten kovalenten Kopplungen sind
in Tabelle 2.2 zusammengefaßt. Die Kopplungsmöglichkeiten wurden im Detail
von Hermanson [79] beschrieben.
funktioneller Anker Reaktionspartner Reaktion
-SiO2, -TiO2, -HfO2 -Si(Cl) x,
-Si(OR)x direkt
-Au, -Ag -SH direkt
-COOH -NH2 mitCarbodiimid
O
O N
(N-Hydroxysuccinimid, NHS)
O
O
R
-NH2
O
Epoxid
O
N
O
Maleinimid
O
N
H NH 2
Säurehydrazid
-NH-NH2
Hydrazid
-NH 2
-NH 2
-NH 2
direkt
reduktive Aminierung
mit NaCNBH 3
Glutardialdehyd
-NH2, -SH, -OH direkt
-SH, -NH2 direkt
O
H
mit IO4 - aktiviertes
Kohlenhydrat
Tabelle 2.2: Eine Auflistung der gängigsten Kopplungsliganden / Moleküle für die
kovalente Kopplung von Proteinen an Festkörper.
Für eine Erhaltung der Enzymstruktur und Labilität d.h. der Enzymfunktion sollte
eine Bindung erfolgen, die möglichst wenig Quervernetzungen innerhalb der
Proteine zur Folge hat. Nutzt man die am häufigsten verwendeten Linker zwischen
den Aminogruppen oder den Aminogruppen mit OH-Gruppen, so kommt
es zu einer Quervernetzung von Asparagin, Glutamin, Lysin und Arginin, mehr
oder weniger also zu einer vollständigen Vernetzung der Aminosäuren im Prote-
direkt
direkt

Theorie 51
in. Ein bekanntes Beispiel hierfür ist die Immobilisierung mit Glutardialdehyd.
Ortsspezifische Anker, die sowohl in das Protein als auch auf der Oberfläche synthetisiert
werden und nur eine Bindung an diese Ankermoleküle erlauben, sind
die optimale Lösung. Da dies vor allem auf der Proteinseite aufwendig ist, ist die
nächstbessere Lösung eine zweistufige Reaktion, in der an die Oberfläche und an
die Proteine jeweils ein Linker gebracht wird, der nur mit seinem Gegenstück reagieren
kann, so dass es nur zu einer Vernetzung der Proteine mit der Oberfläche,
nicht jedoch der Proteine untereinander oder der Proteine mit sich selbst kommen
kann. Ein Standardverfahren hierfür ist die Kopplung der Partikel über Carbodiimide
zusammen mit N-Hydroxysuccinimide (NHS) [67]. Der Reaktionsablauf
ist in Abbildung 2.17 dargestellt.
COOH
aktivierter Zwischenzustand
primäre Aminogruppe
des Enzyms
Zwischenzustand
Amid
Bindung
Abbildung 2.17: Die Reaktion von Carbodiimiden auf den Partikeloberflächen (R)
mit Aminogruppen der Proteine (R ′ ) kann ohne Quervernetzung innerhalb der Proteine
erfolgen, wenn man das reaktive Zwischenprodukt verestert und erst anschließend die
zu bindenden Proteine (R ′ ) beigibt. Abbildung nach [79](verändert).
Mit dieser Kopplung kann es nur noch zu einer Bindung von den primären Aminogruppen
d.h. den Enden der Polypeptidketten an die COOH-Gruppe d.h. an
die Partikeloberfläche kommen. Betrachtet man die Struktur von alkalische Phosphatase
bzw. Chymotrypsin, so sind im Fall von alkalische Phosphatase die Bindungstellen
am ehesten die beiden nach unten zeigenden Polypeptidkettenenden
und im Fall von α-Chymotrypsin das freie Ende der leichten Kette.

52 Theorie
Partikel
aP
Chymotrypsin
Abbildung 2.18: Die Reaktion der Ester-Zwischenprodukte mit den Proteinen kann
vor allem mit den N-terminalen Aminogruppen erwartet werden, die in der Darstellung
blau dargestellt sind. Die C-terminalen Gruppen sind rot dargestellt (Strukturen nach
Protein Data Bank [182, 191, 15]).
Durch die limitierten Möglichkeiten der Bindung der veresterten Carbodiimide
an die Proteine ist eine Kopplung im Fall der genutzten Enzyme für eine gewisse
Orientierung mit gleichzeitiger Bindung an wenigen Ankerstellen möglich.

Kapitel 3
Material und Methoden
3.1 Lasersysteme
Zur Untersuchung von Mikro- und Nanoeffekten wurden Partikel mit Durchmessern
von 15 nm bis 8 µm eingesetzt. Die Laserpulslänge und -energie wurde an die
thermische Relaxationszeit der einzelnen Partikeltypen angepasst. Somit wurden
Pulslängen von 35 ps bis 15 µs eingesetzt.
Die benötigte Bestrahlungsstärke pro Probe ergibt sich aus der Absorption und
der Wärmeleitungseigenschaften der Partikel sowie den Anforderungen an die
Homogenität der Bestrahlung innerhalb des Probenvolumens. Die Anforderungen
an die Piko- und Nanosekundenlaser haben sich aus der Wahl von Gold
als bevorzugten Absorber, einem Probenvolumen im Mikroliterbereich und einer
Homogenität im transversalen Strahlprofil von mehr als 90% in Bezug auf
den Bestrahlungsmittelwert ergeben. Um Temperaturerhöhungen von mehr als
1000 K auf der Partikeloberfläche zu erreichen, wurden bei Verwendung von 15 nm
Goldpartikeln Bestrahlungen von 10 mJ/cm2 mit den ps Pulsen benötigt. Werden
die Partikel mit Nanosekundenpulsen bestrahlt, muss die Bestrahlung fast 2
Grössenordungen höher sein, da die Pulse wesentlich länger als die thermische Relaxationszeit
sind und damit durch Wärmeleitung ein großer Teil der Energie an
die Umgebung abgegeben wird. Die benötigte Gesamtenergie ergibt sich aus der
Probengröße. Die Probentiefe in Strahlrichtung sollte so gering ausfallen, dass
man keine Abschattungseffekte innerhalb derProbezuerwartenhat,d.h.eine
Gesamtabsorption der Probe von 0.01 sollte nicht überschritten werden. Für eine
53

54 Material und Methoden
quantitative Auswertung der Bestrahlungsexperimente ist eine möglichst homogene
Bestrahlung notwendig, da erwartet wird, dass die Effekte sehr stark von
der Temperatur und damit von der Bestrahlung abhängen.
Aus den Laserenergieverlusten zur Erzeugung einer homogenen Bestrahlung von
ca. 90% und einem Probendurchmesser im Millimeterbereich ergeben sich aus
den benötigten Bestrahlungen die Laserenergien ca. 100 mJ im Fall der ns Pulse
und ca. 1 mJ im Fall der ps Pulse.
Die Versuche mit Partikeln im Mikrometerbereich wurden mit Magnetit gesättigten
Partikeln durchgeführt, die als magnetische Partikel in biologischen Anwendungen
weit verbreitet sind [139]. Die Bestrahlungen, die man für die Erhitzungen
solcher Mikroabsorber benötigt, liegen im Bereich von 3000 mJ/cm2 innerhalb
von 5 µs.
3.1.1 Mikrosekundenpuls-Laser
Für die Mikrosekunden-Experimente war es notwendig, einen Laser aus vorhandenen
Komponenten aufzubauen, der eine Wellenlänge zwischen 500 nm und
1000 nm und eine Pulsspitztenleistung von 1 MW/cm2 besitzt. Eine einstellbare
Pulsdauer zwischen 5 µs und 50 µs war gewünscht. Im Prinzip gab es zwei
mögliche Ansätze, um µs Pulse mit hohen Bestrahlungen zu erzeugen. Ein
kontinuierlicher Hochleistungslaser kann unterbrochen werden oder es kann ein
Laser im gepulsten Betrieb mit hohen Pulsleistungen genutzt werden. Bei einem
Probenradius von einem Millimeter gelangt man unter Berücksichtigung
der benötigten Bestrahlungen zu Lasern, die eine kontinuierliche Leistung von
ca. 5 kW emittieren müssen. Erst bei einem Probenradius von 100 µm könnten
übliche 20 W Argonlaser genutzt werden.
Deshalb wurde ein blitzlampengepumpter µs Puls Laser aufgebaut. In Frage
kamen Lasermedien, die eine möglichst kurze Fluoreszenzlebensdauer besitzen,
damit der Laserpulsverlauf ohne Spiking dem Pumplichtverlauf folgt [87]. Außerdem
sollten die Lasermedien hohe Intensitäten im Bereich von 1 MW ermöglichen.
Diese beiden Anforderungen haben die Auswahl an möglichen Lasermedien stark
eingeschränkt. Die folgende Tabelle enthält die Fluoreszenzlebensdauer verschiedener
Lasermedien für Pulslaser [99]: Das Lasermedium sollte eine Lebensdauer
im Laserniveau unterhalb der thermischen Relaxationszeit der Partikel haben,

Material und Methoden 55
Fluoreszenzlebensdauer [µs]
Rubin Nd:YAG Nd:YLF Alexandrit Ti:Sa Rhodamin6G
3000 230 480 260 3.2 0.005
Tabelle 3.1: Fluoreszenzlebensauern von Festkörperlasermedien.
um keine Temperaturschwankungen an der Partikeloberfläche durch längere statistische
Intensitätsspitzen (spikes) hervorzurufen.
Aus den Fluoreszenzlebensdauern ist klar ersichtlich, dass Titan-Saphir (Ti:Sa)
das einzige gängige Festkörperlasermedium ist, das ausreichend kurze Fluoreszenzlebensdauern
besitzt, um im µs Zeitbereich glatte Pulse zu erwarten. Bei
allen anderen Medien treten Relaxationsschwingungen auf. Für Ti:Sa kann ein
Spiking im Zeitbereich etwas kleiner als die Fluoreszenzlebensdauer erwartet werden.
Neben dem Ti:Sa können auch mit gepulsten Farbstofflasern glatte Mikrosekundenpulse
erzeugt werden [186].
Mikrosekundenpuls-Farbstofflaser
Als Lasermedium wurde Rhodamin 6G (R6G) verwendet. Der Laser wurde im
Maximum der Verstärkung von R6G bei 600 nm betrieben.
Aufgrund der gewünschten kurzen Laserniveaulebensdauern wurde der Farbstoff
mit einer leistungsstarken Blitzlampe und speziellen Pumpkammer für Rhodamin
6G (Baasel Lasertech, Deutschland) mit bis zu 6.5 MW Spitzenleistung betrieben.
Das Simmer-Netzteil erzeugt einen Simmerstrom von 500 mA bei einer
maximalen Spannung von 600 V. Dadurch muss während der Entladung der
Kondensatoren nicht erst die negative Flanke des k-Werts der Blitzlampen durchlaufen
werden und es findet direkt ein Anstieg der Lichtemission mit der Kondensatorentladung
statt [154]. Das Emmissionsspektrum von stark gepumpten
Blitzlampen liegt aufgrund der Schwarzkörperstrahlercharakteristik weit im blauen
Spektralbereich [70], so dass das Licht größten Teils nicht zum Pumpen des
Laserprozesses genutzt werden kann. Dadurch kommt es neben dem Pumpprozeß
zu chemischen und thermischen Störungen des Lasermediums. Um das Pumplicht
möglichst auf das benötigte Pumpspektrum einzugrenzen, wurde ein abbildender
einfach elliptischer Reflektor mit einer dichroitischen Verspiegelung, deren Reflektivität
auf Rhodamin 6G angepasst ist, genutzt.

56 Material und Methoden
Die Farbstoff-Küvette hat einen Innendurchmesser von 6 mm, eine Wandstärke
von 1 mm und eine aktive Länge von 250 mm. Die Blitzlampe befand sich in einer
Durchflußküvette, mit der die Blitzlampe gekühlt wird. Um das abgestrahlte
UV-Licht der Blitzlampe zu absorbieren, besitzt die Durchflußküvette eine Dotierung,
die im UV-Bereich absorbierend wirkt. Zusätzlich wurde zum Kühlwasser
Koffein in einer Konzentration von 5 g/l zugesetzt, das ebenfalls als UV-Filter
dient [143]. Somit ist der UV-Anteil im Pumplicht durch die Absorption in der
Durchflußküvette und durch den spektral angepaßten Reflektor stark verringert,
dass Photochemie so weit wie möglich verhindert wurde. Der Farbstoff-Durchfluß
wurde so ausgelegt, dass die Farbstofflösung komplett nach jedem Puls ausgetauscht
wurde. Bei einem Innendurchmesser der Farbstoff-Küvette von 6 mm
und einem Fördervolumen von 15 l/min betrug die Zeitdauer für den Austausch
des Farbstoffs in der Küvette ca 11 ms. Für die Zeitdauer der Anregung im
Mikrosekundenbereich ergab sich aber eine quasi-stationäre Farbstofflösung.
In der Kondensatorendladeeinheit, im weiteren als Puls Forming Network (PFN)
bezeichnet, stehen zwei Endladekreise für den Anschluß von zwei Blitzlampen zur
Verfügung. Die zwei Entladekreise sind wiederum in je 4 einzelne Entladeeinheiten
unterteilt worden. Das PFN besitzt zwei Zeitbereiche, in denen Zeiten von
3bis40µsund 15 bis 160 µs vorgewählt werden können. Im kleinen Zeitbereich
stehen 8 µF pro Blitzlampe zur Verfügung. Im großen Zeitbereich steht die doppelte
Kondensatorkapazität zur Verfügung. Je nach Einstellung der Zeit werden
die einzelnen Kondensatoren in den Kondensatorbänken hintereinander entladen,
was zu Pumpleistungmodulationen im Mikrosekundenbereich führt. Als elektrische
Pumpenergien pro Blitzlampe stehen im kleinen Zeitbereich 81 J (Umax=
4,5 kV) und im grosser Zeitbereich 98 J (Umax= 3,5 kV) zur Verfügung. Daraus
ergeben sich bei Entladungsdauern zwischen 3 µs und 160 µs Pumpleistungen
zwischen 27 MW und 0.6 MW.
Wie in Abbildung 3.1 gezeigt, folgt der Laserpuls nicht dem Pumplicht, sondern
zeigt Maxima mit einer Dauer von ca. 5 µs. Des weiteren erlischt der Laserpuls,
bevor die Pumpleistung abnimmt. Akustische, photochemische sowie thermische
Störungen können hierfür verantwortlich sein.

Material und Methoden 57
Diodensignal [willk. Einh.]
1,2
0,8
0,4
0
Anregungspuls
Laserpuls
0
10 20 30 40 50 60 70 80
Zeit [µs]
Abbildung 3.1: Laserverhalten des Rhodamin 6G Lasers bei 80 µs Pumplichtdauer
und 98 J Pumpenergie.
Sowohl akustische als auch thermische Störungen führen zu einer Refraktionsänderung
im Lasermedium und damit zu einer Linse, die die Güte des Resonators
beeinträchtigt. Eine thermische Linse konnte durch die Vermessung der Pilotlaserablenkung
bei 633 nm beobachtet werden. Die Linsenwirkung wurde nicht
weiter quantifiziert. Die thermische Linse läßt sich in erster Linie durch Vermeidung
von Pumplicht in nicht genutzten Wellenlängenbereichen vermeiden, was
jedoch wie zuvor beschrieben schon weitestgehend optimiert wurde.
Als weitere Optimierung des Systems wurden photochemische Effekte minimiert.
Durch die lange Anregungsdauer kommt es im Farbstoff zu erhöhter Triplettabsorption
[186]. Die angeregten Triplettzustände besitzen in Ethanol eine Lebensdauer
von ca. 5 µs. Die Farbstoffmoleküle im Triplettzustand sind nicht
laseraktiv und können in irreversiblen chemischen Reaktionen vor allem mit Sauerstoff
zerstört werden. Sauerstoff selbst führt jedoch zu einer effektiven Triplettlöschung.
Als zusätzlicher Triplettlöscher wurde 1,3,5,7-Cyclooctatetraen
(COT) eingesetzt. Die Meßergebnisse dieser Untersuchung sind in der Abbildung
3.2 dargestellt.

58 Material und Methoden
Diodensignal [willk. Einh.]
6
4
2
Anregungspuls
1
0
2
3
4
0
1
ohne Zusatz
1mM
2
3
4
2mM
3mM
4mM
0
0 5 10 15 20 25 30 35 40
Zeit [µs]
Abbildung 3.2: Zugabe von COT zu R6G als Triplettquencher. Die Pulsform bleibt
unverändert moduliert, wohingegen die Laserenergie ansteigt.
Wie aus Abbildung 3.2 ersichtlich, ergibt sich keine Veränderung der Pulsform
durch die Zugabe von COT. Die einzige Veränderung besteht in einer Erhöhung
der Pulsenergie durch die COT-Zugabe.
Um photochemische Reaktionen weiter zu unterdrücken, wurde der Farbstoff
Rhodamin 6G Perchlorat Radiant Dyes GmbH, Deutschland verwendet, der chemisch
besonders inert ist [155]. Durch den veränderten Farbstoff kam es zu keiner
wesentlich besseren Laserleistung, sondern in erster Linie zu einer erhöhten
Farbstofflebensdauer. Als Farbstoffkonzentration wurde 10−4 mol/l in Ethanol
verwendet. Die Energie fiel bei einem 1 l Farbstoffreservoir innerhalb von 1000
Pulsen auf die Hälfte ab. Um die Lebensdauer des Farbstoffs zu erhöhen, wurden
weitere Maßnahmen getestet, die im Folgenden beschrieben werden.
Erstens wurde durch kontinuierliches Zuführen von Stickstoff die Sauerstoffkonzentration
in der Farbstoff-Lösung mit dem Ziel verringert, chemische Reaktionen
mit Sauerstoffradikalen zu unterdrücken. Die Laserschwelle wurde dadurch
deutlich erhöht, und es zeigte sich ein nur kurzer Laserpuls mit geringer Energie.
Dieses Ergebnis läßt sich über die Wirkung von Sauerstoff als effizienter
Triplettlöscher erklären. Zweitens wurde neben COT Glycerin, das ebenfalls
als guter Triplettlöscher in ethanolischen Lösung beschrieben ist [186], zu dem

Material und Methoden 59
Farbstoff zugegeben. Mit einer Farbstofflösung aus(1 l Ethanol + 1/2 l Glycerol
85 % + 1/2 l H2O) konnte der Energieabfall auf 17% nach 1000 Pulsen verringert
werden.
Optimiertes Farbstofflasersystem Der kürzest mögliche Resonator mit der
zuletzt beschriebenen Farbstoffmischung aus Ethanol, Glycerol und Wasser hat
einen Auskoppelgrad des Resonators von 30% erlaubt. Mit dieser Konfiguration
wurden Laserenergien bis hin zu einem Joule bei 20 µs Pulslänge erreicht. Es
konnte eine maximale Pulslänge bis zu τp =35 µs und einer Pulsenergie von 100 mJ
bei ca. 2 kV Ladespannung erzeugt werden. Das Strahlprofil war näherungsweise
gaußförmig und konnte durch eine Faser gut homogenisiert werden, da die nicht
weiter quantifizierte Kohärenzlänge ausreichend klein ist. Die Abbildung 3.3 zeigt
mit diesem System erzielte Laserpulse.
Diodensignal [willk. Einh.]
1.2
1
0.8
0.6
0.4
0.2
0
2
1
4
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90
Zeit [µs]
3
1
2
3
4
Anregungspuls
Laserpuls
Anregungspuls
Laserpuls 35 µs
Abbildung 3.3: Maximale und minimale Pulsdauer des Rhodamin 6G Lasers zusammen
mit den jeweiligen Pumplichtpulsen.
Problematisch bei dem System blieben die phochemischen Prozesse, die zu einer
geringen Standzeit der Farbstofflösung und zu kurzen Pulsen geführt haben.
Sowohl COT als auch Glycerol haben keine Pulsdauerverlängerung gebracht, sondern
in erster Linie eine irreversible Schädigung der Farbstoffmoleküle verhindert.

60 Material und Methoden
Deswegen scheint für die Triplettlöschung während des Pulses unverändert Sauerstoff
verantwortlich gewesen zu sein, so dass in dem System Glycerol mehr als
Radikalfänger für Sauerstoffradikale wirkt und so die Laserlebensdauer erhöht.
Die 5 µs andauernden Intensitätsmodulationen werden durch die Pumplichtmodulationen
hervorgerufen, falls die Schwelle so ansteigt, dass der Laser quasi
immer schwellennah betrieben wird. Diese Theorie wird von der Tatsache untermauert,
dass die Dauer der Modulation und deren Zeitpunkt gut mit der Entladedauer
der einzelnen Kondensatoren des PFNs korreliert. Die Entladung von
mehreren Entladekreisen hintereinander hat sich somit als kontraproduktiv erwiesen,
da auf diese Weise zwar lange Pulse erzeugt werden können, diese zeitlich
aber immer moduliert bleiben.
Mikrosekundenpuls Titan-Saphir-Laser
Parallel zum Farbstofflasersystem wurde ein Titan-Saphir-Festkörperlaserkopf für
das gleiche PFN aufgebaut, der Bestrahlungen bei 800 nm erlaubt. Die Absorption
von Magnetit bei 800 nm fällt im Vergleich zu 600 nm vom Farbstofflaser
um nur 10 % kontinuierlich ab, so dass für die Bestrahlung der Absorber-
Proteinkonjugate nur geringfügig höhere Bestrahlungen erreicht werden müssen.
Es wurde analog zu dem Farbstofflaser ein möglichst kurzer Resonator, eine abbildende
Pumpkammer und ein auf die Laserenergie optimierter Auskoppelgrad
gewählt. Die Resonatorlänge betrug 36,5 cm. Die Pumpkammer ist doppelt elliptisch,
abbildend mit einem Silberreflektor (Light Age Inc., USA). Als Blitzlampen
haben Lampen vom Typ Q-Arc/L6790 gedient, die oberhalb ihrer Spezifikationen
betrieben wurden. Es wurde ein Laserstab mit 6 mm Durchmesser, 140 mm
Länge und einer Titandotierung von 0.07% genutzt (HAM, Andreas Maier GmbH,
Deutschland). Als Auskoppelspiegel hat ein 85% Planspiegel in Kombination mit
einem Konkavspiegel (2 m) zu der maixmalen Laserenergie geführt. Mit dem beschriebenen
Resonator können Pulse mit einstellbarer Pulslänge erzeugt werden.
Die Pulse bei maximaler Pumppulslänge des PFNs zerfielen durch das sukzessive
Entladen der 4 Kondensatorbänke pro Lampe in Einzelpulse, da die Pumpleistung
in dem genutzten PFN nicht ausreichend war. Bei annähernd rechteckiger
Pulsform wurden Pulslängen von maximal 35 µs mit einer Energie von 80 mJ
erreicht. Die minimale Pulslänge lag bei 15 µs, bei der eine deutlich höherer
Energie von 270 mJ (Abbildung 3.4) erreicht wurde. Die maximalen Puls-zu-Puls-

Material und Methoden 61
Schwankungen innerhalb von 10000 Pulsen betrugen 15%. Diese Puls-zu-Puls-
Schwankungen wurden in erster Linie durch Schwankungen der Pumplichtpulse
hervorgerufen.
Diodensignal [willk. Einh.]
8
6
4
2
Diodensignal [willk. Einh.]
0 0
0 10 20 30 40 50 60 0 10 20 30 40 50 60
a) b)
t [µs]
8
6
4
2
t [µs]
Abbildung 3.4: Ti:Sa Pulse a) minimaler (15 µs)- und b) maximaler Pulsdauer
(35 µs).
Für eine Bestrahlung der Mikroabsorber stellte sich die Frage, ob eine Bestrahlung
mit 35 µs Pulsen einen Vorteil gegenüber einer Bestrahlung mit 15 µs Pulsen
bringt. Eine Abschätzung ist mit Hilfe von Temperaturrechnungen möglich, die
im Detail in Abschnitt 5.1.1 vorgestellt werden. Der Temperaturverlauf für Partikel
mit 8 µm Durchmesser ist für die minimale und maximale Pulsdauer des
Ti:Sa Lasersystems in Abbildung 3.5 dargestellt.
Diodensignal
12
10
8
6
4
2
max. Pulsdauer
min. Pulsdauer
T [K/(mJ/cm²)]
0
a)
0 20
Zeit [µs]
40 80
b)
0.175
0.125
0.075
0.025
0
Temperatur
normierte Raten
0 40 80
Zeit [µs]
Abbildung 3.5: a) Minimale und maximale Pulsdauer des Ti:Sa Lasers mit Pulsenergien
> 50 mJ. b) Berechneter Temperaturverlauf auf der Oberfläche von 8 µm
Silika-Absorbern zusammen mit der thermischen Denaturierungsrate von Phosphatase
für diese Temperaturverläufe.
In den Temperaturverläufen ist deutlich zu sehen, dass die Intensitätsschwankungen

62 Material und Methoden
im 100 Nanosekundenbereich des Ti:Sa Lasers durch die Wärmekapazität der
Partikel ausgeglichen werden. Durch die exponentiell temperaturabhängige Reaktion,
die untersucht werden soll, wird mehr als 90% der Denaturierung von
den Temperaturen in der Nähe der Maxima induziert. Die langen Pulsdauern
verursachen somit in dieser Form keinen deutlich stärkeren Effekt im Vergleich
zu den um den Faktor 2 kürzeren Pulsen.
Eine gute Reproduzierbarkeit der Laserpulsform ist eine Bedingung, um die Ergebnisse
von Experimenten mit einer zeitlich modulierten Bestrahlung auswerten
zu können, da man in diesem Fall die Schäden unter Berücksichtigung der Pulsform
berechnen kann. Hier liegt der Hauptvorteil des Ti:Sa Systems gegenüber
dem Farbstofflaser: die Pulse sind sehr viel besser reproduzierbar. Eine Nutzung
des Rhodamin 6G Farbstofflasers für einzelne Versuche, in denen die Proben nicht
miniaturisert werden können, ist in Zukunft sinnvoll, da mit dem Farbstofflaser
um einen Faktor 10 höhere Energien erreicht werden konnten als mit dem Ti:Sa
Laser.
3.1.2 Nanosekundenpuls Nd:YAG Laser
Die Bestrahlung von Gold-Protein-Konjugaten wurden mit zwei frequenzverdoppelten
Nd:YAG Nanosekunden-Lasersystemen durchgeführt. Für Experimente
mit Pulsenergien bis 10 mJ bei 532 nm wurde ein Multimode-Q-switch Laser ohne
Verstärker genutzt (MBB). Höhere Energien bis 120 mJ bei 532 nm wurden
mit einem nachverstärkten System ( YG671-10, Continuum, USA) erreicht. Beide
Systeme haben gemeinsam, dass der Laser resonatorextern verdoppelt, die
Güte der Resonatoren durch eine Pockelszelle geschaltet und der Oszillator auf
einen multimode-Betrieb zur Erzielung hoher Pulsenergie ausgelegt ist. Zwischen
Verdoppler und Verstärker befindet sich im Continuum-System ein λ/2-Plättchen
und ein Polarisator, mit dem die Energie abgeschwächt werden kann. Damit ist
im Fall des Continuum-Systems das Strahlprofil bis auf die Energieabhängigkeit
der Verdopplungseffizienz unabhängig von der Laserengie. Beim MBB System
wurde die Pulsenergie über die Pumpenergie eingestellt. Dabei muss mit einer
Änderung des Strahlprofils durch eine Änderung der thermischen Linse und der
Pulslänge gerechnet werden.
Die Puls-zu-Puls-Schwankungen im Fall des MBB Lasers betrugen 20%. Mit dem
Continuum-System wurden keine Experimente mit Mehrfachpulsen durchgeführt.

Material und Methoden 63
Die Puls-zu-Puls-Schwankungen sind bei dem Laser stark von der Justierung
abhängig und liegen zwischen 5 und 10%. Die zeitliche Pulsform zeigt zeitlich bei
beiden Systemen ein Anlaufen weniger longitudinaler Moden, die schwellennah
zu periodischen Leistungsspitzen führen. Für hohe Laserenergien geht das Profil
nahezu in ein zeitlich gaußförmiges Profil über. In ca. 10% der Pulse bleiben
jedoch Leistungsspitzen im Laserpulsverlauf sichtbar. Die Pulsformen sind in
Abbildung 3.6 dargestellt.
Diodensignal [willk. Einh.]
8
6
4
2
Diodensignal [willk. Einh.]
0
0
a)
0 10 20
Zeit [ns]
30
b)
8
6
4
2
0 10 20 30
Zeit [ns]
Abbildung 3.6: Pulsformen der Nd:YAG Laser bei 532 nm a) MBB Laser 16 ns b)
Continuum Laser 6 ns.
3.1.3 Pikosekundenpuls Nd:Ylf Laser
Für die Bestrahlung der Gold-Protein-Konjugate mit Pikosekundenpulsen wurde
das Lasersystem ISL 2001 (ISL Laser, USA), dessen Aufbau in Abbildung 3.7
dargestellt ist, genutzt. Es handelt sich hierbei um ein klinisches Lasersystem,
das für die Versuche modifiziert wurde.

64 Material und Methoden
Oszillator
Faraday Rotator
Auskoppelspiegel
AOM
Photodiode 3
Regenerativer
Modenblende
Verstärker
HR Spiegel
Nd:YLF
Probe
Photodiode 1
Teleskop
Shutter Abschwächer
Photodiode 2
Ethalon
Brewsterfenster
Nd:YLF
l/4 Plättchen
Strahlteiler
Abbildung 3.7: Aufbau des ISL ps Laser Systems.
Pockelszelle
Pumpdiode
HR Spiegel
Der Oszillator ist ein mit 80 Mhz modengekoppelter, diodengpumpter Nd:YLF
Laser, der in TEM00 betrieben wird. Diese Pulse werden über einen Faraday-
Rotator, der eine Rückkopplung der verstärkten Pulse in den Oszillator verhindert,
in einen kontinuierlich bogenlampengepumpten regenerativen Verstärker
mit maximal 1 kHz eingekoppelt. Um den Verstärker in TEM00 zu betreiben,
wurde eine Modenblende in den Verstärker eingebaut. Die Pulse wurden nach
dem Verstärker mit einem Abschwächer, bestehend aus zwei Polarisationswürfeln
und einem λ/2-Plättchen auf die gewünschte Pulsenergie gebracht. Die maximale
Pulsenergie betrug bei einer Repetitionsrate von 1 kHz 600 µJ. Die Pulse wurden
hinter dem Abschwächer mit einem LBO Kristall bei nichtkritische Phasenanpassung
frequenzverdoppelt. Die Pulslänge betrug bei 527 nm 35 ps. 10000 Pulse
mit einer Repititionsrate von 500 Hz und maximaler Laserenergie wiesen 15%
Puls-zu-Puls-Schwankungen auf.

Material und Methoden 65
Pulsenergie [µJ]
300
250
200
150
0
Pulsstatistik nach 1000 Pulsen:
mittlere Pulsenergie 271 µJ
Standardabweichung 13 µJ
0 2000 4000 6000 8000 10000
Zahl der Pulse
Abbildung 3.8: Schwankungen der Pulsenergie während des Betriebs des ps Lasers
bei 532 nm.
3.2 Bestrahlung der Proben
Eine homogene Ausleuchtung der bestrahlten Proben wurde auf 2 Wegen erreicht:
1.) Abbildung einer Faserendfläche einer ausreichend langen Faser, die
bewirkt, dass Intensitätsmodulationen durch Speckle am Faserende unter 5%
reduziert werden und 2.) Nutzung nur des zentralen Bereichs eines Gaußschen
Profils bzw. nur eines kleinen Areals des Strahlprofils, in dem die lokale Variation
ausreichend gering ist. In beiden Fällen ist der Verlust an Laserenergie aufgrund
der Homogenisierung groß.
3.2.1 Homogenisierung durch Fasern
Mikrosekundenpuls-Laser
Zur homogenen Bestrahlung der Mikrometer-Konjugate wurde sowohl für den
Rhodamin 6G Lasers als auch den Ti:Sa Laser eine Bestrahlung durch eine Faser
und eine Abbildung der Faserendfläche auf die Probe gewählt. 5 m Faserlänge
waren ausreichend, um eine Specklemodulationen unterhalb von 5% in Bezug
auf die mittlere Bestrahlung am Faserende zu erhalten. Die Bestrahlung erfolgte

66 Material und Methoden
durch eine Faser mit 600 µm Kerndurchmesser und einer numerischen Apertur
von 0.22. Ein Profil des Ti:Sa Lasers in der Bestrahlungsebene ist in Abbildung
3.9 dargestellt. Es konnten 70% der Laserenergie auf die Probe abgebildet werden.
Dies deckt sich mit den theoretischen Erwartungen, da durch die hohe Divergenz
des Strahls nicht alle Moden in die numerische Apertur der Faser eingekoppelt
werden können.
Intensität [willk. Einh.]
100
80
60
40
20
20 40 60
# der Pixel
80 100
Abbildung 3.9: Räumliche Intensitätsverteilung in der Probenebene, in die das Bestrahlungsfaserende
abgebildet wurde bei Bestrahlung mit dem Ti:Sa.
Nanosekundenpuls-Laser
Eine homogene Bestrahlung der Proben über eine Faser wurde auch für Nanosekundenpulse
der Nd:YAG Laser untersucht. Hierfür wurden eine Faser mit
500 µm Kerndurchmesser und einer Länge von 50 m sowie eine Faser mit 160 µm
Kerndurchmesser und der Länge von 300 m getestet. Die Modulation am Faserende
ist jeweils in Abbildung 3.10 a), b) dargestellt. Aus den Bildern wird
ersichtlich, dass sowohl nach 50 m Faserlänge als auch nach 300 m Länge Modulationen
von über 10% des Bestrahlungsmittelwertes erhalten sind.

Material und Methoden 67
a)
b)
Intensität [willk. Einh.]
Intensität [willk. Einh.]
60
40
20
60
40
20
20 40 60 80 100
# der Pixel
20 40 60 80 100
# der Pixel
Abbildung 3.10: Strahlprofil der Continuum Laserpulse nach Faserhomogenisierung
zusammen mit einem Schnitt durch das Strahlprofil a) Abbildung einer Faserendfläche
einer Faser mit 50 m Länge, 500 µm Kerndurchmesser und einer numerischen Apertur
NA von 0.22; b) Abbildung einer Faserendfläche einer Faser mit 300 m Länge, 160 µm
Kerndurchmesser und einer NA von 0.2.
Die Unterdrückung der Modulationen durch Speckle hinter Fasern ist schwierig,
da aufgrund des schmalen spektralen Verstärkungsprofils von Nd:YAG und der
daraus folgenden hohen Kohärenzlänge lange Fasern nötig sind. Die nötige Länge
wird dabei durch die Numerische Apertur NA, den Brechungsindex der Faser nf
und die Kohärenzlänge des Lasers bestimmt. Eine Abschätzung der Länge, die
zur Unterdrückung der Modulationen nötig ist, kann nach Lange [105] erfolgen.
Abbildung 3.11 zeigt eine logarithmische Auftragung der Standardabweichung der
relativen Intensität bezogen auf den Intensitätsmittelwert σ(I/ Ī), die mit einer
Faser erreicht werden kann, in Abhängigkeit von dem Verhältnis der Faserlänge

68 Material und Methoden
zur Kohärenzlänge des Lasers.
Abbildung 3.11: Auftragung der Faserlänge (NA 0.22, nf=1.4), die benötigt wird,
um eine gewünschte Homogenisierung der Intensitätsmodulationen zu erreichen [105].
Daraus wird deutlich, dass die zur Homogenisierung zu nutzenden Faserlängen
mit steigendem Anspruch an die Homogenität dramatisch ansteigen. Es wären
deshalb Faserlängen im Kilometerbereich notwendig gewesen, um die Nd:YAG
Laserprofile durch Fasern zu homogenisieren.
Zudem begrenzt die Plasmabildung an der Fasereinkoppelfläche die mögliche Homogenisierung
des Strahlprofils durch lange Fasern. Theoretisch liegt die höchste
Plasmabildungsgrenze bei 20 bis 40 J/cm2 [152]. An der Faser mit 160µm Kerndurchmesser
und 300 m Länge war die transmittierte Leistung experimentell auf
10 mJ bei 6 ns Pulsen (ca. 30 J/cm2 ) begrenzt. Der Faserdurchmesser müsste
demnach für eine realistische Handhabung im Labor mehr als 500 µm betragen.
Somit ist eine homogene Bestrahlung der Proben über Fasern mit ns-Q-Switch
Nd:YAG Lasern nur mit einer extrem langen Faser mit großem Kerndurchmesser
möglich.

Material und Methoden 69
3.2.2 Raumfrequenzfilterung des
Nanosekundenpuls Lasers
Da weder eine Homogenisierung durch lange Fasern noch eine Bestrahlung mit einem
Gaußschen Strahlprofil im Fall der Nanosekunden Laser möglich war, wurde
das Strahlprofil durch eine Raumfrequenzfilterung homogenisiert. Der Fokus der
TEM00-Mode ist am kleinsten, so dass durch unterschiedliche Blendengrössen
im Fokus des Raumfrequenzfilters das Strahlprofil bis hin zu einem Gaußschen
Strahlprofil homogenisiert werden kann. Das Verfahren ist durch die Plasmabildung
an der Blende limitiert, da das Plasma selbst stark absorbiert. Der
Continuum Laser hatte aufgrund von Interferenzen von an optischen Komponenten
gestreuter Strahlung ein stark ungleichmäßiges Profil, das in Abbildung
3.12 dargestellt ist. Aufgrund der hohen Leistungen wurde der Strahl mit einer
langbrennweitigen Linse von 800 mm zur Fokussierung und eine Keramikblende
als Filter genutzt. Für eine Brennweite von 800 mm ergibt sich ein Gaußscher
Fokusdurchmesser von 26 µm. Bei diesem Durchmesser bildete sich ab 15 mJ
ein Plasma an der Blende. Eine gute Homogenisierung konnte somit nicht für
hohe Energien erreicht werden. Der Hauptgrund für die Plasmabildung lag in
der schlechten Pointing-Stabilität des Resonators. Wandert der Fokus auf den
Blendenrand, so kommt es aufgrund der hohen Elektronendichte in Festkörpern
sofort zu einer Plasmabildung. Mit einer größeren Blende von 400 µm istdas
Strahlprofil nach der Filterung nicht mehr gaußförmig. Die lokale Homogenität
innerhalb von einem 500 µm Durchmesserareal war aber ausreichend gut, um Proben
zu bestrahlen. Das Strahlprofil, bei dem 120 mJ transmittiert wurden, ist
in Abbildung 3.12 dargestellt. Es besitzt Unregelmäßigkeiten, die ohne scharfe
Intensitätsmodulationen ineinander übergehen. Die Probe lässt sich innerhalb
des Strahls in dem markierten Areal derart positionieren, dass die Modulationen
innerhalb der Probe unter 10% des Mittelwerts der Bestrahlung betragen.

70 Material und Methoden
x [cm]
1mm
y [cm]
a) b)
x [cm]
1mm
y [cm]
Abbildung 3.12: Strahlprofil des Continuum Nd:YAG Lasers a) ohne Raumfrequenzfilter;
b) mit Raumfrequenzfilter und ausreichender Energie (150 mJ). Der Kreis zeigt
die Position und die Grösse der im weiteren mit diesem Strahlprofil bestrahlten Proben
an.
Das Strahlprofil der ns-Laser wurde mit einer CCD-Kamera aufgenommen, da die
Versuche mit Einzelpulsen durchgeführt wurden und entsprechend das räumliche
Profil einzelner Pulse gemessen werden sollte. Die hohe Kohärenzlänge hat dies
wesentlich erschwert, da auf der Kamera aufgrund von Interferenzen mit Streulicht
starke Intensitätsschwankungen vorgetäuscht wurden. Deshalb wurden die
Abschwächer für die Aufnahme des Profils mehrfach verschoben, so dass sich die
Interferenzmuster räumlich änderten und anschliessend eine Mitteilung über die
Bilder erfolgen konnte.
3.2.3 Bestrahlung mit einem TEM00 Laser
Die Bestrahlung der Konjugate mit Pikosekundenpulsen erfolgte direkt mit dem
TEM00 Strahlprofil.

Material und Methoden 71
Bestrahlungsmodulation in Abhängigkeit von der Probengrösse und
-form
Bei der Herstellung der Proben wurden besonders die Probenform, die Probenträgerform
und die Art der Bestrahlung mit dem Ziel berücksichtigt, möglichst
wenig Bestrahlungsmodulationen innerhalb der Proben zu erhalten.
Bestrahlt man eine Probe mit einem Strahl mit gaußschem Strahlprofil, so kann
man für eine homogene Bestrahlung die Probe nur mit der Spitze des Strahlprofils
bestrahlen. Dabei ist der Anteil der Energie, die zur Bestrahlung der Probe zur
Verfügung steht, proportional zu den Modulationen innerhalb der Probe, sofern
keine Interferenzeffekte berücksichtigt werden. Will man die Probe mit einem
Profil bestrahlen, das innerhalb der Probe weniger als 10% von dem Maximalwert
abweicht, so muss man den Strahl so aufweiten, dass sich 90% der Energie
außerhalb der Probe befinden. Dies hat zwei Probleme zur Folge: zum einen
braucht man sehr leistungsstarke Laser, zum anderen ist der Probendurchmesser
immer klein im Verhältnis zum Strahldurchmesser, so dass der Einfluss der durch
die Probenbegrenzung gebildeten Apertur berücksichtigt werden muss.
Betrachtet man eine feste kreisförmige Apertur mit dem Radius a, sokönnen die
dadurch hervorgerufenen Modulationen über das Huygens’sche Beugungsintegral
nach [177] in einem zylindrischen Koordinatensystem in der durch z = 0 gegebenen
Ebene berechnet werden. Bei Beleuchtung dieser Blende mit einer beliebigen
aber rotationssymmetrischen Quellfunktion A0(r0) wird in paraxialer Näherung
die komplexe Amplitude A(r, N) hinter der Apertur durch das Huygens’sche Integral
A(r, N)=i2πNe −iπN(r/a)2
� 1
0
−iπN(r0/a) 2
r0A0(r0)e
J0
a
� 2πNrr0
a 2
�
d
� �
r0
a
(3.1)
angegeben, wobei
N = a2
(3.2)
zλ
die Fresnel-Zahl (mit z der axialen Entfernung von der Blende, λ der Wellenlänge)
und J0 die Bessel-Funktion nullter Ordnung ist. Für eine ebene Welle (A0 ≡ 1)
läßt sich dieses Integral relativ einfach numerisch lösen. Es ergibt sich in radialer
Richtung eine mit sinkendem Abstand zur Apertur immer kleinräumiger
werdende, jedoch in ihrer Amplitude nicht abnehmende zentrale Oszillation der

72 Material und Methoden
Bestrahlungsstärke. Auf der optischen Achse variiert die Intensität des gebeugten
Lichtes zwischen Null und einer vierfachen Überhöhung der ursprünglichen
Intensität. Die Anzahl der Modulationen innerhalb einer Blende entspricht der
Fresnel-Zahl.
Wird der zentrale Bereich eines gaußförmigen TEM00-Intensitätsprofils durch
eine solche Apertur aus dem Laserstrahl herausgeschnitten, um eine homogene
Bestrahlung zu erhalten, so ist mit Intensitätsmodulationen im Bereich von
einem Faktor 4 zu rechnen, da der die Apertur durchlaufende Teilstrahl im wesentlichen
als ebene Welle anzusehen ist. Für eine Geometrie, in der die Blende
einen Durchmesser von ca. 500 µm besitzt, man mit grünem Licht einstrahlt und
die Probe ca. 100 µm hoch ist, werden die Fresnel-Zahlen grösser als 1000. Die
Modulationen bekommen schon 10 µm hinter der Blende eine Ausdehnung, die
mit 40 nm grösser ist als die Partikel, die im Rahmen dieser Arbeit untersucht
werden. Auch Blenden, die nur die Phase und nicht die Amplitude verändern,
können zu Intensitätsmodulationen führen.
Entlang der Strahlachse wurden deswegen nur Blenden mit einem Durchmesser
von über 15 mm eingebaut und eine möglichst gute Anpassung des Brechungsindex
der Probenträger nGlas =1.5an den Brechungsindex der Proben
nW asser =1.33 durchgeführt.
Als wichtige Restmodulation bleibt die Interferenz der Teilreflektion von 3%
an dem Wasser-Luft-Übergang mit dem einfallenden Strahl. Die durch diesen
Rückreflex hervorgerufenen Modulationen innerhalb der Probe lassen sich experimentell
nicht mit vertretbarem Aufwand verhindern. Eine Restmodulation
durch Beugungs- und Interferenzeffekte von unter 10% bei Bestrahlung wurde
damit in Kauf genommen.
Das Strahlprofil wurde mit mehreren Methoden vermessen. Als schnellste aber
auch ungenaueste Methode wurde das Strahlprofil über eine Mattscheibe auf eine
CCD-Kamera abgebildet und mit einem Strahlanalysesystem (Spiricon, USA)
analysiert. Diese Bilder ließen keine genauen Aussagen über die Halbwertsbreite
des Laserstrahls zu. Deshalb wurde das Strahlprofil mit einer Rasierklinge
vermessen. Hierfür wurde die Klinge mit einem Verschiebetisch mit Mikrometerauflösung
durch den Strahl gefahren und die Pulsenergie hinter der Klinge in
Abhängigkeit ihrer Position gemessen. An die so erhaltenen Meßdaten wurde das
Integral einer Gaußschen Fehlerfunktion angepaßt, aus der dann die Halbwerts-

Material und Methoden 73
breite des Strahls abgeleitet werden konnte. Diese Methode eignete sich sehr gut,
um den Strahldurchmesser zu bestimmen. Sie ist allerdings nicht eindeutig, wenn
es darum geht, genaue Aussagen über das Strahlprofil zu machen, da über einen
Schnitt durch den Strahl integriert wurde. Als dritte Methode wurde der Strahl
längs mehrerer Achsen durch das Strahlmaximum mit einer 20 µm großen Blende
vermessen. Auch hier wurde die Blende mit einem Verschiebetisch entlang
dieser Achsen durch den Strahl gefahren. Das Strahlprofil ist zusammen mit der
berechneten Pulsform in Abbildung 3.13 dargestellt.
normiertes Diodensignal
1.0 1.0
normiertes Diodensignal
0.8 0.8
70%
0.6 0.6
0.4 0.4
2mm
0.2 0.2
0
0 1 2 3 4 5
0
0 1 2 3 4 5
x [mm] y [mm]
Abbildung 3.13: Strahlprofil des ps-Lasers in der Objektebene zur Probenbestrahlung
in x- und y-Schnittebene.
Scannende Bestrahlung
Eine weitere Möglichkeit zur Bestrahlung der Proben mit limitierter Laserenergie
besteht darin die Proben abzuscannen. Die dadurch entstehenden Inhomogenitäten
wirken sich wie in Abbildung 3.14 dargestellt je nach Schadensmechanismus
auf eine Proteininaktivierung aus.

74 Material und Methoden
�
[mJ/cm²]
�
[mJ/cm²]
a) b)
c)
integrale Bestrahlung thermischer Schaden
x[m]
x[m]
y[m]
y[m]
Abbildung 3.14: Einfluß einer scannenden Bestrahlung auf den induzierten Schaden
in Abhängigkeit vom Schadensmechanismus. a) Bestrahlung B im Strahlprofil mit aufgeweitetem
Strahl; b) Induzierter thermischer Schaden Ω an Phosphatase nach einer
Bestrahlung mit aufgeweitetem Strahl; c) Bestrahlung B nach scannender Bestrahlung;
d) Induzierter thermischer Schaden Ω an Phosphatase nach einer Bestrahlung
mit scannender Bestrahlung.
In Abbildung 3.14 a) ist homogen Bestrahlung einer Probe mit der Spitze eines
gaußschen Strahls der zusammen mit b) der erwarteten Inaktivierung nach
der Arrheniuskinetik von alkalischer Phophatase dargestellt (Parameter: siehe
Abschnitt 4.2.1). Die in der Bestrahlung minimalen Modulationen machen sich
schon in nicht zu vernachlässigender Weise bemerkbar. In Abbildung 3.14 c),
d) ist die integrale Bestrahlung nach scannender Bestrahlung und die erwartete
Inaktivierung infolge der dieser Bestrahlung für einen thermischen Schaden nach
der Arrheniusgleichung von alkalischer Phosphatase dargestellt. Das Scanmuster
und der Strahldurchmesser wurden derart gewählt, dass sich die überlappenden
Bestrahlungsfelder zu einer nahezu homogenen Gesamtbestrahlung der Proben
an jedem Ort aufsummiert haben (Abbildung 3.15).
�
�
d)
x[m]
x[m]
y[m]
y[m]

Material und Methoden 75
normierte Bestrahlung
1
0.8
0.6
0.4
0.2
B
[mJ/cm²]
0
-0.001
-1.5 -1 -0.5 0.5 1 1.5
x [mm]
a) b)
2
1.5
1
0.5
-0.0005
x[m]
0
0.0005
-0.001
0.001
Abbildung 3.15: Muster der scannenden Bestrahlung zur Untersuchung der aP-
Goldkonjugate. a) Überlappung der einzelnen Strahlprofile miteinander; Die Probentöpfchen
mit 2 mm Durchmesser sind eingezeichnet; b) Summe der Energien (Gesamtbestrahlung)
in einem Probentöpfchen mit 2 mm Durchmesser.
Je nach Schadensmechanismus wirkt sich die scannende Bestrahlung unterschiedlich
auf die Inaktivierung der Proteine aus. Bei einem stark von der Laserleistung
abhängigen Effekt wie dem thermischen Schaden kommt es zu einer geringeren
Inaktivierung als bei einem rein von der Bestrahlung abhängigen Schadensmechanismus
wie z.B. Einphotonen-Photochemie. Dieser geringer ausfallende Schaden
bewirkt ein Abflachen der Inaktiveirung in Abhängigkeit von der Bestrahlung.
Der Schaden lässt sich bei bekanntem Strahlprofil jedoch gut berechnen.
Eine scannende Bestrahlung ist damit bei limitierter Laserenergie eine gute Möglichkeit,
um große Probenvolumen zu untersuchen.
3.2.4 Bestrahlung der Mikroabsorber-Konjugate
Bestrahlung der Polystyren-Magnetit-Konjugate
Zur Bestrahlung der Polystyren-Magnetit-Konjugate mit alkalischer Phosphatase
(aP-PM-Konjugate) wurde der Rhodamin 6G Laser genutzt. Die Proben wurden
in transparenten Greiner 1536 Well Platten mit 4 µl Volumen und einer quadratischen
Grundfläche mit 1.5 mm Kantenlänge hergestellt. Die Konzentration der
Partikel wurde so eingestellt, dass der Boden der Töpfchen zu 3/4 bedeckt war.
0
-0.0005
0.0005
0.001
y[m]

76 Material und Methoden
Dies ist bei ca. 70000 Absorbern der Fall, da die Absorber schnell sedimentieren.
Die Proben wurden durch den Plattenboden bestrahlt. Hierfür ist das Ende der
zur Homogenisierung genutzten 600 µm Kerndurchmesser- Faser mit einer 40 mm
Plankonvexlinse auf den Plattenboden abgebildet worden. Der Bilddurchmesser
betrug 2 mm.
Bestrahlung der Silika-Magnetit-Konjugate
Die Phosphatase- und die Chymotrypsinkonjugate mit Silika-Magnetitpartikeln
(aP-SM-Konjugate, chymo-SM-Konjugate) wurden in den 18 Loch Bestrahlungsplatten
aus Glas (siehe Abschnitt 3.4.3) mit einem Probendurchmesser von 2 mm
bestrahlt. Die Partikelkonzentration wurde wieder entsprechend der Bodenbelegung
gewählt. Der Experimentablauf war äquivalent zu den Experimenten mit
Kunstoffpartikeln. Als Bestrahlungslaser wurde der Ti:Sa mit 15 µs Pulsdauer
genutzt. Die Proben wurden über die gleiche Faser und Abbildungslinse, die
auch für die Kunstoffpartikel genutzt wurde, bestrahlt. Die Bestrahlung der
chymo-SM-Konjugate mit hohen Bestrahlungsstärken über 2 J/cm2 ist in Mikroglas
Lochplatten (siehe Abschnitt 3.4.3) mit einem Probendurchmesser von
1.2 mm erfolgt. Die Abbildung des Faserendes wurde, um die hohen Bestrahlungen
zu erreichen, angepasst und die Bildgröße hatte einen Durchmesser von
1.5 mm.
3.2.5 Bestrahlung der Goldkonjugate
Bestrahlung der Goldkonjugate mit Nanosekundenpulsen
Die Gold-Enzymkonjugate wurden als Tröpfchen mit einem Durchmesser von
500 µm auf Objektträger aufgebracht.

Material und Methoden 77
Glas
Laser
Probentropfen
Abbildung 3.16: Probentropfen der Enzym-Goldkonjugate und BSA im Puffer
enthält auf einer Glasplatte, wie sie als Proben für die Bestrahlung mit Nanosekundenpulsen
eingesetzt wurden.
Die gesamte Handhabung der tropfenförmigen Proben und der dazugehörige Detektionsaufbau
sind in Abschnitt 3.4.1 beschrieben. Der nötige Strahldurchmesser
in der Probenebene bei Bestrahlung mit dem MBB Laser und damit der Homogenität
der Probenbestrahlung wurde gewählt, indem der Strahl bei maximaler
Pulsenergie aufgeweitet wurde, um ihn anschließend so weit zu fokussieren, bis
mit einem Puls ein Effekt von über 50% Inaktivierung der Proteine zu verzeichnen
war. Mit dem MBB Laser wurden sowohl alkalische Phosphatase-Goldkonjugate
als auch Chymotrypsin-Goldkonjugate untersucht. Die Probentropfen wurden im
Fall einer Mehrfachbestrahlung mit dem MBB Laser mit 10 Hz bestrahlt. Der
Probentropfen wurde auf dem Maximum des gaußähnlichen Strahlprofils positioniert,
indem der erste Tropfen des Rasters manuell auf den Pilotstrahl und
anschließend auf den Q-Switchstrahl positioniert wurde. Als Maß hat die Linsenwirkung
des Tropfens gedient. Der vergrößerte Bestrahlungsfleck wurde zentrisch
auf den Strahl ohne Tropfen justiert. Behilflich waren zudem konzentrische Interferenzringe.
Die Positionierung der restlichen Proben erfolgte automatisch und
wurde anhand der Strahlablenkung durch die Linsen kontrolliert. In Abbildung
3.17 ist das Strahlprofil dargestellt, mit dem eine Inaktivierung der Proben gemessen
werden konnte. Die Bestrahlung am Rand der Proben betrug nur noch
45% der maximalen Bestrahlung im Zentrum. Außerdem ist das Strahlprofil des
Continuum Lasers mit dem Probentropfen. In der Abbildung wird deutlich, dass
die Bestrahlung in der Probe maximal um 10% um den Mittelwert geschwankt
hat.

78 Material und Methoden
Bestrahlung [willk. Einh.]
1
0.8
0.6
0.4
0.2
0
1
Probentropfen
Bestrahlung [willk. Einh.]
1
0.8
0.6
0.4
0.2
Probentropfen
0
0.5 0 0.5 1 -0.3 -0.2 -0.1 0 0.1 0.2 0.3
r [mm] r [cm]
Abbildung 3.17: a) gaußähnliches Strahlprofil des MBB Lasers, das zur inhomogenen
Bestrahlung der Goldkonjugate eingesetzt wurde; b) mit einer Raumfrequenzfilterung
homogenisiertes Strahlprofil des Continuum Lasers, das zur bestrahlung der chymo-Au
Konjugate eingesetzt wurde.
Die Positionierung der Proben im Strahl des Continuum Nd:YAG mit 5 mm
Strahldurchmesser konnte nicht anhand des Beugungsmusters von dem Tropfen
erfolgen. In diesem Fall ist die Positionierung erfolgt, indem eine Videokamera
fest über der Klimakammer eingebaut wurde, mit der die Strahllage festgestellt
und anschließend die Tropfenlage einjustiert werden konnte. Eine direkte Kontrolle
während der Bestrahlung war aufgrund der hohen Energien nicht möglich.
Einen Hinweis auf eine gute Positionierung bei hohen Energien haben die Plasmen
gegeben, die sich über den Tropfen gebildet haben.
Bestrahlung der Goldkonjugate mit Pikosekundenpulsen
Die Bestrahlung der Gold-Konjugate mit ps-Pulsen ist in den ersten Versuchen
in Glas Mikrotiterplatten mit einem Probendurchmesser von 2 mm mit einem
aufgeweiteten Strahl erfolgt, der in Abbildung 3.13 zusammen mit dem Probendurchmesser
dargestellt ist.
Die weitere Bestrahlung der alkalische Phosphatase -Goldkonjugate mit ps-Pulsen
ist mit der scannenden Bestrahlung mit 16 Feldern erfolgt (siehe Abbildung 3.15).
Die Bestrahlung der Chymotrypsin-Goldkonjugate erfolgte ebenfalls mit der scannenden
Bestrahlung. Aufgrund eines Verdopplerkristallschadens wurden die Versuche
mit einem weniger effizienten Verdopplerkristall durchgeführt, so dass aufgrund
der weiter limitierten Energie 36 anstatt 16 Positionen (Abbildung 3.18)

Material und Methoden 79
angefahren wurden. Das Bestrahlungsraster wurde wie in den vorhergehenden
Versuchen so ausgelegt, dass eine Überlappung der Positionen zu einer homogenen
Gesamtbestrahlung führte.
normierte Bestrahlung
1
0.8
0.6
0.4
0.2
B
[mJ/cm²]
-1.5 -1 -0.5 0.5 1 1.5
a)
x [mm]
b)
Abbildung 3.18: Muster der scannenden Bestrahlung zur Untersuchung der chymo-
Goldkonjugate. a) Überlappung der einzelnen Strahlprofile miteinander; Die Probentöpfchen
mit 2 mm Durchmesser sind eingezeichnet; b) Summe der Energien (Gesamtbestrahlung)
in einem Probentöpfchen mit 2 mm Durchmesser.
Die Bestrahlung und Auswertung von Enzym-Antikörper-Goldkonjugaten ist analog
zu der Bestrahlung von Chymotrypsin-Goldkonjugaten erfolgt.
3.3 Zusammenfassung der
Bestrahlungsparameter
Die Versuchsbedinungen, unter denen die Versuchreihen zur Untersuchung der
Protein-Denaturierung durch laserinduzierte Temperatursprünge an Absorbern
durchgeführt wurden, sind in der folgenden Tabelle zur Übersicht zusammengefaßt.
x [m]
y [m]

80 Material und Methoden
τlaser Partikel Laser Probenträger Strahlprofil
6 µs 2.8 µm PM R6G 600 nm Kunststoff Faserabbildung
15 µs >8 µm SM Ti:Sa 800 nm Glas/Foturan Faserabbildung
16 ns 15 nm Gold MBB 532 nm Tropfen Multim.-Gauß
6ns 15 nm Gold Conti. 532 nm Tropfen Raumfrequenzfilter
35 ps 15 nm Gold ISL 527 nm Glas Gauß-scannend
Tabelle 3.2: Zusammenfassung der Bestrahlungsparameter, die für die Bestrahlung
der unterschiedlichen Enzym-Partikel-Konjugate eingesetzt wurden.

Material und Methoden 81
3.4 Aufbau zur Probenherstellung und
Bestrahlung
3.4.1 Nanoliterproben
Die ersten Experimente zur Denaturierung von Protein-Absorberkonjugaten hatten
gezeigt, dass eine Inaktivierung mit einer homogenen Bestrahlung von Proben
mit einem Durchmesser im Millimeterbereich mit den zur Verfügung stehenden
Lasern nicht zufriedenstellend möglich ist. Deshalb wurde ein Aufbau
entwickelt, mit dem eine größere Anzahl von Proben mit einem Durchmesser im
Bereich von wenigen 100 µm bestrahlt werden kann. Nach der Bestrahlung kann
im gleichen Aufbau die Proteinaktivität über Fluoreszenz-/ Chemolumineszenzmessungen
bestimmt werden. Die Miniaturisierung der Proben und die damit
verbundenen technischen Herausforderungen und deren Lösungen werden im Folgenden
besprochen und diskutiert. Die Anforderungen an die Plattform waren:
• Handhabung kleiner Flüssigkeitsmengen im pl- bis nl-Bereich
• Verhinderung von Verdunstung und Kondensation
• Optische Zugänglichkeit der Proben für die Bestrahlung, eine Beobachtung
der Proben während der Bestrahlung und eine mikroskopische Fluoreszenzund
Chemolumineszenz-Analyse der Proben nach der Bestrahlung.
Das Konzept des Aufbaus bestand darin, die Proben auf einfache optisch transparente
Träger als kleine Probentröpfchen aufzutragen. Die Probentröpfchen
mit einem Durchmesser im Bereich von wenigen 100 µm wurden in einer Klimakammer
erstellt und stabilisiert, da sie unter Raumluftbedingungen innerhalb
von wenigen Sekunden verdunsten würden. Als Träger wurden einfache Objektträger
aus der Mikroskopie oder Vergleichbares genommen. Dieser Ansatz wurde
verfolgt, da auf diese Weise keine Festlegung auf eine Probengröße durch einen
strukturierten Probenträger wie z. B. Lochplatten nötig war. Außerdem konnten
Platten gewählt werden, die sehr gute optische Qualität besitzten, so dass sie
hohe Bestrahlungsstärken aushalten und im Vergleich zu strukturierten Platten
kostengünstig sind. Der Probenhalter sollte so variabel gehalten werden, dass

82 Material und Methoden
außer Objekträgern auch strukturierte Träger wie 96 bis 1536 Well-Platten und
eine Druckkammer als Probenträger genutzt werden konnten.
In Vorversuchen wurde experimentell untersucht, wie sich die einzelnen Anforderungen
an die Bestrahlungs- und Detektionseinheit technisch umsetzen lassen.
Die Experimente dienten somit als Grundlage für den endgültigen Aufbau einer
Plattform zur Bestrahlung der Proben.
Klimakammer
Ziel beim Bau einer Klimakammer war es, diese schnell auf annähernd 100%
relative Feuchtigkeit einzustellen. Eine Luftfeuchte von ≥ 99% r. F. ist nötig, um
die geringen Probenmengen zu bestrahlen und über mehr als 30 min auswerten zu
können. Ein schnelles Erreichen der Luftfeuchte ist nötig, um die Klimakammer
zwischen den Messungen öffnen zu können, ohne dass sich danach eine lange
Wartezeit während des Wiederbefeuchtens ergibt. Aus diesem Grund sollte die
Klimakammer in weniger als 10 min mindestens 90% r. F. erreichen.
Zur schnellen Anfeuchtung der Luft in der Klimakammer wurden drei Verfahren
getestet: 1.) Anfeuchten über thermisch beschleunigte Verdampfung, 2.) Anfeuchten
über Vernebler und 3.) Anfeuchten über erhöhte Verwirbelung der Luft
in der Klimakammer.
Dem ersten Ansatz folgend wurde in einer geschlossenen Klimakammer ein Wassereservoir
dicht neben dem Probenträger auf bis zu 10◦Chöherer Temperatur im
Vergleich zur Probenträgertemperatur erwärmt. Nur mit einem hohen Temperaturgradienten
(∆T >10 K) zwischen Wasserbad und Objektträger ist es möglich,
die Klimakammer in weniger als 10 min auf über 90 % r. F. zu bringen. Durch den
hohen Temperaturgradienten kommt es schon nach kurzer Zeit zur Bildung von
Tropfen in der Luft, die als Kondensationstropfen auf dem Probenträger ausfallen.
Die Tropfengröße dieser Kondensationstropfen beträgt bis zu 100 µm.
Dem zweiten Ansatz folgend wurde Luft aus einem Ultraschallvernebler über
einen 2 m langen Schlauch und eine Kondensationsfalle bei Raumtemperatur in
die Kammer geleitet. Es zeigte sich jedoch, dass die Nebeltropfen, die sich um
Kondensationskeime herum bilden, nicht mehr verdunsten und als Kondensationstropfen
auf den Probenträger ausfallen. Zur Vermeidung von ungewollter
Kondensation konnte entsprechend nur der dritte Ansatz gewählt werden, in dem

Material und Methoden 83
durch eine Verwirbelung der Luft über einem Wasserreservoir innerhalb der Klimakammer
der Temperaturgradient minimiert und der maximale Luftfeuchtegradient
über dem Wasserbad aufrecht erhalten wird, so dass das Wasser so schnell
wie möglich verdunstet. Die Konstruktion der Klimakammer erfolgte so, dass
Temperaturgradienten vermieden wurden. Die Kammer wurde so kompakt wie
möglich und aus gut wärmeleitenden Materialen hergestellt. Ein Ventilator mit
einem möglichst geringen Druckunterschied wurde genutzt, um keine Kondensation
durch Druckunterschiede zu erzeugen. Die Abbildung 3.19 zeigt, dass mit
einer Klimakammer, die diesem Konzept folgt, ein um den Faktor 5.5 schnelleres
Anfeuchten der Luft im Vergleich zu reiner Verdunstung möglich ist.
relative Feuchte [%]
100
90
80
70
60
50
40
30
Klimakammer mit Verwirbelung
t = 530 s
90% t = 1775 s
90%
Klimakammer ohne Verwirbelung
0 500 1000 1500 2000 2500
Abbildung 3.19: Vergleich des Feuchtanstiegs in der Klimakammer (siehe 3.20) mit
und ohne Verwirbelung der Luft.
Mit dem zuletzt beschriebenen Ansatz ist es möglich, die Klimakammer innerhalb
von3.5minauf90%r.F.zubringen. Diefür die Bestrahlungsexperimente genutzte
Klimakammer ist in Abbildung 3.20 dargestellt. Der Probenträger ist umgeben
von einem Wasserbecken, dessen Niveau oberhalb vom Probenniveau liegt.
Die Luftströmung wird direkt über ein die Proben umgebendes Wasserreservoir
geleitet, so dass nur frisch mit Wasser angereicherte Luft zu den Proben gelan-
t[s]

84 Material und Methoden
gen kann. Die Dichtung zwischen den einzelnen Komponenten erfolgt mit Hilfe
von Wasserfilmen, die sich durch die Oberflächenspannung in die Dichtespalten
ziehen. Das Material der Halterung und des Wasserbeckens ist Aluminium. Der
Deckel besteht aus Plexiglas. In den Deckel eingelassen ist der Dispensierkopf zur
Probenherstellung und ein kombinierter Temperatur- und Luftfeuchtemeßkopf.
Wassereservoir Probenträgerhalterung
Detektion Bestrahlung Grundplatte
Anschlüsse für Umluft
& Versorgungsspannung
Wasserbecken
Abbildung 3.20: Aufbau der Klimakammer zur Stabilisierung der Tropfen a) Aufsicht
b) Skizze der Luftströmung.
Tropfenlebensdauer Die Verdunstung bzw. Kondensation innerhalb der Klimakammer
wurde anhand der Probenlebensdauern in Abhängigkeit von der Luftfeuchte
und des Probenvolumens untersucht. Die Experimente wurden mit einem
inversen Mikroskop, auf dem die Klimakammer stand, durchgeführt. Der Verdampfungsverlauf
eines 5 nl Tropfens in normaler Atmosphäre zeigt, dass dieses
Probevolumen (ca. 40 % r. F. ) innerhalb von 2 min verdampft (Abb. 3.21). Es
zeigt sich, dass der Volumenverlust des Tropfens in Aufsicht nur relativ ungenau
zu messen ist, da der Tropfendurchmesser nicht proportional zum Volumen abnimmt.
Für die Experimente zur Tropfenlebenszeit wurde deshalb die komplette
Verdampfung des Tropfenvolumens als Kriterium gewählt.
Y
X

Material und Methoden 85
500µm
Abbildung 3.21: Verdampfungsverlauf eines 5 nl Tropfens mit einem Bildabstand von
20 s bei Raumluftbedingungen.
Die Abbildung 3.22 zeigt die Tropfenlebensdauer eines 100 pl-Tropfens in Abhängigkeit
von der relativen Luftfeuchte.
Tropfenlebensdauer [s]
4000
3000
2000
1000
0
86 88 90 92 94 96 98 100
relative Feuchte [%]
Abbildung 3.22: Tropfenlebensdauer in Abhängigkeit der relativen Luftfeuchte.
Für eine Probenlebensdauer von über 30 min benötigt man Luftfeuchtigkeiten von
über 99% r. F. Für eine 1.5 nl Probe bei 99 % r. F. ergibt sich eine vollständige
Verdampfung nach 8.6 Stunden. Das entspricht einer Verdampfungsrate von
3pl/min. Während des Bestrahlungszyklus’ von ca. 30 min muss man demnach
mit einer Verdampfung um 6 % rechnen, selbst wenn die Luftfeuchtigkeit über
99% r.F. beträgt. Ein Einfluss der Verdampfung auf den pH-Wert der Proben

86 Material und Methoden
in diesem Volumenbereich für die genutzten Puffer (PBS) wurde ausgeschlossen,
indem in 5 ml Proben ein Teil des Wasser verdampft und nach der Abkühlung der
pH-Wert des Puffers bestimmt wurde. Dieser war vor und nach Verdampfen des
Puffers bis zu einem Volumen von 20% gleich. Die beobachtete Teilverdampfung
der Probentropfen hat somit keinen Einfluss auf die Enzym-Absorberkonjugate.
Trotz einer Verdampfung der Probentropfen über den langen Zeitraum von mehreren
Stunden wurde auf dem Probenträger auch eine Tröpfchenbildung um die
Proben bei der Luftfeuchte von nahe 100 % r. F. beobachtet. Dies wird in Abbildung
3.23 deutlich, die eine 100 pl Probe nach 30 min bei ca. 100% r. F. zeigt.
100 µm
Abbildung 3.23: Kondensation um eine 100 pl Probe bei ca. 100% r.F. und einer
Klimakammeranfeuchtung ohne Temperaturgradient.
Aus der Abbildung wird ersichtlich, dass die Kondensation keinen Einfluss auf
die Probe hat, wenn man bedenkt, dass das Probenvolumen in der Abbildung
noch ca. 15 mal kleiner als die bestrahlten Probenmengen im Nanoliterbereich
ist. Des weiteren wird ersichtlich, dass das Kondensat keinen Kontakt zur Probe
hat und diese somit nicht verändert.
Für den endgültigen Aufbau wurde die Anreicherung der Luft mit Wasser durch
reine Diffusion gewählt, wobei die Proben und die Probenkammer auf der gleichen
Temperatur bleiben. Dies hat den Vorteil, dass keine Regelung nötig ist,
um die 100 % r. F. einzustellen. Durch eine Verwirbelung der Luft kann die Zeit
bis zum Erreichen ausreichender Luftfeuchte auf 2.5 min begrenzt werden, was
für den Laborgebrauch akzeptabel ist. Ein prinzipielles Problem bei einer aktiven
Verwirbelung besteht in undichten Stellen. Ist in dem System ein Loch, so

Material und Methoden 87
kommt es durch die Positionierung der Klimakammer gegenüber dem Deckel und
durch die Verwirbelung zu einem sehr schnellen Abfall der Luftfeuchte, der nicht
nachreguliert werden kann. Die Verwirbelung wurde nach Erreichen der 100 %
r. F. deswegen auf ein Minimum reduziert. Die Tröpfchenbildung um den Probentropfen
auch bei einer langsamen Verdunstung der Probe scheint eine prinzipielle
Limitierung der Probenlebensdauer durch Umverteilungsprozesse innerhalb der
Probenkammer darzustellen. Vorstellbar ist, dass die Probentropfen zugunsten
des Wasserreservoirs aufgrund der Erhöhung des Dampfdrucks durch die Oberflächenspannung
verdunsten. Kleine Tröpfchen bilden sich dagegen kontinuierlich
durch entropische Umverteilungsprozesse, die auf einen homogenen Wasserfilm in
der gesamten Kammer hin zielen. Die notwendige Kondensation und die Oberflächenspannung
führen jedoch nicht zur Bildung eines Films, sondern zur Bildung
der kleinen Tröpfchen, die groß genug sind, dass sie nicht sofort zugunsten des
Reservoirs verdunsten.
Berücksichtigt werden muss außerdem, dass sich der Dampfdruck in den Proben
durch z.B. durch gelöste Salze oder Proteine verändert. Salze setzen generell
den Dampfdruck herab [1], so dass z. B. über einer 5 M KCl Lösung eine relative
Feuchte von nur 70 % herrscht. Je nach Probengröße muss dies bei der Zusammensetzung
des Flüssigkeitsreservoirs berücksichtigt werden.
Probenträger
Eine Bestrahlung der Proben kann nur durch den Probenträger erfolgen, da der
Probentropfen eine starke Linsenwirkung hat, die bei Bestrahlung von oben zu
einer ungleichmäßigen Bestrahlung führt. Der Krümmungsradius des Tropfens
wird vom Probenträgermaterial und der Oberflächenspannung der Probenlösung
bestimmt. Für eine homogene Bestrahlung der Proben durch den Probenträger
muss der Kontaktwinkel der Probe kleiner als der Totalreflexionswinkel sein. Ansonsten
kommt es durch Totalreflexion an der Grenzfläche Tropfen-Luft zu einer
Intensitätsüberhöhung in der äußeren Tropfenschale. Dies ist in Abbildung 3.24
dargestellt.

88 Material und Methoden
r
x
a b
Abbildung 3.24: Totalreflexion innerhalb von Proben führt zu inhomogener Bestrahlung,
wenn der Kontaktwinkel mit dem Probenträger zu groß ist. a) Oberhalb des Totalreflexionswinkels
werden die äußeren Probenanteile stärker bestrahlt als die zentralen;
b) homogen bestrahlte Probe mit einem Kontaktwinkel unterhalb des Totalreflexionswinkels,
der an der Grenzfläche Wasser-Luft 49 ◦ beträgt.
Um solch eine Totalreflexion zu vermeiden, wurden unterschiedliche Oberflächen
für die Probenträger getestet. Als erstes wurde mit Chromschwefelsäure, Ethanol
und Bidest gereinigtes Glas (Bk7) untersucht. Nach diesen Untersuchungen
konnte festgestellt werden, dass der Kontaktwinkel unterhalb vom Totalreflexionswinkel
liegt, die Reinigung aber unerlässlich ist, da sonst die Verunreinigungen
die Probenform bestimmen. Das gleiche konnte für Deckgläser aus Borosilikatglas
(Karl Hecht KG, Assistent, Deutschland) beobachtet werden. Die Abbildung 3.25
zeigt den Kontaktwinkel für verschiedene Probenvolumina auf einem Deckglas.

Material und Methoden 89
Abbildung 3.25: Kontaktwinkel und Kontaktdurchmesser der Probentropfen bei den
Probenvolumina 1.65 nl (50 Tropfen), 3.3 nl (100 Tropfen), 4.95 nl (150 Tropfen) und
6.6 nl (200 Tropfen).
Der Kontaktwinkel liegt unabhängig vom Probenvolumen knapp unterhalb des
Totalreflexionswinkels von 49◦ . Bei Verschmutzung der Oberfläche können aber
auch höhere Winkel auftreten. Da einfache Objekträger aus Glas meist nicht sehr
sauber sind, wurden zusätzlich gewaschene und beschichtete Gläser getestet. Bei
den Objektträgern (Super Frost Plus, MENZEL-Gläser, Deutschland) wurde der
gleiche Kontaktwinkel wie bei gereinigtem Bk7 beobachtet. Desweiteren zeigte
sich bei neuen, sauberen Probenträgern eine scharfe Tropfenabgrenzung und
eine reproduzierbare Probenherstellung. Um eine Totalreflexion innerhalb des
Tropfens auf diesen Objektträgern auszuschließen, wurden in einem zusätzlichen
Experiment die Tropfen senkrecht zur Probengrundfläche mit einem parallelen
Laserstrahl beleuchtet. Bei den Probenträgern, bei denen der Probenkontaktwinkel
größer als der Totalreflexionswinkel war, konnte eine deutliche Rückreflexion
des Lasers durch die Totalreflexion beobachtet werden. Bei dem verwendeten
Super Frost Plus Objektträger war dies nicht der Fall.
Die Abbildung 3.26 zeigt den Probendurchmesser und die Probenhöhe für verschiede
Probenvolumina auf den Super Frost Plus Objektträgern. Die Probenvolumina
sind als Vielfaches der Dispensertröpfchen (Volumen=33 pl) angegeben.

90 Material und Methoden
Durchmesser bzw. Höhe [µm]
1000
800
600
400
200
0
Kontaktdurchmesser
Tropfenhöhe
0 100 200 300
Tropfenanzahl
Abbildung 3.26: Kontaktdurchmesser und Probenhöhe in Abhängigkeit vom Probenvolumen.
Für eine vorgegebene Probenkontaktfläche von 500 µm ergibt sich auf dem verwendeten
Objektträger eine Tropfenzahl von 50 Tropfen, die einem Probenvolumen
von 1.675 nl entspricht. Der gewählte Super Frost Plus Objektträger wurde
nach einer Bestrahlung mit 0.5 GW/cm2 mikroskopisch untersucht, ohne dass
Veränderungen festgestellt werden konnten.
Probendispenser
Als Probendispenser wurden piezogetriebene Pipettierköpfe (Microdrop GmbH,
Deutschland) genutzt. Das Einzeltropfenvolumen hängt von der Düse des jeweiligen
Kopfes ab und betrug 33 pl bei einem Kopf mit einer 40 µm-Düse und
268 pl bei einem Kopf mit einer 80 µm-Düse. Das gewünschte Probenvolumen
kann durch Pipettieren einer bestimmten Anzahl von Tropfen hergestellt werden.
Für die Herstellung von reproduzierbaren Proben aus unterschiedlichen Komponenten
ist es entscheidend, dass sich die Dispensertropfen gut mit der schon

Material und Methoden 91
vorhandenen Probe durchmischen, da die Diffusionsprozesse von Molekülen in
Wasser mit Diffusionskonstanten im Bereich von 1.29 10 −5 cm 2 /s so langsam sind
[112], dass selbst in wenige 100 µm großen Proben die Diffusion ein zeitlich begrenzender
Faktor wird. In Hinblick auf die Trennung der Probentropfen untereinander
auf dem Probenträger darf es beim Pipettieren von Dispensertropfen
nicht zu Spritzern kommen. Sowohl die Probendurchmischung als auch ein Spritzen
der Proben während des Pipettierens wurde untersucht. Die Durchmischung
der Probentropfen wurde überprüft, indem 50 Tropfen Fluoresceinlösung dispensiert
und anschließend 250 Tropfen Wasser jeweils mit 2.5 m/s hinzudispensiert
wurden. Ein Scan dieser Tropfen hat eine gleichmäßige Fluoreszenz ergeben.
Abbildung 3.27: Verhalten der Probentropfen beim Auftreffen eines Tropfens aus
dem Piezopipettierkopf.
Bildserien des eintauchenden Tropfens unter stroboskopischer Beleuchtung zeigten,
dass beim Auftreffen eines Einzeltropfens mit 2.5 m/s in eine Probe deutlich
sichtbare Oberfächenwellen erzeugt werden. Trotz der Oberflächenwellen und
der hohen Geschwindigkeit, mit der der Tropfen auf die Probe trifft, wurde kein
Herausspritzen von Flüssigkeit aus der Probe beobachtet.

92 Material und Methoden
Die Reproduzierbarkeit des Eintrittsortes der Dispensertropfen in die Probe bei
einem Abstand zwischen Düse und Probenträger von 2 mm liegt bei 10 µm.
Mit diesem Dispensiersystem ist somit eine ausreichend hohe Genauigkeit in Bezug
auf das Probenvolumen und die Positionierung der Probe gegeben. Die Oberflächenspannung
verhindert ein Ablösen von reflektierten Tropfen während des
Pipettierens [168], so dass Probenanteile mit sehr hoher Geschwindigkeit zu den
Probentropfen hinzupipettiert werden können. Dies erlaubt ein schnelles Bearbeiten
der gesamten Probenfelder mit einer hohen Dispensiergeschwindigkeit
und führt bei einem mehrfachen Zupipettieren zu einer guten Durchmischung
der Proben.
Mikroskopoptik Für die Messung der Enzymaktivität wurde ein konfokales
Fluoreszenzdektionssystem entsprechend einem inversen Fluoreszenzmikroskop
aufgebaut (Abbildung 3.28). Durch den konfokalen Aufbau kann das Messvolumen
in Tropfen eingeschränkt werden.

Material und Methoden 93
PMT
Bandpass
Blende
Strahlteiler
Langpass
Linse
Langpass
Probe
Spiegel
Mikroskopobjektiv
Bandpass
Verschluß
Blende
Streuscheibe
Flüssigkeitslichtleiter
Abbildung 3.28: Detektionseinheit analog zu einem Fluoreszenzmikroskop. Die
Anregungs- und Emissionswellenlängen wurden durch einen Wechsel der Filter an die
jeweiligen Assays angepasst.
Um das Messfeld homogen auszuleuchten, wurde direkt hinter einer Anregungsblende,
die sich in der Abbildungsebene des Mikroskopobjektivs befindet, eine
Streuscheibe eingesetzt. Die Streuscheibe wurde mit einem Flüssigkeitslichtleiter
(2 mm Durchmesser) mit Anregungslicht beleuchtet. Als Anregungslichtquelle
wurde eine 100 W-Quecksilberdampflampe (Photon Technology International,
Kanada) genutzt. Das Anregungslicht konnte mit einem Verschluss ein- bzw. ausgeschaltet
werden, um die Probe nur während der Messzeit zu beleuchten. Das
Spektrum des Anregungslichts wurde durch Bandpassfilter je nach verwendetem
Assay (siehe Enzymassays 3.5.1) vorgegeben. Über einen dichroitischen Strahl-

94 Material und Methoden
aP Assay chymo Assay
4MUP CII
BP360±10 BP380±10
ST400 ST400
LP400 LP400
LP440 LP440
BP445±8.6 BP459±44
Tabelle 3.3: Filter, die für den alkalische Phosphatase bzw. den Chymotrypsin-Assay
verwendet wurden. BP gibt einen Bandpass mit dem spezifizierten TransmissionsbereichinNanometernan.
LPstehtfür einen Langpass und ST für einen Strahlteiler, der
Licht mit Wellenlängen unterhalb von 400 nm reflektiert und Licht mit längeren Wellenlängen
transmittiert. Hersteller der Filter: BP360, ST400, LP400 aus Filterblock A
(Leitz, Fluoreszenzmikroskopie, Deutschland), BP380: AF03, BP445: AF12, BP459:
A459 (Amko, Deutschland), LP440: LS440 (Corion, USA).
teiler wird das Licht in das Mikroskopobjektiv eingekoppelt. Aus dem verwendeten
20-fach Mikroskopobjektiv (20x/NA 0,5 (Linos, Deutschland) ergibt sich ein
Anregungsspot mit einem maximalen Durchmesser von 1.25 mm. Das von der
Probe ausgehende Fluoreszenzlicht wird durch den Strahlteiler, einen Langpaß
und eine Sammellinse über Umlenkspiegel auf den Photomultiplier kollimiert.
Ein zusätzlicher Bandpaß sorgt für eine Unterdrückung der Eigenfluoreszenzen
der Optiken. Die Detektionsblende befindet sich wie die Anregungsblende in
der Bildebene des Objektivs. In der folgenden Tabelle sind die Filter, die für
den alkalische Phosphatase bzw. den α-Chymotrypsin Assay eingesetzt wurden
aufgelistet.
3.4.2 Optimierter Aufbau zur Handhabung von
Nanoliterproben
Der gesamte Aufbau zum Erstellen, Bestrahlen und Auswerten der Proben ist
schematisch in Abbildung 3.29 dargestellt.

Material und Methoden 95
C
Klima
kammer
Proben
Spotter
A
B
CCD
Lampe
Abbildung 3.29: Aufbau zur Herstellung, Bestrahlung und Auswertung von
Nanoliter-Proben. Der Aufbau besteht aus 3 Kompartimenten: A) Detektionseinheit,
B) Klimakammer, C) Gehäuse für die Positionierung, Bestrahlungsoptik, CCD-
Kamera, Laser und Steuerung.
Der Aufbau besteht aus 3 Kompartimenten. A) einem Detektionsbereich, der aus
dem invers-mikroskopischen Aufbau zur Fluoreszenzauswertung besteht. B) der
Klimakammer, die wie in Abbildung 3.20 gezeigt aufgebaut ist, um die Probenlebensdauer
auf das nötige Maß anzuheben. C) einem äußeren Gehäusebereich,
der die Positioniereinheit, die Probenpiezodispensierer und die Bestrahlungsoptik
enthält. Bei der Positionierung war eine Genauigkeit von besser als 10 µm
in allen Achsen realisiert. Auch der Abstand zwischen Probenträger und Objektiv
wurde in diesem Bereich konstant gehalten, um die Reproduzierbarkeit
Laser

96 Material und Methoden
der Messungen zu gewährleisten. Dies wurde erreicht, indem die Probenkammer
auf einer polierten Granitplatte geführt wird, deren Welligkeit weniger als 10 µm
über 20 cm x 15 cm beträgt. In x- und y- Richtung wurde die Genauigkeit mit einer
schrittmotorgetriebenen Führung der benötigten Präzision (Micos) erreicht.
Um die Reproduzierbarkeit der Probenauswertung mit dem Detektionsaufbau zu
überprüfen, wurden Fluoresceinproben direkt und 30 min. nach ihrer Herstellung
vermessen.
Zahl der Photonen [s ]
-1
1000000
800000
600000
400000
200000
0
50 Tr.
1. Durchgang 30 min. später
150 Tr.
100 Tr.
0 200
t [s]
meß
50 Tr.
100 Tr.
0 200
150 Tr.
Abbildung 3.30: Messung der Reproduzierbarkeit der Detektionssignale von nl-
Fluoreszinproben direkt nach dem Pipettieren und nach 5 Messdurchgängen, die ein
Photobleaching zur Folge hatten.
Es wurden je 4 Proben aus 50, 100 und 150 Tropfen (33 pl) Fluorescein in Wasser
auf den Probenträger aufgebracht. Die Probenfluoreszenz wurde mehrfach über
eine halbe Stunde hinweg über jeweils 20 s pro Tropfen ausgelesen. Die Signale
der einzelnen Proben mit gleichen Volumina unterscheiden sich um weniger als
1%, d. h. die Reproduzierbarkeit von Dispenser, Positionierung und Fluoreszenzmessung
ist sehr gut (Abb. 3.30). Da nur ein Teil des Probenvolumens vermessen
wird, nimmt das Signal nicht proportional mit dem Volumen zu. Im fünften
Durchgang, dessen Signale neben den Signalen des ersten Durchgangs dargestellt
sind, ist zu erkennen, dass die Absolutwerte durch das Ausbleichen des Farbstoffs

Material und Methoden 97
abnehmen. Photobleaching kann die Messungen beeinflussen und muss deshalb
je nach verwendetem Farbstoff berücksichtigt werden.
Die Reproduzier- und Messgenauigkeit wurde anschließend mit dem Enzymassay
der alkalische Phosphatase quantifiziert. Jeweils 50 Tropfen alkalische Phosphatase
mit einem Gesamtvolumen von 1.6 nl (caP = 10 mg/l) wurden 30 min
auf dem Probenträger gehalten. Anschließend wurden 8 nl 4MUP-Substratpuffer
(c = 1 mM) zu jedem Probentropfen hinzugegeben. Die Abbildung 3.31 zeigt die
Fluoreszenz der Proben, die in einem Abstand von 3 min jeweils 5 mal für je 20 s
vermessen wurden.
Zahl der Photonen [s ]
-1
22000
20000
18000
16000
14000
12000
10000
0 180 360 540 720
Abbildung 3.31: Fluoreszenzsignalanstieg durch die Phosphataseaktivität in 6 Tropfen
aus nl-Phosphataselösung mit Substrat aus einem Probenraster. Die Substratfluoreszenz
wurde alle 180 s gemessen.
Die Proben wurden für 20 s ausgelesen, um ein Ausbleichen des Farbstoffs zu
verhindern. Durch die Aktivität der Phosphatase steigt die Fluoreszenz linear
mit der Zeit an, wobei die Steigung ein Maß für die Gesamtenzymaktivität
in der Probe ist. Die Steigungen der einzelnen Proben stimmen überein. Die
Abweichung von maximaler zu minimaler Steigung beträgt 6.1 %. Das Signal-zu-
Rausch-Verhältnis, definiert als das Quantenrauschen innerhalb der 20 s Messzeit
t [s]

98 Material und Methoden
bezogen auf die Untergrundfluoreszenz der Probe, beträgt 5. Die Detektionseinheit
hat somit eine ausreichend hohe Messgenauigkeit für den endgültigen
Aufbau. Abbildung 3.32 zeigt eine Messung bestrahlter und unbestrahlter aP-
Goldkonjugate. Die Probensubstratfluoreszenz wurde für jede Probe an 10 aufeinanderfolgenden
Zeitpunkten für je 5 s gemessen.
Enzymsubstratfluoreszenz
[Photonen/ s*1*10 ]
4
5
4
3
2
1
0
13:45:07
unbestrahlt
13:48:00 13:50:53 13:53:46 13:56:38
Zeit [h:min:s]
bestrahlt
Abbildung 3.32: Fluoreszenzintensität von 12 bestrahlten und 6 unbestrahlten Proben
mit aP-Goldkonjugaten nach Zugabe des Fluoreszenzsubstrats. Jede Probe wurde
in regelmäßigen Abständenvonca.2minfür 5 s vermessen. Das Probenvolumen betrug
1.6 nl.
Zusammenfassung Das für diese Arbeit aufgebaute Bestrahlungs- und Detektionssystem
ist in der Lage, Nanoliterproben herzustellen und die Proben für
einen Zeitraum von über einer Stunde zu stabilisieren. Durch die Automatisierung
des Systems ist es möglich, mehrere hundert Proben pro Tag zu vermessen.
Der Messfehler in der Enzymaktivität beträgt ca. 6 % des Maximalwertes. Dies
ist im Vergleich zu Mikrotiterplatten, die eine Reproduzierbarbkeit unter vollautomatischer
Beladung von 10 % erreichen [138], sehr gut. Vor allem sind die Objekträger
jedoch sehr viel kostengünstiger und durch ihre Variabilität für eine Untersuchung
von laserinduzierten Effekten besonders geeignet, da unterschiedliche
Probenträger genutzt werden können, die an die Wellenlänge und Laserleistung

Material und Methoden 99
angepasst sind. Die Probengröße kann leicht an die Pulsenergie und das Strahlprofil
angepaßt werden. Die herkömmlichen Kunststofftiterplatten sind darauf in
der Regel nicht optimiert und durch ihre aufwendige Strukturierung auch nicht
einfach auf eine Hochleistungs-Laseranwendung anzupassen. In Abbildung 3.33
ist ein Probenraster aus Fluoresceinlösungstropfen und ein Probenraster, in dem
eine Probe bestrahlt wird, dargestellt.
Proben-
Tropfenraster
Fluoreszenzdetektion
bestrahlter-
Tropfen
Proben-
Tropfenraster
Abbildung 3.33: a) Probenraster während der Bestrahlung der Tropfen; im Hintergrund
ist das Mikroskopobjektiv zur Auswertung der Fluoreszenzen zu erkennen; b)
Bild eines Probenrasters kurz nach Öffnen der Klimakammer.
3.4.3 Mikroliter-Probenplatten und Druckkammer
Mikroliter-Lochplatten
Für einen Teil der Experimente sollten die Proben manuell handhabbar sein. Das
Probenvolumen für die Versuche sollte dabei so klein wie möglich gewählt werden,
um mit den vorhandenen Lasern eine möglichst homogene Ausleuchtung der Proben
zu erzielen. Proben im Mikroliterbereich d. h. Durchmessern von 1 bis 2 mm
ließen sich gerade noch vernünftig handhaben. Standard-Loch-Platten mit 1536
Probentöpfchen der Firma Greiner weisen eine Restabsorption der Plattenböden
auf, die zu Brandflecken auf den Plattenböden und vor allem in den Plattenstegen
während der Bestrahlung führt. Somit sind diese Platten nur für Bestrahlungen
mit geringer Bestrahlungsstärke geeignet. Eine Schwelle für diesen stark von den
einzelnen Platten abhängigen Effekt kann mit ca. 1000 mJ/cm2 mit 532 nm und
6 ns Pulsen, bei 30 mJ/cm 2 mit 35 ps Pulsen bei 527 nm und mit > 5J/cm 2 mit
15 µs Pulsen bei 800 nm angegeben werden. Der Schmelzpunkt des Plattenbodens
beträgt 120◦C. Somit waren die Träger auch für Experimente mit Mikropartikeln

100 Material und Methoden
in der Druckkammer, wo Temperaturen bis zu 180◦Cfür Mikrosekunden erreicht
werden, ungeeignet.
Zwei Miktrotiterplattentypen aus Glas wurden angefertigt. Der erste Typ hat
Bohrungen mit einem Durchmesser von 2 mm und einer Tiefe von 2 mm. Der
Plattenboden besteht aus poliertem optischen Glas. Die Platten lassen sich durch
Ansprengen eines Deckels abdichten. Der zweite Plattentyp besteht aus Foturan
mit Löchern, deren Durchmesser 1.2 mm beträgt. Der optisch polierte Boden war
wiederum an die Lochplatte gebondet. Beide Platten haben Objekträgerformat.
Die Platten mit 2 mm-Probenbehältern haben ein Volumen von 4 µl und je 18
Probentöpfchen mit 8 mm Abstand von Zentrum zu Zentrum. Die Foturan Platte
hat einen Probenlochabstand von 1.5 mm und 200 Probentöpfchen. Im Fall der
Foturanplatte existierte kein dichtschließender Deckel, so dass die Probenverdunstung
hier die Meßzeit begrenzt. Die größte Schwierigkeit in der Handhabung der
Platten besteht im manuellen blasenfreien Pipettieren von stark proteinhaltigen
Proben, da Blasen zu einer Proteindenaturierung führen [34, 33]. Die Reproduzierbarkeit
bei Messungen der kleinsten Proben in den Foturanplatten ist in
Abbildung 3.34 dargestellt.
Substratfluoreszenz [willk. Einh.]
8
6
4
2
0
0 500 1000 1500 2000 2500
Zeit [s]
Abbildung 3.34: Phosphataseaktivität in 10 manuell pipettierten Proben in einer
Mikrotiterplatte mit einem Probenvolumen von 1.5 µl.
Die Fehler von 40 % sind so hoch, dass eine Messung der Aktivität in jeder einzelnen
Probe vor den Bestrahlungsversuchen nötig ist, oder die Platten nur für
die qualitative Bestimmung von Denaturierungseffekten einsetzbar sind.

Material und Methoden 101
Druckkammer
Um Absorber im Mikrometerbereich auf Temperaturen wesentlich über 100◦C zu erhitzen, wurden die Proben unter statischen Druck gesetzt. Es wurde eine
Druckkammer aus Plexiglas konstruiert, die eine Wandstärke von 15 mm besitzt
und einen Innenraum von 100·50·40 mm bietet. Für die Bestrahlung wurden die
Probenplatten in der Kammer mit Stickstoff unter Druck bis zu 10 bar gesetzt.
Dadurch kann nach der Zustandsgleichung von Wasser (siehe Abbildung 2.6)
ein Sieden in den Proben unter 180◦C verhindert werden. Die Druckkammer
wurde statt der Klimakammer während der Bestrahlung über dem Laserstrahl
positioniert. Abbildung 3.35 zeigt die beschriebene Druckkammer.
Abbildung 3.35: Druckkammer zur Bestrahlung der Proben, die mit Gas unter
max. 10 bar Druck gesetzt werden kann.
Zur Bestrahlung der Konjugate wurde eine 600 µm Faser durch das Plexiglas und
die Probenplatte auf den Probenplattenboden abgebildet. Zur Bestrahlung wurde
der Ti:Sa mit einer Pulsdauer von 15 µs eingesetzt. Die Bestrahlung erfolgte 5 min
nachdem die Kammer unter Druck gesetzt wurde, damit sich der Stickstoff in den
Proben lösen konnte. Nach der Bestrahlung wurde die Probenplatte geöffnet,
um 2 µl des jeweiligen Enzym-Substrats hinzuzugeben. Die Enzymaktivität der
Proben in der Probenplatte wurde ohne Druckkammer mit der Positioniereinheit
der Klimakammer gemessen.

102 Material und Methoden
3.5 Herstellung der Enzym-Absorberkonjugate
und Ablauf der Experimente
3.5.1 Enzymassays
Als Modellsystem wurden Enzyme, die auf Partikeln immobilisiert waren, untersucht.
Die Methoden zur Messung der Aktivität in den verschiedenen Proben
unterscheiden sich somit lediglich in den Enzymsubstraten. Das Verhältnis der
Aktivität von bestrahlten zu unbestrahlten Proben diente als direktes Maß für
die Denaturierung der Enzyme. Als Assay wurden Fluoreszenz- und Chemolumineszenzsubstrate
genutzt. Die Fluoreszenzintensität der Proben nimmt linear
mit der Zeit zu, wenn das Substrat in Sättigung vorhanden ist.
Es wurden weit verbreitete Substrate verwendet, die für quantitative Messungen
der Enzymaktivität in Proben bereits etabliert waren. Somit mussten lediglich die
schon etablierten Verfahren für die Versuchsbedingungen angepasst und überprüft
werden.
Alkalische Phosphatase
Zur Quantifizierung der Aktivität der alkalischen Phosphatase wurde das Fluoreszenzsubstrat
4-Methylumbelliferyl-phosphat (4 MUP) (CALBIOCHEM 474431)
verwendet [36]. Durch die gute Quantenausbeute des Umbelliferyls in basischem
Lösungsmittel eignet es sich besonders für die verwendete alkalische Phosphatase,
deren optimale Aktivität bei pH 9.6 liegt. Das 4 MUP wurde aus diesem Grund
in 1 M Diethanolaminpuffer (DEA) bei pH 9.8 gelöst. Im nicht umgesetzten Zustand
besitzt das Substrat ein Maximum im Anregungsspektrum bei 323 nm und
ein Emisssionsmaximum bei 385 nm. Die Abspaltung der Phosphatgruppe des
4 MUP hat eine Rotverschiebung des Anregungs- und Emissionsspektrums zur
Folge. Das Maximum der Anregung des umgesetzten 4 MU-Spektrums liegt so
bei 363 nm und die maximale Emmission bei 445 nm. Die Aktivität der Phosphatase
war somit proportional zum Fluoreszenzanstieg bei 363 nm, der durch die
Umsetzung des 4 MUP nach 4 MU bewirkt wird. Die Absorptions- und Fluoreszenzemissionsspektren,
gemessen im Fluoreszenzspektrometer Fluoromax, Spex,
USA des Substrats in umgesetzter und nativer Form, sind in Abbildung 3.36
dargestellt.

Material und Methoden 103
Neben dem Fluoreszenzsubstrat wurde anfangs das Chemolumineszenzsubstrat
CSPD von Tropix, USA genutzt. CSPD basiert auf 1, 2 Dioxetan, einem zyklischen
Peroxid, das nach Oxidierung ein Photon bei 466 nm emittiert [25]. Aufgrund
der untergrundfreien Messungen kann die Detektionsgrenze mit diesem
Substrat bis auf 3 pM alkalische Phosphatase Konzentrationen gesenkt werden.
Da im Rahmen der Arbeit aufgrund der erfolgreichen Herstellung enzymatisch
stark aktiver Konjugate Empfindlichkeit nicht im Vordergrund stand und schon
wenige Photonen Streulicht aus dem Labor die Chemolumineszenzmessungen
stören, wurde in den Versuchen nach Aufbau der Fluoreszenzdetektion 4MUP
für den Nachweis der Phosphataseaktivität genutzt.
α-Chymotrypsin
Im Fall von α-Chymotrypsin wurde das Fluoreszenzsubstrat Suc-Ala-Ala-Pro-
Phe-AMC (CII) (CALBIOCHEM 230914) genutzt [209, 208]. Die optimale Aktivität
von α-Chymotrypsin liegt bei pH 7.6. Das CII-Substrat wurde in Alkohol
gelöst und anschließend in Phospatpuffer verdünnt, da das Substrat selbst nicht
wasserlöslich ist. Im nicht umgesetzten Zustand besitzt das Substrat ein Maximum
im Anregungsspektrum bei 323 nm und ein Emisssionsmaximum bei 385 nm.
Die Abspaltung der Aminosäuren vom Fluorochrom hat eine Rotverschiebung des
Anregungs- und Emissionsspektrums zur Folge (Abbildung 3.36). Das Maximum
der Anregung des umgesetzten CII-Spektrums liegt jetzt bei 350 nm und die maximale
Emmission bei 445 nm. Da sich die Fluoreszenzanregung des Substrats
und die des umgesetzten Substrats deutlich überlappen, wurde mit 390 nm die
Anregungswellenlänge auf der abfallenden Flanke der Absorption gewählt. In
den Experimenten wurde die Detektionswellenlänge von 450 nm genutzt.

104 Material und Methoden
Substratfluoreszenz
[willk. Einh.]
a)
1,2
1
0,8
0,6
0,4
0,2
4 MUP
4MU
0
280 380
� [nm]
480
Substratfluoreszenz
[willk. Einh.]
b)
1,2
1
0,8
0,6
0,4
0,2
CII
CII umgesetzt
0
280 380
� [nm]
480
Abbildung 3.36: Normierte Anregungs- und Emissionsspektren der enzymatisch umgesetzten
sowie der nativen Enzymsubstrate a) 4 MUP (alkalische Phosphatase ) und
b) CII (α-Chymotrypsin ).
Fluoreszenz- Chemolumineszenzdetektion außerhalb der Probenplattform
Sammeloptik mit Faserbündel Zur Untersuchung der Fluoreszenzassays wurde
für die Versuche mit aP-Au-Konjugaten ein von der Probenplattform getrennter
und vereinfachter Aufbau mit dem Fluoreszenzspektrometer (Fluoromax/SPEX)
aufgebaut (Abbildung 3.37), da so beliebige Wellenlängen sowohl
im Anregungs- als auch im Emmissionslicht eingestellt werden konnten.
Fluoromax
PMT und
Monochromator
Xe Lampe und
Monochromator
Faserbündel
Probe
Abbildung 3.37: Aufbau einer Detektionseinheit mit Sammellinse und Fluoreszenzspektrometer
zur Messung von Probenfluoreszenzen von µl- Proben.
Das Anregungslicht sowie das Emissionslicht wird über ein gespleißtes Quarzfaserbündel,
welches auch als Strahlteiler dient, aus dem bzw. in das Fluoromax

Material und Methoden 105
geführt. Das Faserende wurde mit einer Bikonvexlinse (f=16 mm) auf die Probe
abgebildet. Dies geschah unter einem Winkel von 70◦ , damit kein Anregungslicht
von dem Probenträger in den Emmissionszweig reflektiert wird. Dieser
Aufbau wurde zur Auswertung der Inaktivierung von alkalische Phosphatase-
Goldkonjugaten genutzt.
Die Messung der CSPD Chemolumineszenzemission wurde mit Hilfe eines Aufbaus
durchgeführt, in dem die Proben in Mikrotiterplatten mit einem Mikropositioniersystem
über einem Glasstab positioniert wurden, der das Licht als Lichtleiter
an einen großflächigen Photomuliplier weitergeleitet hat, der für das Zählen
von Einzelphotonen beschaltet war. Der Aufbau ist schematisch in Abbildung
3.38 dargestellt.
Lichtleiter
PMT
SPC-Einheit
Abbildung 3.38: Aufbau einer Detektionseinheit zur Messung von Chemolumineszenzlicht
von Mikroliterproben; Ein Glasstab als Lichtleiter sammelt das Chemolumineszenzlicht
für einen Photomultiplier mit Einzelphotonenempfindlichkeit.
3.5.2 Goldkonjugate
Die Kopplung der in dieser Arbeit verwendeten Proteine an Gold wurde experimentell
etabliert und ist nach der in der Theorie 2.5.1 beschriebenen Vorgehensweise
erfolgt. Die für die Kopplung optimale Proteinkonzentration wurde
mit Hilfe des Farbumschlags bestimmt, der nach Zugabe von 10% NaCl erfolgt,
wenn die Goldpartikel nicht ausreichend mit Protein bedeckt sind. Solch ein
Farbumschlag ist für alkalische Phosphatase Goldkonjugate in Abbildung 3.39
dargestellt.

106 Material und Methoden
A
B
C
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
15nm
80nm
Abbildung 3.39: Farbumschlag von Rot nach Blau nach der Aggregation von unzureichend
beschichteten Goldpartikeln in Proben, in denen die Proteinkonzentration
von 1 nach 12 abnimmt.
Zu Goldkolloiden wurde in abnehmender Konzentration Protein zugegeben, das
nahe am isoelektrischen Punkt der Proteine an das Gold bindet. Ist zu wenig
Protein in der Lösung, so können die Konjugate nicht vollständig bedeckt werden,
so dass sie nach wie vor gegenüber starken Ionen empfindlich bleiben. D. h. durch
Zugabe von Salzlösung kommt es zu einer Aggregation und damit zu einem Farbumschlag
ins Blaue. Ist zu viel Protein in der Lösung, so kommt es zu einer
schwächeren Bindung, da mehr Protein auf die Oberfläche bindet und so eine
kleinere Wechselwirkung zwischen dem einzelnen Protein und der Partikeloberfläche
möglich ist. Dies ist schematisch in Abbildung 3.40 dargestellt und führt
vor allem zu einer verminderten Langzeitstabilität der Konjugate.
kleine Protein Konzentration
starke Bindung
große Protein Konzentration
schwache Bindung
Abbildung 3.40: Schematische Darstellung der nicht kovalenten Bindung von Proteinen
an Gold in Abhängigkeit von der Proteinkonzentration.
Die Konjugation wurde sowohl für alkalische Phosphatase -Konjugate als auch

Material und Methoden 107
für α-Chymotrypsin -Konjugate einmalig bei der Etablierung elektronenmikroskopisch
kontrolliert. Die elektronenmikroskopischen Aufnahmen zeigten, dass
die Konjugate mit einem Monolayer der Proteine bedeckt waren. Die charakteristische
Bildung eines losen Pellets der vereinzelten Konjugate in der Zentrifugation
in einem Festwinkelrotor und die Auftrennung vom Clusteranteil [162]
wurde für alle folgenden Ansätze als Maß dafür genommen, dass sich an dem
Clusteranteil in den Proben und der Proteinbelegung nichts im Vergleich zu den
ersten Ansätzen verändert hatte. Elektronenmikroskopisch konnten jedoch auch
nach der Aufreinigung einige Cluster aus 3 bis 5 Partikeln beobachtet werden.
Eine grobe Abschätzung anhand der elektronenmikroskopischen Aufnahmen ergab,
dass der Anteil dieser Cluster unter 10 % der Partikelzahl liegt. Alle für die
Bestrahlung eingesetzten Konjugate wurden direkt vor der Bestrahlung durch
eine Zentrifugation bis 2000 g über 45 min von Clustern befreit.
alkalische Phosphatase -Au
Die Konjugation der Proteine an 15 nm Gold ist nach dem Protokoll von dem
Goldhersteller (British Biocell International) erfolgt [12]. Das Protokoll wurde
für die Kopplung der Enzyme entsprechend dem pI Wert der Enzyme modifiziert.
Alkalische Phosphatase hat seinen isoelektrischen Punkt bei pH 5.8, so dass die
Goldlösung mit K2CO3 und HCl auf diesen pH eingestellt wurde.
Die benötigte Proteinmenge wurde mit Hilfe des beschriebenen Farbumschlags
nach einer NaCl Ausfällung zu 0.1 µg/ml bestimmt. Die Konjugate wurden elektronenmikroskopisch
überprüft, die EM-Präparation ist in Abschnitt 3.5.2 beschrieben.
Es konnte nachgewiesen werden, dass bei der über den Farbumschlag
bestimmten Proteinkonzentration die einzelnen Goldpartikel nicht aggregieren.
Die optimale Proteinkonzentration wurde vor jeder Beschichtung neu bestimmt.
Bei Bindungen, in denen zu wenig Protein eingesetzt wurde, konnte sowohl elektronenmikroskopisch
als auch durch Ultrazentrifugation eine Aggregation eindeutig
nachgewiesen werden. Die Konjugation erfolgt innerhalb von 10 Minuten. Die
Proben wurden anschließend mit 10000 g für 30 min zentrifugiert. Eine weitere
Aufreinigung ist durch zweimaliges Zentrifugieren mit 2000 g für 45 min erfolgt.
Nach der Aufreinigung wurden weniger als 5 % der Probenaktivität durch unkonjugierte
Proteine hervorgerufen. Eine Kopplung mit 80 nm kolloidalem Gold

108 Material und Methoden
ist bei gleichen Bedingungen möglich. Die Konjugate werden im Folgenden als
aP-Au bezeichnet.
Chymotrypsin-Au
Der isoelektrische Punkt von Chymotrypsin liegt bei dem pH 8.8. Entsprechend
wurden in diesem Fall die Konjugationspuffer auf diesen Wert eingestellt. Die
Bestimmung der Konzentration wurde in der NaCl-Ausfällung zu 0.5 µg/ml bestimmt.
Die Aufreinigung wurde analog zur Aufreinigung der alkalische Phosphatase
-Konjugate durchgeführt. Es konnte ebenfalls eine Konjugation mit 80 nm
Gold bei gleicher Vorgehensweise erzielt werden. Die Konjugate werden im Folgenden
als chymo-Au bezeichnet.
MIB-1-Au
MIB-1 (Molekulare Immunologie Borstel 1) [29, 169] ist ein Antikörper gegen
das Kernprotein Ki-67 [62, 61, 169, 53], das spezifisch bei Zellwachstum synthetisiert
wird. Die Konjugation des Antikörpers MIB-1 an 15 nm Gold ist nach
dem Protokoll von dem Goldhersteller British Biocell International erfolgt [12].
Anstatt die Antikörper zu dialysieren, wurde eine stark konzentrierte Proteinstammlösung
verwendet, so dass die Verunreinigung der Gesamtprobe derart
klein gehalten werden konnte, dass Bestandteile des Antikörperlagerungspuffers
die Bindung nicht wesentlich beeinflussten. Die Antikörperkonzentration wurde
vor jeder Konjugation mit der vorhergehend beschriebenen NaCl-Ausfällung
bestimmt. Für die Konjugation wurde die Goldsuspension mit K2CO3 auf den
pH 9.2 eingestellt. Die Proben wurden im Unterschied zu den Enzymproben mit
BSA stabilisiert, da eine Nutzbarkeit über eine langen Zeitraum im Vordergrund
stand. Die Stabilisierung erfolgte, indem nach der ersten Aufreinigung 10 % BSA
zugesetzt wurden. Diese Konzentration wurde für 10 Minuten aufrecht erhalten.
Anschließend wurden die Proben zweifach bei 2000 g in 10 % BSA-Puffer
aufgereinigt, so dass es zu einer weiteren Stabilisierung durch das BSA kommen
konnte. Die Konjugate werden im Folgenden mit MIB1-Au bezeichnet.

Material und Methoden 109
BerH2-Au
BerH2 ist ein Antikörper gegen das Oberflächenantigen CD30, das auch als Ki-1
[171] bekannt ist. Die Konjugation von dem Antikörper BerH2 an das 15 nm
Gold ist analog zu der Konjugation von MIB-1 erfolgt. Die eingesetzte Proteinkonzentration
wurde zu 0.9 mg/ml bestimmt. Diese Konjugate neigen stärker
zur Aggregation als MIB-1-Konjugate.
aP-AK-AK-Au
Die Konjugate für die Versuche zur Abstandsabhängigkeit der Denaturierung
sind erfolgt, indem MIB-1-Goldkonjugate mit einem Ziege-anti-Maus-Antikörper
inkubiert wurden, der kovalent mit alkalischer Phosphatase gekoppelt war (DA-
KO D0486). Die beiden Konjugate wurden 30 min inkubiert, so dass die aP-
Konjugate an die Goldkonjugate binden konnten. Anschließend wurden die Proben
durch Zentrifugieren bei 2000 g (45 min) aufgereinigt. Diese Konjugation
resultierte in Proben, bei denen mindestens eine Antikörperlage zwischen Gold
und Enzym lag. Der maximale Abstand zwischen Gold und Enzym beträgt zwei
Antikörperlagen. Die Konjugate werden im Folgenden mit BerH2-Au bezeichnet.
Elektronenmikroskopie
Elektronenmikroskopisch wurde anhand des Eigenkontrastes von Gold die Integrität
der Partikel überprüft. Mit Hilfe einer Negativkontrastierung konnte
die Proteinhülle um die Goldpartikel sichtbar gemacht werden. Die Negativkontrastierung
beruht darauf, dass die Umgebung der darzustellenden Objekte mit
einer Verbindung inkubiert wird, die stark Elektronen streut, wie z. B. Schwermetall-Salzlösungen.
Wenn die Lösung eintrocknet, bildet sich eine glasartige Schicht,
die von den Abdrucken“ des elektronentransparenten biologischen Materials un-
”
terbrochen wird. An den Kanten des biologischen Materials ändert sich die
Schichtdicke entsprechend den Unregelmäßigkeiten der Objektoberfläche. Diese
Bereiche unterschiedlicher Massendicke streuen die Elektronen unterschiedlich
und erzeugen so den Bildkontrast. Die Proben wurden mit 0.5% Uranylacetat
kontrastiert. Elektronenmikroskopische Aufnahmen wurden in der hohen
Auflösung mit dem EMP10 (Phillips, Holland) aufgenommen. Die Aufnahmen
der geringeren Auflösung wurden mit Zeiss-Gerät EM9 aufgenommen.

110 Material und Methoden
3.5.3 Ablauf der Experimente mit Goldkonjugaten
aP-Au-Konjugate
Die Bestrahlung der aP-Gold-Konjugate mit Nanosekundenpulsen erfolgte in
PBS mit Tropfen von 500 µm Durchmesser (V=1.6 nl) und einem pH von 7.6.
Nach der Bestrahlung des gesamten Rasters wurde durch einen zweiten Pipettierkopf
das Substrat 4MUP in DEA-Puffer bei einem pH von 9.6 zugefügt. Das
Gesamtvolumen betrug so 8 nl. Durch den DEA-Puffer wurde der pH der Probe
auf 9.6 erhöht. Die gesamte Auslesedauer hing von der Anzahl der Proben
ab. Die einzelnen Proben wurden nacheinander für jeweils 5 Sekunden ausgelesen.
Dieser Prozess wurde mehrfach wiederholt, bis das Fluoreszenzsignal der
Kontrollen mindestens doppelt so groß war wie das Untergrundsignal.
Die Bestrahlung der aP-Au-Konjugate mit Pikosekundenpulsen war die einzige
Versuchsreihe, in der kommerzielle Konjugate der Firma ICN, USA eingesetzt
wurden. Diese waren nicht so stabil, dass die Dissoziation der alkalische Phosphatase
von dem Gold während der Versuche vernachlässigt werden konnte. Deshalb
wurde für die Berechnung der Enzyminaktivierung der Anteil der von nicht
gekoppelter Phosphatase hervorgerufenen Aktivität subtrahiert. Hierzu wurde
vor jeder Bestrahlung die Phosphataseaktivität in Sediment und Rückstand nach
Aufreinigung (Zentrifugation mit 8415 g über 45 Minuten) gemessen. Die Inaktivierungen
in den Versuchsreihen aus dem vorhergehenden Abschnitt (4.5.2)
wurden mit folgender Formel berechnet:
Inaktivierung[%] = ASediment (Aunbestrahlt − Abestrahlt )
Aunbestrahlt (ASediment − ARückstand)
A bezeichnet die Steigung des Fluoreszenzsignals in den jeweiligen Proben.
(3.3)
Für alle anderen Konjugate war eine Berechnung der Restaktivität nach dieser
Formel nicht notwendig, da die Konjugate ausreichend stabil waren und sich
während der Messzeit kein Enzym von den Konjugaten gelöst hat. Die Bestrahlung
erfolgte in den Mikrotiterplatten aus optischem Spezialglas mit 2 mm Probendurchmesser.
Für die Bestrahlung der Proben mit einem homogenen Strahlprofil
und Pikosekundenpulsen wurde das gaußsche Strahlprofil aufgeweitet. Für
die Bestrahlungen, in denen eine Inaktivierung gemessen wurde, wurde die scannende
Bestrahlung über 16 Felder eingesetzt.

Material und Methoden 111
Chymo-Au-Konjugate
Die Chymotrypsin-Gold-Konjugate wurden wie die Phosphatase-Konjugate mit
Nanosekundenpulsen in Tropfen mit einem Durchmesser von 500 µm bestrahlt.
Sie befanden sich ebenfalls in PBS mit einem pH von 7.6. Das Substrat wurde in
einer Konzentration von 10 mM in PBS zugefügt. Das Auslesen erfolgte analog
zu dem der Phosphatase-Konjugate.
Die Bestrahlung der chymo-Au-Konjugate mit Pikosekundenpulsen und hohen
Bestrahlungen und einem Scannen über 64-Felder erfolgte analog zu den Experimenten
mit aP-Au-Konjugaten und ps-Pulsen in den Mikrotiterplatten aus Glas.
3.5.4 Mikroabsorber-Konjugate
Polystyren-Magnetit-Absorber
Als Mikropartikel wurden zum einen magnetithaltige Kunstoffabsorber des Typs
Dynabead Tosylactivated M-280 mit einem Durchmesser von 2.8 µm genutzt, die
im Folgenden als PM-Konjugate bezeichnet werden. Die Partikel bestehen aus einem
zu 12% Magnetit infiltrierten Polystyrenkern, der mit Polyurethan beschichtet
ist. Die Polyurethanstärke beträgt weniger als 100 nm. Die Partikeloberfläche
ist derart modifiziert, dass P-Toluenesulphonyl-Chlorid als Reaktionspartner für
kovalente Bindungen mit Aminogruppen oder mit Sulphydrylgruppen an Proteinen
zur Verfügung steht. Die Konjugation von alkalischer Phosphatase an diese
Absorber wurde nach dem Protokoll von Dynal [50] durchgeführt.
10 µm
a b
10 µm
Abbildung 3.41: Mikroabsorber mit Magnetit als Chromophor: a) Silika-Magnetit
6µm(Sikastar M); b) 2.8µm Polystyrene-Magnetit, Polyurethan (Dynabeads).

112 Material und Methoden
Silika-Magnetit-Absorber
Als temperaturstabile Absorber wurden Silika-Absorber, die mit Magnetit angereichert
sind, genutzt, die im Folgenden als SM-Konjugate bezeichnet werden.
Das Absorptionsspektrum im sichtbaren Bereich entspricht dem der Dynabeads.
Die Silikapartikel (Sikastar-M, Micromod GmbH, Deutschland) werden über ein
Hydrolyseverfahren aus Orthosilicaten und Derivaten in Gegenwart von Magnetit
hergestellt. Sie bestehen aus clusterförmigen Aggregaten im Größenbereich
von 100 nm bis 10 µm mit einem mittleren Durchmesser von 6 µm. Sie weisen
eine homogene Verteilung von Magnetit in der Silikatmatrix auf und besitzen
eine hydrophile Oberfläche mit terminalen Si-OH-Gruppen. Diese Partikel wurden
mit einer COOH-Oberfläche erworben. Somit war eine kovalente Kopplung
von Proteinen über eine Carbodiimid-Bindung an die Aminogruppen der Proteine
möglich. Diese Kopplung ist auch als EDC-NHS-Kopplung bekannt. Die
Kopplung ist nach dem Protokoll von Thelen und Hermanson [79] erfolgt. Dies
hat gegenüber der verbreiteten direkten Carbodiimid Kopplung (EDC) den Vorteil,
dass COOH nicht direkt mit den Aminogruppen reagieren kann. Deshalb
kommt es in der genutzten Kopplung zu keiner Quervernetzung der Aminosäuren
innerhalb der Proteine, sondern nur zu einer Bindung der Proteine an die Absorberoberfläche.
Die Proteine können dabei mehrere Bindungsstellen mit der
Oberfläche eingehen. Da die Proben einen nicht zu vernachlässigenden Anteil an
Partikeln mit einem Durchmesser unter 1 µm enthielten, die bei einer Bestrahlung
nicht ausreichend erhitzt werden, mussten die Proben filtriert werden. Ziel der
Filtration war, Partikel oberhalb einer bestimmten Größe zu erhalten, so dass alle
Partikel bis zu der Mindesttemperatur und -dauer der kleinsten Partikel erhitzt
wurden. Als Kantenfilter wurden Polycarbonatmembranen (nuclepore, Whatman,
USA) genutzt. Die Porengrößen betrug 8 µm. Die Membranen eignen sich
durch ihre glatte Oberfläche für eine Kantenfilterung, die ein Binden von Partikeln
an die Oberfläche verhindert (Abbildung 3.42). Die Partikel in dem Filter
wurden über einen Rüttler während des gesamten Filtrationsprozesses in Bewegung
gehalten, so dass immer mehr Partikel unterhalb der Abscheidegrenze den
Filter passieren konnten, ohne dass dieser verstopfte. Um eine Größenverteilung
zu erhalten, die eine Partikeloberfläche von Partikeln unter 8 µm Durchmesser von
weniger als 1 % der gesamten Partikeloberfläche gewährleistet, wurde das Probenvolumen
mit seinem 50000-fachen Volumen bei einer Flußrate von ca. 100 ml/min
gespült. Entscheidend für die Filtration ist, dass die Partikel durch die Schwer-

Material und Methoden 113
kraft auf die Membran sinken und in regelmäßigen Abständen durch eine Drehung
wieder komplett von der Membran gelöst werden müssen. Dies wurde durch eine
zusätzliche Taumelvorrichtung an dem Rüttler gewährleistet.
100 µm
Abbildung 3.42: SikastarM Partikel (weiß umrandet) auf einer Polycarbonatmembran
mit einheitlicher Porengröße von 8 µm, die als Kantenfilter dient und Partikel

114 Material und Methoden
SM-Konjugate
Die Chymotrypsin-Gold-Konjugate wurden in Lochplatten mit 2 mm Durchmesser
bestrahlt. Sie befanden sich ebenfalls in PBS mit einem pH von 7.6. Das
Substrat wurde in einer Konzentration von 10 mM zugefügt. Das Auslesen erfolgte
analog zum Auslesen mit den Phosphatase-Konjugaten.
3.5.6 Parameterübersicht Enzym-Absorber-Konjugate
τlaser λ Strahlprofil Probenform Partikel Enzym Assay Aggreg. Druck Pulszahl Bestrahlungmax.
[nm] [bar] [mJ/cm²]
6 µs 600 Faser 1.3 mm Greiner 2.8 µm PM aP CSPD 1 1-1000 1200
2.8 µm PM aP CSPD x 100 600
2.8 µm PM aP CSPD x 1000 600
15 µs 800 Faser 2mm Töpfchen 8 µm SM aP CSPD 1-1000 2500
8 µm SM aP CSPD 10 1-1000 2500
8 µm SM chymo CII 1 1 3000
8 µm SM chymo CII 5 1 2500
8 µm SM chymo CII 9 1 2500
8 µm SM chymo CII x 9 1 10000
1.2 mm Töpfchen 8 µm SM chymo CII x 9 100 10000
16 ns 532 homogen Tropfen 15 nm Au aP 4MUP 1 1 600
gaußähnlich 15 nm Au aP 4MUP 1-100 3500
gaußähnlich 15 nm Au chymo CII 1 3500
6 ns 532 homogen Tropfen 15 nm Au chymo 1 1200
35 ps 527 homogen 2mm Töpfchen 15 nm Au aP 4MUP 10000 2.1
homogen 15 nm Au chymo CII 2.1
4x4 scan 15 nm Au aP 4MUP 1-10000 54
8x8 scan 15 nm Au chymo CII 500-10000 76
Tabelle 3.4: Übersicht über die Bestrahlungsparameter, Probenformen und Versuchsbedingungen,
die für die unterschiedlichen Enzym-Partikel-Konjugate eingesetzt wurden.
3.6 Mikroskopische Blasendetektion
Blasenbildung durch Bestrahlung der Partikel wurde in einem mikroskopischen
Aufbau zur Kurzzeitphotographie untersucht (Abbildung 3.43). Eine Faser wurde
in die Probe abgebildet mit einem 63-fach Objektiv abgebildet. Diese Bildebene
wurde wiederum mit einer Sammellinse auf eine CCD-Kamera abgebildet, die

Material und Methoden 115
durch einen Bandpaß vor dem Laserlicht geschützt war. Mit einem Stickstoff-Dye-
Laser konnte zu einstellbaren Zeiten nach dem Laserpuls die Probe für 6 ns beleuchtet
werden. Die Aufnahmen haben eine Auflösung von 1 µm. Entsprechend
konnten die Nanoabsorber und kleine Blasen nicht aufgelöst werden. Sie waren
jedoch als stark streuende Objekte in dem Bild mit einer Größe der Auflösung
sichtbar. Größere Blasen und mikrometergroße Absorber konnten gut sichtbar
gemacht werden. Die Absorber konnten auf ihre Integrität vor und nach der
Bestrahlung untersucht werden.
Nd:YLF
Photodiode
a)
Abschwächer
CCD
N Dye- Beleuchtung
2
Probe
800 nm 600 nm
15 µs 6 µs
b)
Bestrahlung
Beleuchtung
N2 - dye laser
485 nm 3 ns
CCD
40 X
Probe
Abbildung 3.43: a) Aufbau zur optischen Bestimmung der Blasenschwelle an Einzelpartikeln
mit Nd:YLF, 527 nm, 280 ns Pulsen als Bestrahlungslaser. b) Aufbau zur
optischen Bestimmung der Blasenbildungsschwelle in den Enzym-Absorber-Proben bei
Bestrahlung mit dem Ti:Sa und Rhodamim 6G Laser.
Zur Messung der Blasenbildung und Fragmentierung der Partikel mit Nd:Ylf
280 ns-Pulsen wurden der Aufbau wie in Abbildung 3.43 dargestellt und von
Neumann beschrieben [134] genutzt. Zur Messung der Blasenbildungsschwelle
bei Bestrahlung mit dem Ti:Sa und dem Rhodamin 6G Laser wurden vergleichbare
Aufbauten genutzt (Abbildung 3.43 b), die an den Bestrahlungsaufbau zur
Bestrahlung der Proben angebaut wurden. Entsprechend ist die Bestrahlung mit
einer Faserabbildung wie in Abschnitt 3.2.1 beschrieben erfolgt. Als Einkoppelspiegel
wurden der Laserwellenlänge entsprechende Spiegel (HR 800 nm, 600 nm)
genutzt. Die Detektion ist von oben erfolgt. Aufgrund der sehr viel höheren
Energien wurde zur Aufnahme ein nichtgekittetes Mikroprojektionsobjektiv (Linos,
Deutschland) mit einer Brennweite von 8.3 mm eingesetzt.

116 Material und Methoden
3.7 Wasserbadexperimente
Die Experimente zur Charakterisierung der thermischen Denaturierung von alkalischer
Phosphatase, aP-PM-Konjugaten, aP-SM-Konjugaten und chymo-SM-
Konjugaten im Zeitbereich 1 bis 100 s mit Temperaturen bis zu 100◦C wurden mit
Wasserbad-Temperatursprung-Experimenten durchgeführt. Als Behälter für die
zu untersuchenden Proteine wurden für den Zeitbereich 1 bis 10 s Markröhrchen
aus Quartz (Hilgenberg, Deutschland) genutzt. Für den Zeitbereich 10 bis 100 s
wurden einfache 1.5 ml PP-Reaktionsgefäße (Eppendorf, Deutschland) genutzt.
Die Markröhrchen haben einen Durchmesser im genutzten Bereich von 300 µm
und eine Wandstärke von 10 µm. Die Röhrchen wurden am Wasserbadende mit
einem temperaturstabilen Wachs verschlossen. Die Proben wurden für einen
Temperatursprung einer gewünschten Zeit in das geheizte Wasserbad getaucht.
Um den Temperatursprung zu beenden, wurden die Proben in ein Eisbad gebracht.
Mit den Markröhrchen wurde eine Erwärmung der Proben auf 99 %
der Solltemperatur nach einer Temperaturrechnung innerhalb von 100 ms durch
Wärmeleitung erreicht. Im Fall der Kunstoffröhrchen betrug die mit einem
Thermofühler gemessene Heiz- bzw. Abkühlzeit 5 s.
3.8 Zellexperimente
Erste Versuche zur selektiven Inaktivierung von Zellen durch Laserbestrahlung
von Goldpartiekln wurden an Suspensionszellen durchgeführt, um ein einfaches
Umsetzen der Zellen zwischen den verschiedenen Versuchsschritten zu ermöglichen.
Die Zelllinie sollte folgende Eigenschaften besitzten:
1. Die Zellen sollten einen hochspezifischen Zellmarker besitzen, der von einer
ähnlichen Zelllinie nicht exprimiert wird.
2. Die Zellen durften keine phagozytierenden Zellen sein, damit die Konjugate
so wenig wie möglich unspezifisch aufgenommen werden würden.
3. Die Zellen und deren Zellmarker sollte nach Möglichkeit eine medizinische
Relevanz haben.

Material und Methoden 117
Als diese Kriterien erfüllende Zelllinie wurde die Hodgkin Lymphom Zelllinie
L428 gewählt. Diese ist in der Zelldatenbank DSMZ- Deutsche Sammlung von
Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH beschrieben [48]. L428 trägt als spezifisches
Oberflächenantigen CD30. CD30-Expression ist für die Bestimmung
von primären kutanen und nodalen T-Zell-Lymphomen klinisch relevant [40].
Als CD30 negative Kontrollzelllinie wurde die Zelllinie U937 gewählt, die ebenfalls
in der Datenbank beschrieben ist. Die Zelllinien lassen sich neben CD30
durch die Differenzierungsmarker CD13 und CD16 unterscheiden. In Vorversuchen
wurde die CD30 Expression einer nicht synchronisierten Zellpopulation
quantifiziert. Dafür wurde der gegen CD30 gerichtete Antikörper BerH2 (anti-
CD30) gewählt. Dieser wurde mit einem Alexa-488-Farbstoff-markierten Ziegeanti-Maus-Antikörper
auf den Zellen durchflusszytometrisch nachgewiesen. Die
Ergebnisse sind in Abbildung 3.44 dargestellt.

118 Material und Methoden
# Ereignisse
# Ereignisse
# Ereignisse
U 937 L 428
0 10 1
10 2
10
Alexa Fluoreszenzintensität
3
10 4
0 10 1
10 2
10
Alexa Fluoreszenzintensität
3
10 4
0 10 1
10 2
10
Alexa Fluoreszenzintensität
3
10 4
# Ereignisse
# Ereignisse
# Ereignisse
0 10 1
10 2
10
Alexa Fluoreszenzintensität
3
10 4
0 10 1
10 2
10
Alexa Fluoreszenzintensität
3
10 4
0 10 1
10 2
10
Alexa Fluoreszenzintensität
3
10 4
Eigenfluoreszenz
PFA fixiert (2%)
IgG-Kontrolle
A 488
CD30/ A 488
Abbildung 3.44: CD30-Expression der Zelllinien L428 und U937. Dargestellt ist
Berh2 (Anti-CD30) Bindung an die Zellen über die Fluoreszenz von einem Alexa-488
markierten Sekundärantikörper, der an BerH2 bindet.
Aus den Fluoreszenzanfärbugen folgt, dass sich die Zelllinien U937 und L428 in
der CD30 Expression zu >99% unterscheiden. Damit sind sowohl die Zellen als
auch die genutzten Antikörper als Testsystem geeignet.
In Versuchen zur Inaktivierung der Zellen mit dem Antikörper-Goldkonjugat
BerH2-Au wurden Zellen in Glas-Lochplatten mit 4 µl Probenvolumen bestrahlt.
Die Zellzahl wurde so gewählt, dass der Plattenboden durch eine Zellschicht bedeckt
wurde. Dies führte zu einer Konzentration von 105 Zellen/µl. Der Totanteil

Material und Methoden 119
der Zellen betrug in der Zellkultur zwischen 20 und 40%. Die Zellen wurden in
RPMI+ [48] als Medium kultiviert. Vor den Versuchen wurden die Zellen in
Neubauer-Kammern gezählt. Der mittlere Durchmesser der U937-Zellen betrug
5 µm, der der L428-Zellen 8 µm. Die L428-Zellen neigten zu Clusterbildung. Die
Bestrahlung erfolgte mit dem Pikosekunden-Nd:YLF bei 527 nm. Der Strahldurchmesser
entsprach dem, der für die Bestrahlung der chymo-Au-Konjugate
mit Pikosekundenpulsen genutzt wurde. Die Probe wurde kontinuierlich entlang
eines Rasters abgefahren. Die Wendepunkte bei der Bestrahlung lagen außerhalb
der Probe, so dass die gesamte Probe auch an den Rändern gleichmäßig bestrahlt
wurde. Dies ist als Prinzipksizze in Abbildung 3.45 dargestellt.
Laserstrahl
Probentöpfchen
Abbildung 3.45: Scanmuster, das zur Bestrahlung der Zellen eingesetzt wurde.
Der Bestrahlung folgte eine Anfärbung der Zellen mit der lebend/tot-Färbung
[126] über den DNA Farbstoff Probidium-Iodid und das Esterasensubstrat BCECF
(Molecular Probes, USA). Die Proben wurden hierfür nach dem Bestrahlen der
Probentöpfchen in 500 µl PBS in Flowzytometerröhrchen umgesetzt, das die
Farbstoffe PI (1 µM) und BCECF (0.5 µM) enthielt. Die Signalsättigung wurde
nach 15 min Inkubation erreicht. Die Inkubation mit Antikörpern und den
AK-Au-Konjugaten erfolgte für je 30 min. In den ersten Versuchen (Ergebnisse
in Kapitel 4.6.2) wurden Zellen nach der Konjugation in Medium gewaschen.
In Versuchen zur Energieabhängigkeit und den Inkubationsbedingungen wurde
das Gold in den Probentöpfchen belassen, so dass eine Goldkonzentration von
> 1 · 1012 Konjugate/ml in den Proben über die gesamte Versuchsdauer vorlag.

120 Material und Methoden

Kapitel 4
Ergebnisse
4.1 Absorber-Fragmentierung und
Blasenbildungsschwelle
Für die Goldkonjugate und die Mikrometerpartikel wurden die Verdampfungsschwellen
und die Stabilität der Partikel unter Bestrahlung untersucht. Die Untersuchungen
sind für das Verständnis der Mechanismen, die zu einer Inaktivierung
der Proteine führen, wichtig und bieten einen Anhalt für die auftretenden
Temperaturen.
4.1.1 Mikrometer-Partikel
Experimente mit mikrometergrossen Partikeln wurden mit zwei verschiedenen
Arten von magnetithaltigen Partikeln durchgeführt (Polystyren 2.8 µm; Silikat
6µm). Die Partikel wurden in Hinblick auf ihre thermische Stabilität und die
Blasenbildungsschwelle hin untersucht. Die Blasenbildungsschwelle wurde mikroskopisch
und optoakustisch gemessen. Eine Fragmentierung der Absorber wurde
mikroskopisch festgestellt.
Polystyren-Magnetitabsorber
Blasenbildungs- und Zerstörschwellen an Polystyren-Magnetitabsorbern mit 2.8 µm
Durchmesser (PM) wurden mikroskopisch beobachtet. Die Partikel wurden während
121

122 Ergebnisse
der Bestrahlung stroboskopisch beleuchtet. Als Blasenbildungsschwelle wurde die
Bestrahlung definiert, an der an einzelnen Partikeln in der Probe noch eine Blase
detektiert werden konnte. Dies ist aufgrund der Annahme geschehen, dass das
Wasser in der Umgebung der Partikel überhitzt werden und entsprechend die
Blasenbildung ab der Siedetemperatur stattfinden kann und mit zunehmender
Temperatur immer wahrscheinlicher wird. Dementsprechend kann angenommen
werden, dass bei einer Schwelle, bei der an einer Promille der Partikel eine Blase
zu sehen ist (ED0.1), Temperaturen in der Nähe vom Siedepunkt herrschen.
Bei der Bestrahlung mit dem 6 µs Farbstoff-Laserpulsen (600 nm) kam es zu einer
Blasenbildung um die Partikel ab einer Bestrahlung von 590 mJ/cm2 . Die Partikel
wurden bei Bestrahlungen oberhalb der Blasenbildungsschwelle fragmentiert,
wobei keine scharfe Schwelle bezüglich der Bestrahlung festgestellt werden konnte
(siehe Abbildung 4.1). An weniger als ein Promille der Partikel in der Probe
ist es zu einer dauerhaften Blasenbildung mit Blasenlebensdauern von bis zu 30
Minuten gekommen. Eine Bestrahlung der PM-Absorber mit 280 ns Pulsen bei
527 nm bewirkte ebenfalls eine Fragmentierung der Partikel und führte zu Blasen,
die oberhalb der Blasenbildungsschwelle keine einheitliche Lebensdauer hatten.
Abbildung 4.1: 2.8 µm Durchmesser Polystyren-Magnetit-Absorber vor und nach
Bestrahlung mit einem 280 ns Puls bei 527 nm, 2 J/cm2 .
Silika-Magnetitabsorber
Mittels des mikroskopischen Aufbaus zur Kurzzeitphotographie wurden an 6 µm
Durchmesser Silika-Magnetit-Absorber (SM) nach einer Bestrahlung mit 280 ns
Pulsen bei 532 nm Blasen beobachtet. Die Abbildung 4.2 zeigt die Entstehung
von Blasen bei einer Bestrahlung von 7 J/cm2 .

Ergebnisse 123
0,6 µs 1,6 µs 2,0 µs 2,2 µs
3,0 µs 4,8 µs 5,0 µs 10,4 µs
Abbildung 4.2: Blasenbildung an 6 µm Durchmesser Silika-Magnetit-Absorbern nach
Bestrahlung mit einem 280 ns Puls bei 527 nm; 7 J/cm2 .
Im Gegensatz zur Bestrahlung von PM-Partikeln wurde das für Kavitationsblasen
typische Aufschwingen und Kollabieren der Blasen beobachtet. Die Blasenlebensdauer
bei dieser Bestrahlung betrug 5 µs. Die Blasenbildungsschwelle, definiert
als Bestrahlung, bei der mit 50% Wahrscheinlichkeit Blasen um die Partikel entstehen,
wurde zu 909±50 mJ/cm2 berechnet (ED50 Algorithmus; Probit V.2.1.1
[181, 58]). Die Berechnung ist auf der Basis einer gaußschen Normalverteilung
mit logarithmischer Kovariantenbasis erfolgt. Die Berechnung wurde in diesem
Fall durchgeführt, da in der Versuchsreihe Blasenbildung an Einzelpartikeln gemessen
wurde und entsprechend nicht aus einer Messung auf die Blasenbildungswahrscheinlichkeit
geschlossen werden kann.
5µm

124 Ergebnisse
Blasenwahrscheinlichkeit
Bestrahlung [mJ/cm²]
Abbildung 4.3: Blasenbildungswahrscheinlichkeit an Silika-Magnetit-Absorbern in
Abhängigkeit von der Bestrahlung (527 nm; 1 Puls 280 ns).
Betrachtet man den Verlauf der Blasenbildungswahrscheinlichkeit, so wird daraus
deutlich, dass die Bestrahlung verdoppelt werden muss, um von der Blasenbildungsschwelle
in einer Probe mit vielen tausend Partikeln bis zu der Bestrahlung
zu gelangen, bei der an nahezu allen Partikeln Blasen entstehen. Man kann davon
ausgehen, dass an den Partikeln, an denen die Blasenbildung später einsetzt, ein
Siedeverzug bis zu Temperaturen, die doppelt so hoch wie der Siedepunkt liegen,
erreicht wurde. Die Blasen bilden sich an einem kleinen Oberflächenbereich der
Partikel. Von dort breiten sie sich um die Partikel aus. Bei niedrigen Energien
können Blasen induziert werden, die kleiner als die Partikel selbst sind (Abbildung
4.4).
a)
10 µm
b) c)
Abbildung 4.4: Silika-Magnetit-Partikel a) vor der Bestrahlung, b) während der
Bestrahlung mit Blasen, die in der Grössenordnung der Partikel sind und c) nach der
Bestrahlung (280 ns-Puls; 527 nm; 950 mJ/cm2 ).
Eine Fragmentierung der Partikel wurde bis hin zu Bestrahlungen, die 10-fach
über der Blasenbildungsschwelle lagen, nicht beobachtet. Dies gilt auch für eine

Ergebnisse 125
Bestrahlung mit 15 µs Ti:Sa Pulsen.
Detektion der Blasenbildungsschwellen bei Bestrahlung mit dem Ti:Sa-
Laser Die Blasenbildungsschwelle an SM-Partikelproben in Probenplatten wurde
entsprechend der Blasenbildungsschwelle bei Bestrahlung der PM-Partikel
über die Bewegung einzelner Partikel aufgrund von Blasenbildung gemessen. Die
Partikel in der Probe hatten einen Abstand von mehr als 50 µm zueinander. Die
Schwelle für die Bewegung von einzelnen Partikeln bei Bestrahlung mit dem Ti:Sa
Laser bei 800 nm mit 15 µs Pulsen wurde zu 1 J/cm2 gemessen. Die Schwelle
ist nicht direkt mit der ED50 Schwelle aus dem vorhergehenden Abschnitt vergleichbar,
da parallel an mehreren tausend Partikeln die Blasenbildungsschwelle
gemessen wurde. Da sich nur ca. jedes tausendste Partikel bewegte, entspricht
die Schwelle einer ED0.1 Schwelle. Eine ED50 Schwelle bei Bestrahlung mit dem
Ti:Sa Laser kann nach der in Abbildung 4.3 dargestellten Blasenbildungswahrscheinlichkeit
entsprechend bei ca. der doppelten Blasenbildungsschwelle, d.h. bei
2 J/cm2 erwartet werden. Die Tatsache, dass die ED50 Schwelle für Bestrahlung
mit 280 ns Pulsen und die ED0.1 Schwelle für 15 µs Pulse fast identisch sind, zeigt,
dass bei Bestrahlung mit den Mikrosekundenpulsen ca. die Hälfte der Energie
durch Wärmeleitung an die Umgebung abgegeben wird.
4.1.2 Gold-Nanoabsorber
Blasenbildung an Gold-Nanokonjugaten
Auch wenn einzelne 15 nm Goldpartikel als heterogene Blasenkeime dienen, wird
wegen der geringen Größe die Blasenbildung bis zu Temperaturen zwischen 270◦C und 300◦C nahe am spinoidalen Punkt verzögert. Die mit dem 280 ns Nd:YLF
Laser gemessenen Blasenbildungsschwellen sollten deshalb, wenn überhaupt nur
bei geringfügig niedrigeren Bestrahlungen liegen als die Blasenbildungsschwelle
bei den Bestrahlungen, die zur Enzym-Konjugatinaktivierung mit den 16 ns, den
6 ns und den 35 ps Pulsen eingesetzt wurden. Clusterbildung der Konjugate kann
diese Schwelle deutlich herabsetzen, da die in einem Cluster absorbierte Energie
im Vergleich zu Einzelpartikeln sehr viel schlechter abgegeben werden kann und
zusätzlich der Q-Faktor steigt, solange die Cluster unter 80 nm gross sind. Der

126 Ergebnisse
Anteil der Konjugate, die Cluster bilden, wurde durch eine Zentrifugation direkt
vor den Versuchen minimiert.
Die folgenden Aufnahmen zeigen jeweils 3 typische mikroskopische Aufnahmen
einer Suspension von Goldkonjugaten, die jeweils so hoch konzentriert war, dass
der mittlere Abstand der Partikel < 1 µm betrug. Die Partikel wurden mit einem
Puls der Halbwertsbreite 280 ns bei 527 nm bestrahlt. In der Bildreihe 4.5a
ist die Blasenbildung bei Bestrahlung mit 1 J/cm2 von unaufgereinigten Proben
aus 15 nm-BSA-Gold zu sehen. Es ist eine deutliche Blasenbildung im gesamten
Bestrahlungsareal zu beobachten, die von aggregierten Konjugaten hervorgerufen
wird. Dies konnte gezeigt werden, indem die Probe durch Ultrazentrifugation
von den Aggregaten weitestmöglich befreit wurde. In dieser aufgereinigten Probe
sind nur noch vereinzelt Blasen bei Bestrahlungen 12-fach über der Bestrahlung
zu sehen, bei der in unaufgereinigten Proben Blasen beobachtet wurden (Abbildung
4.5 b). Die Blasen haben einen maximalen Blasendurchmesser von 3 µm bei
dieser Bestrahlung von 12 J/cm2 , so dass man davon ausgehen kann, dass diese
Blasen von Partikelclustern aus wenigen Partikeln stammen.
Im Fall von 80 nm Goldpartikeln konnte eine Blasenbildung mit Blasendurchmessern
von > 10µm bei einer Bestrahlung von 12 J/cm2 nicht durch Aufreinigung
unterdrückt werden (Abbildung 4.5 c). Bei einer Bestrahlung von 1 J/cm2 nimmt
die Blasenanzahl ab und die Blasengröße sinkt (Abbildung 4.5 d). Bei beiden Bestrahlungen
treten die Blasen vereinzelt auf, so dass ebenfalls davon ausgegangen
werden kann, dass es sich um Blasen handelt, die von einzelnen Aggregaten aus
wenigen Partikeln hervorgerufen werden, die nicht durch Ultrazentrifugation abgetrennt
werden konnten.
In einer weiteren Versuchsreihe zur Blasenbildung durch Aggregate wurden diese
gezielt verursacht, indem unkonjugierte kationische Partikel auf einen Objektträger
verbracht wurden. Diese Partikel aggregierten an der Glasoberfläche. Dies
spiegelt sich deutlich in der Blasenbildung an der Glasoberfläche, die in Abbildung
4.5 e) zu sehen ist. Die Blasen sind scharf zu sehen und bilden sich damit
direkt an der Glasoberfläche. Es sind zudem vereinzelte aber deutlich mehr Blasen
als an zentrifugierten Proben zu sehen (Abbildung 4.5 e).

Ergebnisse 127
30 µm
15 nm-BSA-Gold
mit Aggregaten
1 J/cm²
a)
15 nm-BSA-Gold
aufgereinigt
12 J/cm²
b)
80 nm-BSA-Gold
aufgereinigt
12 J/cm²
c)
80 nm-BSA-Gold
aufgereinigt
1 J/cm²
d)
80 nm-Gold
Aggregate
auf Glas
1 J/cm²
e)
Abbildung 4.5: Mikroskopische Aufnahme von bestrahlten Goldproben. Dargestellt
sind jeweils 3 typische Aufnahmen von Blasenformen, die in den Proben beobachtet
werden konnten: a) 15 nm Gold nicht aufgereinigt 1 J/cm2 ; b) 15 nm Gold aufgereinigt
12 J/cm2 ; c) 80 nm Gold aufgereinigt 12 J/cm2 ; d) 80 nm Gold aufgereinigt 1 J/cm2 ;
e) 80 nm Goldaggregate an der Glasgrenzfläche 1 J/cm2 (280 ns-Puls; 527 nm).
Fragmentierung der Gold-Nanokonjugate
Erste Versuche zur Fragmentierung von Nanogoldpartikeln durch die Bestrahlung
wurden an 80 nm Goldpartikeln durchgeführt, da diese für 527 nm den höchsten
Q-Faktor besitzen und entsprechend an den Partikeln eine Fragmentierung bei

128 Ergebnisse
den niedrigsten Bestrahlungen erwartet werden kann. Nachdem die in Abbildung
4.6 gezeigten EM-Aufnahmen deutlich machten, dass bei den maximalen
Bestrahlungen, die mit dem Bestrahlungsaufbau realisiert werden konnten, die
80 nm Partikel vollständig fragmentiert werden, ist die Untersuchung der Fragmentierung
der 15 nm Partikel nach Bestrahlung mit ps-Pulsen im Detail erfolgt.
Die Fragmentgrösse der 80 nm Partikel nach Bestrahlung beträgt 10 nm und kleiner.
a
1000nm
Abbildung 4.6: Elektronenmikroskopische Aufnahme von bestrahlten und unbestrahlten
80 nm Goldkolloiden. Es wurden 10000 Pulse bei 54 mJ/cm2 appliziert (35 ps-
Pulse; 527 nm) a) 80 nm Partikel unbestrahlt; b) 80 nm Partikel bestrahlt.
Die Untersuchung der Bestrahlungsabhängigkeit der Fragmentierung der 15 nm
Partikel erfolgte entsprechend an einem EM mit höherer Auflösung, da sowohl
die Partikelfragmente kleiner als 5 nm sein konnten, als auch die Proteinhülle der
Partikel dargestellt werden sollte. Die 15 nm Partikel, aufgenommen mit einer
Auflösung von 5 nm, sind in Abbildung 4.7 dargestellt. Die Abbildungen zeigen
die Partikel nach einer Bestrahlung mit 35 ps Pulsen bei 527 nm mit 69 mJ/cm2 ,
55 mJ/cm 2 und 34 mJ/cm 2 sowie ohne Bestrahlung. Eine deutlich Zunahme frag-
mentierter Partikel kann oberhalb einer Bestrahlung von 55 mJ/cm2 beobachtet
werden.
b

Ergebnisse 129
50nm
Abbildung 4.7: Elektronenmikroskopische Aufnahme von mit 10000 Pulsen bestrahlten
15 nm Goldkonjugaten (35 ps-Pulse; 527 nm); a) 69 mJ/cm2 ;b)55mJ/cm2 ;c)
34 mJ/cm2 und d) 0 mJ/cm2 In der folgenden Bildreihe wird sowohl die geringe Variation zwischen den einzelnen
Partikeldurchmessern deutlich als auch die Beschichtung mit einer Proteinhülle,
die als helle Korona” um die Partikel sichtbar ist. Einzelne Proteine in
”
der Lösung sind als helle Flecken auf dem Bild zu erkennen. Eine Unterscheidung
nach Enzym oder BSA, das zur Stabilisierung der Proben genutzt wurde, ist nicht
möglich. Es kann jedoch angenommen werden, dass es sich bei den Proteinen auf
der Goldoberfläche um α-Chymotrypsin handelt, das für die Kopplung dieser Proben
genutzt wurde, da BSA in dem Lagerungspuffer keine stabilen Konjugate mit

130 Ergebnisse
Gold ausbildet. Nach Bestrahlung mit 69 mJ/cm2 oberhalb der Zerstörschwelle
der Partikel (Abbildung 4.8) ist auffällig, dass selbst die Partikelfragmente noch
teilweise mit Protein oder Proteinresten beschichtet sind. Um was für ein Protein
es sich dabei handelt, kann aufgrund der Bilder nicht bestimmt werden. Da
weder α-Chymotrypsin noch BSA bei den während der Bestrahlung genutzten
Pufferbedingungen spontan an die intakten Goldpartikel binden, ist es möglich,
dass es sich um gebundenes Chymotrypsin handelt.
a
b
15 nm
Abbildung 4.8: Jeweils 6 typische elektronenmikroskopische Aufnahmen von mit
10000 Pulsen bestrahlten 15 nm Goldkonjugaten (35 ps-Pulse; 527 nm) a) 69 mJ/cm2 ,
und b) unbestrahlten Konjugaten. Die Proteinhülle um die Konjugate ist in den Aufnahmen
auch nach Bestrahlung teilweise zu erkennen (Pfeil).
4.2 Sekundentemperatursprünge im Wasserbad
4.2.1 Denaturierungsrate von alkalischer Phosphatase
Um Raten für die thermische Denaturierung von alkalische Phosphatase in den
bei den Partikelexperimenten verwendeten Zeitbereich extrapolieren zu können,
wurden Wasserbad-Temperatursprung-Experimente an gelöstem Protein durchgeführt,
da die vorhandene Literatur keine zufriedenstellende Daten über die thermische
Denaturierungskinetik im zugänglichen Bereich bis zu wenigen Sekunden
lieferte. Der Aktivitätsverlust, gemessen nach dem Wasserbadtemperatursprung,
wurde als Maß für die Denaturierung des Enzyms genutzt. Die Experimente
wurden durchgeführt, indem die Proben für1s, 2s, 4s, 10s, 15s, 20s, 50s, 60s
und 120 s jeweils bei den Wasserbadtemperaturen 60 ◦ C, 65 ◦ C, 70 ◦ C, 75 ◦ C und
80 ◦ C erhitzt wurden. Für jede Temperatur wurde über einen exponentiellen Fit

Ergebnisse 131
die Denaturierungsrate kD(T ) bestimmt. In Abb. 4.9 ist diese Rate logarithmisch
über die inverse Temperatur in der Arrheniusdarstellung” aufgetragen. Die Feh-
”
lerbalken der Ordinate geben den Standardfehler an. Dies gilt, falls nicht anders
angegeben, für alle folgenden Diagramme für Grössen, die auf den Ordinaten
aufgetragen sind (Restaktivitäten, Raten).
Denaturierungsrate[s ]
-1
1
0.1
0.01
0.00280 0.00285 0.00290 0.00295 0.00300 0.00305
T -1
[K -1
Abbildung 4.9: Arrheniusdarstellung der Denaturierungsraten von in DEA-Puffer
gelöster Phosphatase (Wasserbad-Temperatursprung-Experimente mit einer Temperaturanstiegszeit
von

132 Ergebnisse
4.2.2 Einfluß der Enzym-Konjugatbindung
Einfluß der Bindung auf die thermische Denaturierungskinetik
Der Einfluß der kovalenten Bindungen der Proteine an die Mikropartikel auf die
thermische Denaturierung wurde an aP-PM-Absorbern und an Chymotrypsin-
SM-Absorberkonjugaten in Wasserbad-Temperatursprung-Experimenten untersucht.
aP-PM-Konjugate Restaktivitäten von alkalischer Phosphatase, die über eine
Tosylbindung (siehe Abschnitt 3.5.4) an PM-Absorber gebunden wurde, sind
in Abbildung 4.10 dargestellt. Die Proben wurden für 100 s in einem Wasserbad
erhitzt. Die Abbildung 4.10a zeigt die Denaturierung von alkalische Phosphatase
Lösung (1 µM) im Vergleich zu verdünnter alkalische Phosphatase -Konjugat-
Suspension (aP-PM-Konjugate). Der Puffer bestand aus einer reinen Salzlösung
ohne Proteinzusatz. In Abbildung 4.10b ist der Einfluß einer hohen Konzentration
von thermisch denaturierter, vollständig inaktivierter Phosphatase (5 mg/ml)
dargestellt. In beiden Fällen ergibt sich kein signifikanter Unterschied in den
Inaktivierungskurven von alkalische Phosphatase -Lösung im Vergleich zu aP-
PM-Konjugaten unter den verschiedenen Bedingungen.
Restaktivität [%]
100
80
60
40
20
Restaktivität [%]
0
a) 0 20 40 60 80 100
0
b) 0 20 40 60 80 100
T [°C]
T [°C]
Abbildung 4.10: Restaktivität von alkalischer Phosphatase nach Wasserbad-
Temperatursprüngen mit 100 s Dauer. a) Vergleich der Denaturierung von aP-PM-
Konjugaten (weiß) mit unkonjugierter alkalischer Phosphatase (schwarz) in Puffer; b)
Vergleich der Denaturierung von aP-PM-Konjugaten (weiß) in reinem Puffer und in
Puffer mit Zusatz von 5 mg/ml denaturiertem Protein (schwarz).
100
80
60
40
20

Ergebnisse 133
chymo-SM-Konjugate Der Einfluß der EDC-Kopplung (siehe Abschnitt 2.5.2)
auf die Inaktivierungskinetik von Chymotrypsin wurde an chymo-SM-Konjugaten
untersucht. Die Abbildung 4.11 zeigt die Denaturierung von verdünnter α-Chymotrypsin
Lösung (µM) im Vergleich zu verdünnter chymo-SM-Konjugat-Suspension nach
10 s Wasserbad-Temperatursprüngen. Dem PBS-Puffer wurden keine denaturierten
Proteine zugesetzt. Es ergibt sich kein signifikanter Unterschied in den
Inaktivierungskurven.
Restaktivität [%]
100
80
60
40
20
0
6 µm Silika-Chymotrypsinkonjugate
Chymotrypsinlösung
20
40
T [°C]
Abbildung 4.11: Restaktivität von Chymotrypsinlösung und chymo-SM-Konjugaten
nach 10 s Wasserbad-Temperatursprung-Exposition im Vergleich.
Bindungsstabilität
Die Stabilität der kovalenten Bindungen der Proteine an die mikrometergrossen
Absorber wurde untersucht, indem die Verteilung der Enzymaktivität auf die
Partikel und auf den Probenüberstand nach der Bestrahlung oberhalb der Blasenbildungsschwelle
gemessen wurde. Dies ist für aP-PM-Absorberkonjugate nach
Bestrahlung mit einem 6 µs Farbstofflaserpuls mit 1 J/cm2 ,für chymo-SM nach
Bestrahlung mit einem 15 µs Ti:Sa Puls mit 2.5 J/cm2 erfolgt. Hierfür wurden
die Partikel nach der Bestrahlung magnetisch an den Bestrahlungstöpfchenböden
festgehalten, während der Überstand abpipettiert wurde. Die Partikel wurden
60
80

134 Ergebnisse
anschließend in den Töpfchen 3 mal gewaschen. In dem partikelfreien Probenüberstand
konnte sowohl für die aP-PM-Konjugate als auch für die chymo-
SM-Konjugate keine Enzymaktivität im Rahmen der Fehler gemessen werden,
so dass danach maximal 5% der Enzyme von den Partikeln abgelöst wurden.
Das partikelhaltige Filtrat hat eine deutliche Enzymaktivität von >80% der Ursprungsaktivität
aufgewiesen, die aufgrund der Aufreinigungsverluste nicht weiter
quantifiziert wurde.
4.3 Photostabilität der Enzyme
Die Photostabilität der Enzyme alkalische Phosphatase und α-Chymotrypsin
wurde an Enzymlösung ohne Absorber unter Bestrahlung mit ps-Pulsen (527 nm;
35 ps) und ns-Pulsen (532 nm; 16 ns) gemessen. Abbildung 4.12 zeigt, dass bei
einer Bestrahlung mit 10000 Pulsen mit 50 mJ/cm2 20 % der Phosphatase inaktiviert
wurden. Eine Bestrahlung mit 10000 Pulsen mit jeweils 10 mJ/cm2 hatte
keinen inaktivierenden Effekt. Die maximale Bestrahlung von 3.5 J/cm2 (16 ns
Pulse; gaußähnliches Profil) hat weder bei alkalische Phosphatase -Lösung noch
bei Chymotrypsin-Lösung zu einer Inaktivierung geführt.

Ergebnisse 135
Restaktivität [%]
120
100
80
60
40
20
0
aP-ns
1 J/cm²
chymo-ns
1 J/cm²
aP-ps
10 mJ/cm²
chymo-ps
10 mJ/cm²
aP-ps
50 mJ/cm²
chymo-ps
50 mJ/cm²
Abbildung 4.12: Restaktivität von alkalische Phosphatase und von α-Chymotrypsin
nach Bestrahlung mit einem Nanosekundenpuls (16 ns; 532 nm) und 104 ps-Pulsen
(35 ps; 527 nm). Der stärkste Aktivitätsverlust trat mit 20% nach Bestrahlung von
alkalischer Phosphatase mit 104 Pulsen und 50 mJ/cm2 auf.
4.4 Bestrahlung der Mikrometerkonjugate
Bei der Bestrahlung der Mikrometerpartikel-Enzymkonjugate wurde die Inaktivierung
der Enzyme in Abhängigkeit von der Bestrahlung, der Pulszahl und dem
Zusatz von hitzdenaturiertem Protein als Pufferzusatz untersucht. Die Experimente
wurden zum Teil unter erhöhtem Druck durchgeführt. Durch den erhöhten
Druck kann eine höhere Temperatur auf der Partikeloberfläche ohne Blasenbildung
erreicht werden. Die Pulszahlabhängigkeit wurde gemessen, um eine Additivität
der Inaktivierung zu untersuchen. Da es ein Ziel der Untersuchungen
war, einen proteininhärenten irreversiblen Prozeß beobachten zu können, der unabhängig
von der Umgebung der Proteine ist, wurden die Untersuchungen erst an
Proben durchgeführt, ohne dem Puffer zerkochte Proteine zuzusetzten, die mit
den Enzymen aggregieren können. Um den Einfluß der Aggregation mit anderen
Proteinen auf die Inaktivierung zu demonstrieren, wurden anschließend einige
Messungen mit zugesetztem hochkonzentriertem denaturiertem Protein im Probenpuffer
durchgeführt. Die Erwartung war, dass entfaltete Proteinketten mit

136 Ergebnisse
in der Lösung befindlichen Polypeptidketten aggregieren und sich nicht reversibel
zurückfalten können. Im Folgenden wird der Zusatz von hitzedenaturiertem
Protein im Puffer als Aggregationsprotein” bezeichnet. Die Fehlerbalken in den
”
Ordinaten der folgenden Diagramme geben, falls nicht anders angegeben, die
Standardfehler der gemittelten Einzelmessungen an. Die Fehler in den Abszissengrößen
(Bestrahlung) geben die maximale Puls-zu-Puls-Schwankung an, da
für die thermische Denaturierung eine starke Temperaturabhängigkeit erwartet
wird und schon geringe Puls-zu-Puls-Schwankungen einen grossen Einfluß auf das
Ergebnis haben. Deshalb wurde der relative Fehler berechnet, der sich aus den
maximalen Puls-zu-Puls-Schwankungen des Lasers bezogen auf den Mittelwert
der Laserenergie ergibt.
4.4.1 Polystyren-Magnetitabsorber
Aufgrund der scharfen Grössenverteilung der Polystyren-Magnetitabsorber und
der einfachen Handhabung (siehe Abschnitt 3.5.4), zusammen mit der Erwartung,
dass eine Denaturierung unterhalb von 100◦C mit Mehrfachpulsen erzielt werden
kann, wurden die ersten Experimente zur laserinduzierten thermischen Denaturierung
von Proteinen auf Mikroabsorbern mit den 2.8 µm Dynabeads (aP-PM-
Konjugate), wie in Abschnitt 3.2.4 beschrieben, durchgeführt. Die Partikel wurden
mit dem Rhodamin 6G Laser mit 6 µs Pulslänge in Kunststoff-Lochplatten
bestrahlt. Es wurde die Abhängigkeit der Inaktivierung von der Bestrahlung, der
Pulszahl und von dem Zusatz von denaturiertem Protein gemessen.
Die Bestrahlung der aP-PM-Konjugate mit 1 Puls in Puffer ohne Zusatz von
Aggregationsprotein ergab keine Inaktivierung bis zur maximal erreichbaren Bestrahlung
von 1200 mJ/cm2 (Abbildung 4.13b). Die Partikel wurden bei Bestrahlungen
oberhalb der Blasenbildungsschwelle, die bei 590 mJ/cm2 lag, fragmentiert.
Aufgrund der erwarteten Additivität eines thermischen Schadens wurden Experimente
mit Mehrfachpulsen durchgeführt. Der Puls-zu-Puls-Abstand betrug
100 ms, so dass die mittlere Temperatur der gesamten Proben bei der Bestrahlung
in zu vernachlässigender Weise erhöht wurde. Die Bestrahlungsabhängigkeit
der Restaktivität von aP-PM-Konjugaten nach Bestrahlung mit 100 R6G Pulsen
ohne Aggregationsprotein als Pufferzusatz sind in Abbildung 4.13a dargestellt.

Ergebnisse 137
Restaktivität [%]
140
100
80
40
Blasenbildungsschwelle
0
410 470 530 590 650
a)
Bestrahlung [mJ/cm²]
b)
Restaktivität [%]
120
100
80
60
40
20
0
1 Puls
1200 mJ/cm²
100 Pulse
600 mJ/cm²
Abbildung 4.13: Restaktivität von aP-PM-Konjugaten nach Bestrahlung. a) Bestrahlung
mit 100 Pulsen ohne Aggregationsprotein b) 1 Puls; 1200 mJ/cm2 2fach
oberhalb der Blasenbildungsschwelle ohne Aggregationsprotein und 100 Pulse mit
600 mJ/cm2 an der Blasenbildungsschwelle mit Aggregationsprotein (5 mg/ml) als Pufferzusatz
(6 µs-Pulse; 600 nm).
100 Pulse haben zu keiner signifikanten Inaktivierung bis zur Blasenbildungsschwelle
und darüber geführt. Eine Bestrahlung mit 100 Pulsen mit 600 mJ/cm2 an
der Blasenbildungsschwelle hat auch mit Aggregationsproteinzusatz (Abbildung
4.13b) zu keiner Inaktivierung geführt. Eine Bestrahlung mit einem Puls bei
1200 mJ/cm2 hat ebenfalls zu keiner Inaktivierung geführt.
Nach einer weiteren Erhöhung der Pulszahl auf 1000 Pulse konnte eine Inaktivierung
von 20% an der Blasenbildungsschwelle beobachtet werden (Abbildung4.14).
Die Restaktivität nimmt mit zunehmender Bestrahlung auch oberhalb der Blasenbildungsschwelle
kontinuierlich ab. Die maximale Inaktivierung, die beobachtet
werden konnte, beträgt 60%.

138 Ergebnisse
Restaktivität [%]
120
100
80
60
40
20
aP-PM-Konjugate +
Aggregationszusatz
0
0 294 588 882 1176
Bestrahlung [mJ/cm²]
Blasenbildung
aP-PM-Konjugate
Abbildung 4.14: Inaktivierung von aP-PM-Konjugaten durch 1000 Pulse (6 µs;
600 nm) in Abhängigkeit von der Bestrahlung. Die Konjugate wurden mit Aggre-
”
gationsprotein“ (5 mg/ml) als Pufferzusatz (schwarz) und ohne Zusatz von Aggregationsprotein
bestrahlt (weiss).
Erst unter Zusatz von Aggregationsprotein in hoher Konzentration (5 mg/ml) ist
eine vollständige Inaktivierung unterhalb der Blasenbildungsschwelle nach einer
Bestrahlung mit 1000 Pulsen möglich. Die Restaktivität nimmt kontinuierlich
mit der Bestrahlung ab und erreicht bei einer Bestrahlung von 300 mJ/cm2 50%
der Ausgangsaktivität.
4.4.2 Silika-Magnetitabsorber
Da die Silika-Magnetit-Absorber (SM) im Gegensatz zu den Kunststoffpartikeln
auch bei höheren Temperaturen stabil sind, wurden mit ihnen Experimente in
einer Druckkammer mit Partikeloberflächentemperaturen bis zu 180◦C durchgeführt.
Versuche mit den Kunstoff-Magnetit-Absorbern (PM) sind in diesem
Temperaturbereich nicht mehr sinnvoll, da der Schmelzpunkt des Polystyren, in
das das Magnetit eingebettet ist, überschritten wird und die beobachtete Fragmentierung
der Partikel mutmaßlich auf eine thermische Zersetzung der Partikel
zurückzuführen ist. Aufgrund der längeren Pulsdauer und der höheren Stabilität

Ergebnisse 139
der Pulsenergie wurde für alle folgenden Bestrahlungsexperimente mit Mikrometerpartikeln
der Ti:Sa mit 15 µs Pulslänge als Bestrahlungslaser genutzt. In den
Experimenten wurden Glasprobenträger genutzt, damit keine Verschmelzung der
Partikel mit einem Kunststoffträger zu Artefakten führt.
Alkalische Phosphatase
Auch bei aP-SM-Konjugaten mit einem mittleren Partikeldurchmesser von 6 µm
konnte bei 1 bar Druck unter einer Bestrahlung mit einem einzelnen 15 µs Puls
weder unterhalb noch oberhalb der Blasenbildungsschwelle bei Bestrahlungen bis
zu maximal 2.5 J/cm2 die alkalische Phosphatase inaktiviert werden. Die Pulszahlabhängigkeit
der Inaktivierung unter 10 bar Druck bei einer Bestrahlung von
2.5 J/cm2 ist in Abbildung 4.15 dargestellt. Die Bestrahlung liegt ca. 2.5 fach
über der Bestrahlung, bei der bei 1 bar Blasen beobachtet wurden. Damit liegt
die Bestrahlung auch noch über der Schwelle von 1.8 J/cm2 , bei der aufgrund der
Siedepunkterhöhung von Wasser bei 10 bar Verdampfung erwartet wird.
Restaktivität [%]
120
100
80
60
40
20
0
200 600 1000
Pulszahl
Abbildung 4.15: Restaktivität von aP-SM-Konjugaten bei Temperaturen bis zu
180◦C unter 10 bar Druck nach einer Bestrahlung mit 1, 100 und 1000 Pulsen (15 µs-
Puls, 800 nm, 2.5 J/cm2 ).

140 Ergebnisse
Es konnte trotz der erwarteten deutlich höheren Temperaturen weder mit 1, 100
noch mit 1000 Pulsen eine Inaktivierung erreicht werden. Da die Grössenverteilung
der Partikel im Bereich von 500 nm bis 15 µm schwankte, ist es prinzipiell möglich,
dass kleine Partikel für eine Inaktivierung nicht ausreichend erhitzt wurden und
deshalb die Aktivität nicht reduziert wurde. Um dies auszuschließen, wurde ein
Versuch bei 1 bar Druck mit einer Partikelkonzentration durchgeführt, die eine
vollständige Lage auf den Probenböden bedeckt hat, so dass durch Wärmeleitung
die kleineren Partikel mit erhitzt wurden. Auch in diesem Fall konnte mit 1000
Pulsen und 2.5 J/cm2 keine Inaktivierung erzielt werden. Entsprechend kann
festgehalten werden, dass es ohne Aggregationsprotein zu keiner Denaturierung
der alkalischen Phosphatase auf den Partikeloberflächen durch 1000 Pulse kommt,
selbst wenn Bestrahlungen weit über der Blasenbildungsschwelle eingesetzt werden.
α-Chymotrypsin
Bestrahlungsexperimente mit 15 Mikrosekunden Pulsdauer wurden auch mit chymo-
SM-Konjugaten durchgeführt. Bei α-Chymotrypsin ist es aufgrund der von Pohl
veröffentlichten Ratenkonstanten für die thermisch induzierte Entfaltung (siehe
Abschnitt 2.2.1) möglich, dass eine Inaktivierung bei geringeren Temperaturen
als bei alkalischer Phosphatase einsetzt.
Um eine homogenere Grössenverteilung der Konjugate als bei den Experimenten
mit aP-SM-Konjugaten zu erhalten, wurde durch Filtration die Grössenverteilung
auf einen Bereich über 8 µm eingegrenzt.
Die Restaktivität von grössensortierten chymo-SM-Konjugaten nach Bestrahlung
mit Einzelpulsen in Abhängigkeit von der Bestrahlung bei Normaldruck ist in
Abbildung 4.16 dargestellt.

Ergebnisse 141
Restaktivität [%]
120
100
80
60
40
20
0
Blasenbildungsschwelle
0 0.5 1 1.5 2 2.5 3 3.5
Bestrahlung [J/ cm²]
Abbildung 4.16: Restaktivität von grössensortierten chymo-SM-Konjugaten >8 µm
bei 1 bar Druck bis zur Blasenbildungsschwelle und darüber (15 µs-Puls;800 nm).
Es konnte mit einem Puls keine Inaktivierung der Konjugate bis zur dreifachen
Blasenbildungsschwelle erzielt werden.
Konjugataktivitäten in Abhängigkeit vom Druck bei einer Bestrahlung von 2.5 J/cm 2
sind in Abbildung 4.17 gezeigt. Es konnte jedoch auch bei erhöhtem Druck bis
9 bar, d.h. mindestens 175◦C keine Inaktivierung nach Bestrahlung mit einzelnen
Pulsen gemessen werden.

142 Ergebnisse
Restaktivität [%]
120
100
80
60
40
20
0
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
Druck [bar]
Abbildung 4.17: Restaktivität von chymo-SM-Konjugaten in Abhängigkeit vom
Druck nach einem 15 µs Pulsbei2.5J/cm 2 (Siedetemperatur von 5 bar: 151 ◦ C; Siede-
temperatur von 9 bar: 175 ◦ C).
Zusammenfassend ließen sich auch α-Chymotrypsin -Konjugate nicht mit einem
15 µs Puls bei Temperaturen von mindestens 175◦C inaktivieren.
Um dennoch eine Inaktivierung von chymo-SM-Konjugaten zu erreichen, wurden
Bestrahlungen mit 1 und 100 Pulsen, unter 9 bar Druck und unter Zusatz von
Aggregationsprotein in 1.2 mm Durchmesser Glas-Probenträgern durchgeführt, so
dass die Bestrahlung durch den kleineren Probendurchmesser bis auf 10 J/cm2 erhöht werden konnte. Diese kleinen Volumina führen allerdings zu Pipettierfehlern
von 40% (siehe Abschnitt 3.4.3), so dass die Aussagen dieser Messungen nur
qualitativer Natur sind.
Die Restaktivität nach Bestrahlung mit einem Puls lag bei 70% (Abbildung 4.18)
und damit noch im Bereich der Meßfehler.

Ergebnisse 143
Restaktivität [%]
100
80
60
40
20
0
0 2 4 6 8 10
Bestrahlung [J/cm²]
50
0
Restaktivität [%] 100
1 Puls 100 Pulse
Abbildung 4.18: Inaktivierung von chymo-SM-Konjugaten unter Zusatz von Aggregationsprotein
und bei Bestrahlungen bis zu 10 J/cm2 , 9 bar und mit einem bzw. 100
Pulsen.
Eine Bestrahlung mit 100 Pulsen führte zu einer weiteren Verringerung der α-
Chymotrypsin -Aktivität bis auf 15%.
Zusammenfassend ist somit eine Inaktivierung von α-Chymotrypsin auf den Partikeloberflächen
bei Temperaturen von mindestens 175◦C innerhalb von 15 µs
nicht möglich. Eine Inaktivierung konnte nur unter Zusatz von Aggregationsprotein
bei hohen Bestrahlungen von über 6 J/cm2 nach 100 Pulsen beobachtet
werden.
4.5 Bestrahlung der Gold-Nanometerkonjugate
4.5.1 Nanosekundenpuls-Bestrahlung der Goldkonjugate
Die Bestrahlung der 15 nm Enzym-Gold-Konjugate mit Nanosekundenpulsen erfolgte
mit zwei verschiedenen Q-Switch Nd:YAG Lasern bei 532 nm. Die Bestrahlungen
von alkalische Phosphatase -Goldkonjugaten (aP-Au) und α-Chymotrypsin
Goldkonjugaten (chymo-Au) wurden mit dem MBB Laser mit einem gaußähnlichen
Strahlprofil durchgeführt. Chymo-Au wurde außerdem mit einem homogenen
Strahlprofil mit dem Continuum Laser bestrahlt. Alle Bestrahlungen wurden an
Probentropfen mit einem Durchmesser von 500 µm, die in der entwickelten Klimakammer
auf Objektträger aufgebracht worden waren (siehe Abschnitt 3.4.2),
durchgeführt.

144 Ergebnisse
Alkalische Phosphatase-Goldkonjugate
Die Bestrahlungsstärke der ersten Experimente zur Inaktivierung von aP-Au-
Konjugaten ist mit Hilfe der zu erwartenden Partikeltemperatur (siehe Abbildung
2.15) so gewählt worden, dass ein thermischer Schaden nach der Arrheniustheorie
in Absorbernähe zu erwarten war. Den Enzym-Goldkonjugaten wurde kein
Aggregationsprotein im Puffer zugesetzt.
Nach einer Bestrahlung mit einem Strahldurchmesser von 2 mm, der eine maximale
Modulation der Bestrahlungsstärke von 10% um den Mittelwert innerhalb
des Probentropfens und Bestrahlungen bis zu 600 mJ/cm2 erlaubte, konnte mit
Einzelpulsen keine Inaktivierung von alkalische Phosphatase festgestellt werden.
Deshalb wurde der Strahl des MBB sukzessive fokussiert, bis eine signifikante
Inaktivierung festzustellen war. Aufgrund der limitierten Pulsenergie des MBB
Lasers betrug die Bestrahlung am Rand der Proben dann nur noch 25% der
mittleren Bestrahlung.
Die unter diesen Bedingungen gemessene Inaktivierung der aP-Au-Konjugate in
Abhängigkeit von der Bestrahlung im Zentrum des gaussähnlichen Strahlprofils
ist in Abbildung 4.19 dargestellt.
Restaktivität [%]
100
80
60
40
20
100 Pulse aP-Au
1 Puls aP-Au
0
0 500 1000 1500 2000 2500 3000 3500 4000 4500
Bestrahlung [mJ/cm²]
Abbildung 4.19: Inaktivierung von 15 nm aP-Au-Konjugaten in Abhängigkeit von
der Spitzenbestrahlung mit 1 bzw. 100 Pulsen (Gaußähnlichen Profil, 532 nm, 16 ns).

Ergebnisse 145
Die Aktivität der Konjugate nimmt nach Bestrahlung mit einem Puls kontinuierlich
bis auf 35 % bei der maximalen Bestrahlung von 3500 mJ/cm2 ab. Um
eine Additivität des Effekts zu untersuchen, wurden Proben mit identischen Bestrahlungen
mit je 100 Pulsen bei 10 Hz bestrahlt. Die Restaktivität nimmt mit
der Bestrahlung ab, bis eine vollständige Inaktivierung bei der Bestrahlung von
3000 mJ/cm2 erreicht wird. Die Abhängigkeit der Inaktivierung von der Pulszahl
bei einer Bestrahlung von 3500 mJ/cm2 ist in Abbildung 4.20 dargestellt. Darin
wird deutlich, dass der erste Puls mit 65% den grössten Anteil zur Inaktivierung
beiträgt.
Restaktivität [%]
100
80
60
40
20
0
0 10 30 50 70
90 110
Zahl der Pulse
Abbildung 4.20: Restaktivität von aP-Au-Konjugaten in Abhängigkeit von der Pulszahl
bei einer Bestrahlung von 3500 mJ/cm2 (Gaußähnlichen Profil, 532 nm, 16 ns).
Chymotrypsin-Goldkonjugate
Auch Chymo-Au-Konjugate wurden mit dem glockenförmigen Strahlprofil (MBB-
Nd:YAG) bestrahlt. Die Ergebnisse sind in Abbildung 4.21 dargestellt. Die Aktivtät
der Chymo-Au-Konjugate nimmt wie im Fall der alkalische Phosphatase
Konjugate bei Verwendung von Einzelpulsen stetig mit der Bestrahlung ab. Bei
einer Bestrahlung von 2750 mJ/cm2 wurde die Aktivität der Konjugate bis auf
20% reduziert.
Durch Einsatz des leistungsstarken Continuum Lasers konnten die Chymo-Au-

146 Ergebnisse
Konjugate mit einem homogenen Strahlprofil bestrahlt werden. Hierfür wurde
der Strahl des Continuum Lasers durch die Raumfrequenzfilterung bis auf Restmodulationen
von 10% innerhalb des Probentropfens geglättet. Die Pulslänge
betrug 6 ns. Die Restaktivität der Konjugate nach Bestrahlung mit einem Puls
sind ebenfalls in Abbildung 4.21 dargestellt.
Restaktivität [%]
120
100
80
60
40
20
1 Puls
homogene
Bestrahlung
0
0 500
1000 1500 2000 2500 3000 3500
Bestrahlung [mJ/cm²]
1Puls gaussähnliche
Bestrahlung
Abbildung 4.21: 15 nm Chymotrypsin-Goldkonjugate, die mit einem glockenförmigen
(MBB; 16 ns; 532 nm) und einem homogenen Strahlprofil (Continuum; 6 ns; 532 nm)
bestrahlt wurden.
Die Abhängigkeit der Inaktivierung von der Bestrahlung unterscheidet sich für
das homogene Strahlprofil deutlich von dem mit einem inhomogenen Strahlprofil.
Bis zu einer Bestrahlung von 600 mJ/cm2 konnte keine Inaktivierung festgestellt
werden. Für höhere Bestrahlungen nimmt die Probenaktivität steil ab. Eine
vollständige Inaktivierung mit dem homogenen Strahlprofil wurde bereits bei
1000 mJ/cm2 beobachtet.
4.5.2 Pikosekundenpuls-Bestrahlung der Goldkonjugate
Für die Experimente zur Bestrahlung von 15 nm Enzym-Goldkonjugaten wurden
Pikosekundenpulse mit Pulshalbwertsbreiten von 35 ps bei 527 nm eingesetzt. Der

Ergebnisse 147
Pikosekundenlaser läuft auf der TEM00 Grundmode, so dass die Bestrahlung mit
dem Gaußschen Strahlprofil erfolgte.
Wird für eine homogene Bestrahlung der Proben das Gaußsche Strahlprofil so
weit aufgeweitet, dass nur noch Modulationen von 10% zu beobachten waren,
war die Bestrahlung auf maximal 2.1 mJ/cm2 begrenzt. Mit dieser Bestrahlung
wurde mit 10000 Pulsen sowohl bei aP-Au-Konjugaten als auch bei Chymo-Au-
Konjugaten keine signifikante Inaktivierung der Konjugate erreicht.
Alkalische Phosphatase Goldkonjugate
Um höhere Bestrahlungen zu erzielen, wurden die Proben mit einem stärker fokussierten
Strahl in 16 Feldern, wie in Abschnitt 3.2.5 dargestellt, abgescannt.
Beim Scannen der Proben in den Experimenten mit aP-Au-Konjugaten konnte
die Bestrahlung bis auf 54 mJ/cm2 erhöht werden. Die Abhängigkeit der Inaktivierung
von der Bestrahlung mit 500 bzw. 10000 Pulsen der aP-Au-Konjugate
ist in Abbildung 4.22 dargestellt. Als Bestrahlung ist der Maximalwert des Gaußschen
Strahlprofils auf der optischen Achse angegeben.
Restaktivität [%]
120
100
80
60
40
20
0
0
10 000 Pulse
10 20
500 Pulse
30 40 50 60 70
Bestrahlung [mJ/cm²]
Abbildung 4.22: Inaktivierung von aP-Au-Konjugaten in Abhängigkeit von der Bestrahlung
mit 500 und 10000 Pulsen; scannende Bestrahlung mit 4x4 Feldern; Wiederholrate
der Pulse 1 kHz (35 ps-Pulse; 527 nm).

148 Ergebnisse
Die Inaktivierung in Abhängigkeit von der Pulszahl wurde am Beispiel der aP-Au-
Konjugate genauer untersucht. Die Restaktivität sinkt mit der Anzahl der applizierten
Pulse. Dies ist in Abbildung 4.23 für die Bestrahlung von 54 mJ/cm2 dargestellt.
Restaktivität [%]
120
100
80
60
40
20
0
0 2000 4000 6000 8000 10000
Pulszahl
Abbildung 4.23: Inaktivierung von aP-Au-Konjugaten in Abhängigkeit von der Pulszahl
bei einer Bestrahlung mit 54 mJ/cm2 ; scannende Bestrahlung mit 4x4 Feldern;
Wiederholrate der Pulse 1 kHz (35 ps-Pulse; 527 nm).
α-Chymotrypsin -Goldkonjugate
Entsprechende Messungen zur Bestrahlungsabhängigkeit der Inaktivierung von
Chymo-Au-Konjugaten wurden ebenfalls durchgeführt. Die Abhängigkeit der
Aktivität der Proben von der Bestrahlung ist in Abbildung 4.24 für 500 und
10000 Pulse dargestellt. Die Zahl der Scanfelder mußte auf 8x8 Felder erhöht
werden, um Spitzenbestrahlungen von 50 mJ/cm2 und mehr erreichen zu können
(siehe Abschnitt 3.2.5).

Ergebnisse 149
Restaktivität [%]
120
100
80
60
40
20
10 000 Pulse
Bestrahlung [mJ/cm²]
500 Pulse
0
0 20 40 60 80 100
Abbildung 4.24: Inaktivierung von 15 nm Chymo-Au-Konjugaten in Abhängigkeit
von der Bestrahlung für 500 und 10000 Pulse; (scannende Bestrahlung mit 8x8 Feldern;
Wiederholrate der Pulse 1 kHz (35 ps Pulse; 527 nm).
Die Inaktivierung der Chymo-Au-Konjugate konnte bei vergleichbaren Bestrahlungen
wie bei der Inaktivierung der aP-Au-Konjugate gemessen werden. Die
Aktivität der Proben nimmt bei 104 Pulsen mit der Bestrahlung kontinuierlich
bis auf 25% bei der maximalen Bestrahlung von 78 mJ/cm2 ab. Im Fall der
Bestrahlung mit 500 Pulsen nimmt die Bestrahlung erst ab 50 mJ/cm2 ab und
erreicht bei 76 mJ/cm 2 fast die gleiche Restaktivität wie die mit 10 4 Pulsen be-
strahlten Proben.
4.5.3 Abstandsabhängigkeit der Inaktivierung
In den Versuchen mit ps-Pulsen konnte gezeigt werden, dass eine Inaktivierung
möglich ist. Das errechnete Temperaturprofil um ein 15 nm Goldpartikel, das
mit einem ps Puls erhitzt wurde, läßt eine räumliche Auflösung im Bereich einer
Proteinlage erwarten (siehe Abschnitt 2.4), sofern ausschliesslich ein thermischer
Effekt für den Schaden verantwortlich ist. Ein einfacher Versuch, mit dem diese
Hypothese überprüft werden konnte, war die Bestrahlung von Konjugaten, bei

150 Ergebnisse
denen Enzyme über zwei Antikörper (siehe Abschnitt 3.5.2) an das Gold gekoppelt
wurden (aP-Ak-Ak-Au). Die folgende Abbildung 4.25 zeigt die Inaktivierung
von alkalische Phosphatase -Goldkonjugaten, alkalische Phosphatase -Lösung ohne
Gold und von alkalischer Phosphatase, die in einem Abstand von mehr als
einem Antikörper an das Gold gebunden war. Die Experimente wurden bei der
Spitzenbestrahlung von 54 mJ/cm2 durchgeführt.
Restaktivität [%]
100
80
60
40
20
0
aP-Au 15nm aP-AK-AK-Au 15nm aP
Abbildung 4.25: Restaktivität von aP-Au-Konjugaten, aP-Lösung und aP, die über
zwei Antikörper als Abstandshalter an das Gold gekoppelt war (aP-AK-AK-Au), nach
Bestrahlung mit 10000 Pulsen; 54 mJ/cm2 ; scannende Bestrahlung mit 4x4 Feldern
(35 ps-Pulse; 527 nm).
Nur die direkt gekoppelten Enzyme wurden inaktiviert. Die Inaktivierung der
über 2 Antikörper gekoppelten alkalischen Phosphatase entspricht der Inaktivierung,
die bei dieser Bestrahlung auch ohne Gold hervorgerufen wird. Damit konnte
in dieser Experimentreihe gezeigt werden, dass es eine Abstandsabhängigkeit
der durch die Nanopartikel hervorgerufenen Inaktivierung im Nanometerbereich
gibt.

Ergebnisse 151
4.5.4 Diffusion der Konjugate
Um zu überprüfen, ob Diffusion der Kolloide in der Probe während scannender
Bestrahlung, die insgesamt etwa 3 Minuten je Probenkammer dauerte, die Messungen
beeinflusst, wurden verschieden große Areale (siehe Abbildung 4.26) einer
aP-Au-Probe mit gleicher Gesamtpulszahl abgescannt.
Abbildung 4.26: Schematische Darstellung des Bestrahlungsmusters zur Untersuchung
des Einflusses der Diffusion der Konjugate auf die Inaktivierung. Diffundieren
die Konjugate innerhalb der Bestralungszeit nicht, so sollte sich die Restaktivität für
die dargestellten Bestrahlungsmuster wie 1:2:16 verhalten.
Diffundieren die Partikel während des Experimentes nicht aus der bestrahlten
Fläche, so müsste die Inaktivierung nach der Bestrahlung proportional zum Anteil
des bestrahlten Areals sein. Wäre die Diffusion sehr schnell, so sollten alle drei
Bestrahlungsmuster die gleiche Inaktivierung aufweisen. Die Proben wurden mit
50 mJ/cm2 und je 16 × 10000 Pulsen bestrahlt.

152 Ergebnisse
Restaktivität [%]
100
90
80
70
60
50
40
30
20
10
0
50 mJ/cm²
40 mJ/cm²
25 mJ/cm²
theoretische Inaktivierung
bei vernachlässigbarer
Diffusion
0.2 0.4 0.6 0.8 1.0
Verhältnis von bestrahltem Areal zur Probenfläche
Abbildung 4.27: Die Inaktivierung der Konjugate ist proportional zu der bestrahlten
Fläche unabhängig vom Bestrahlungsmuster.
Die Messungen ergeben, dass die Inaktivierung im Rahmen der Fehler proportional
zur bestrahlten Fläche ist und somit die Diffusion der Konjugate während
der Bestrahlungsdauer keinen entscheidenden Einfluß hat.
4.6 Selektive Schädigung von Zellen
In einem ersten Versuchsansatz an Zellen wurde das Konzept der Mikroeffekte
daraufhin untersucht, selektiv einzelne Zellen, die mit Antikörper-Goldkonjugaten
markiert worden sind, abtöten zu können. Hierfür wurden Zellen genutzt, die
einen charakteristischen Oberflächenmarker besitzen. Wie in Abschnitt 3.8 beschrieben,
wurden die Zelllinien L428 und U937 genutzt, wobei die Zelllinie L428
das Oberflächenantigen CD30 trägt und die Zellinie U937 nicht. Die Zellen wurden
in den Bestrahlungsexperimenten mit Goldkonjugaten aus dem Antikörper
BerH2 und 15 nm Goldpartikeln (BerH2-Au) bei 37◦C im Brutschrank inkubiert.
Der Antikörper BerH2 ist gegen CD30 gerichtet. Als Kontrolle wurden die Zellen
mit Konjugaten aus dem Antikörper MIB-1 und 15 nm Goldpartikeln (MIB1-
Au) inkubiert. MIB-1 ist gegen das Kernprotein Ki-67 gerichtet, das auf der

Ergebnisse 153
Zellmembran in keiner Form vorkommen kann. Als weitere Kontrollen wurden
1.) die Zellen ganz ohne Goldkonjugate bestrahlt, um eine Schädigung durch die
Bestrahlung auszuschliessen und 2.) die Zellen nach der Inkubation mit Goldkonjugaten
vor der Bestrahlung einmal gewaschen und im Vergleich dazu mit
der hohen Konzentration von Goldkonjugaten im Puffer bestrahlt, die auch zur
Inkubation benutzt wurde, um einen Schaden durch frei im Puffer befindlichem
Gold auszuschließen.
Der Effekt auf die Zellen wurde in einer lebend-tot Anfärbung durchflusszytometrisch
gemessen. Hierfür wurden die Zellen mit dem DNA-Farbstoff Probidiumiodid
(PI) und dem Esterasensubstrat BCECF angefärbt. PI gelangt als sehr
kleines Molekül schon bei leichten Plasmamembranpermeabilisierungen durch die
Plasmamembran und färbt dann direkt, ohne von der Kernmembran behindert
zu werden, die DNA an. PI fluoresziert rot mit einem Maximum bei 610 nm. Das
Esterasensubstrat BCECF kann durch die intakte Plasmamembran diffundieren
und fluoresziert, nachdem es von den Esterasen umgesetzt wurde, grün. Außerdem
verändern sich in der umgesetzten Form die polaren Gruppen des Substrats,
so dass es nicht durch eine intakte Membran aus der Zelle herausdiffundieren
kann. In der durchflusszytometrischen Analyse können Zellen nach der Bestrahlung
nach Zellen aufgeteilt werden, die unterschiedliche Anteile von BCECF und
PI Fluoreszenz aufweisen. Eine starke PI Fluoreszenz zeigt eine permeabilisierte
Plasmamembran an. Die BCECF Fluoreszenz zeigt die Esterasenaktivität und
eine soweit intakte Membran an, dass weder die Esterasen noch der umgesetzte
Farbstoff aus der Zelle hinausdiffundieren können.
Abbildung 4.28 zeigt repräsentative Ergebnisse der Fluoreszenzsignale von L428
und U937 Zellen, die mit BerH2-Goldkonjugaten, MIB-1-Goldkonjugaten und
ohne Goldkonjugate inkubiert wurden, nach maximaler scannender Bestrahlung
(55 mJ/cm2 ).

154 Ergebnisse
Unbestrahlt Bestrahlt
tot
Unbestrahlt Bestrahlt
tot
lebend
lebend
L428 +
Berh2-Au
a) b)
U937 +
Berh2-Au
c) d)
tot
tot
lebend
lebend
L428 +
Berh2-Au
U937 +
Berh2-Au
Abbildung 4.28: Zwei-Parameter-Darstellung (Dot Plot) durchflußzytometrischer Signale
von bestrahlten und unbestrahlten Zellen die mit PI (tot) und BCECF (lebendig)
angefärbt wurden; a) L428 Zellen (CD30+), die mit BerH2-Gold (Anti-CD30) inkubiert,
aber nicht bestrahlt wurden; b) L428 Zellen, die mit BerH2-Gold inkubiert und
mit 54 mJ/cm2 bestrahlt wurden; c) U937 Zellen (CD30-), die mit BerH2-Gold inkubiert,
aber nicht bestrahlt wurden; d) U937 Zellen, die mit BerH2-Gold inkubiert und
mit 54 mJ/cm2 bestrahlt wurden.
In den Abbildungen 4.28 a), b) sind eine unbestrahlte und eine bestrahlte Probe
der mit BerH2-Gold (anti CD30) inkubierten L428 (CD30+) Zellen dargestellt,
in c), d) sind bestrahlte und unbestrahlte Proben von U937 Zellen als Kontrolle
dargestellt, die den CD30 Rezeptor nicht tragen. Für eine Auswertung der Ex-

Ergebnisse 155
perimente wurden mindestens zwei Areale definiert. Die Zellen mit einer hohen
Esteraseaktivität zeigen eine starke Fluoresceinfluoreszenz im grünen Spektralbereich
(x-Achse) und werden als lebend bezeichnet. Die Zellen mit einer niedrigen
Esteraseaktivität und einer hohen DNA-Anfärbung, die im Fluoreszenzkanal für
Licht im roten Spektralbereich (y-Achse) sichtbar werden, werden als geschädigt
oder tot bezeichnet. Als weiterer Parameter zur Identifizierung der Zellen wurde
das Streulicht gemessen. Zur Auswertung kamen nur Fluoreszenzsignale von Partikeln
bzw. Zellen, deren Vorwärts- und Seitwärtsstreuung in der Größenordnung
von Zellen lag. Kleine Zellfragmente wurden in der Auswertung entsprechend
nicht berücksichtigt. Wie deutlich in dem Beispielplots zu sehen ist, existieren
in den Messungen 5 % nicht angefärbte Zellen. Der Anteil toter Zellen vor der
Bestrahlung betrug in den ersten Pilotexperimenten (siehe Abbildung 4.29 und
4.30) 30%-50%. In diesen Experimenten wurde die Zellkultur noch optimiert. In
den darauffolgenden Experimenten lag der Anteil toter Zellen in der Zellkultur
bei normalen 10% bis 25%.
4.6.1 Selektivität und Effizienz der Zellschädigung
4.6.2 Zellschädigung in Abhängigkeit
von den Inkubationsbedingungen
Die Schädigung der CD30-positiven L428 Zellen, an deren Membran BerH2-Au-
Konjugate binden, wurde im ersten Schritt bei Zellkulturbedingungen (37◦C, 10%
CO2) zusammenmitdenKontrollenuntersucht. DieZellenwurdennach30min
Inkubationszeit gewaschen, so dass der Zellschaden nicht unspezifisch durch Gold
im Puffer hervorgerufen werden konnte. Die Zellen wurden in den Glaslochplatten
bestrahlt und 2 Stunden nach der Bestrahlung in 1,5 ml Färbungspuffer bei
Zimmertemperatur umgesetzt. Die Ergebnisse der Bestrahlungen sind in Abbildung
4.29 dargestellt. Die Balken geben den Anteil der Zellen in den definierten
Regionen toter bzw. lebendiger Zellen an der Gesamtzahl aller über das Streulicht
identifizierten Zellen an. Die Bestrahlung von 76 mJ/cm2 hat sich an der
Bestrahlung orientiert, die benötigt wurde, um Chymotrypsin zu inaktivieren.

156 Ergebnisse
Anteil der Zellen [%]
100
80
60
40
20
0
BerH2-Au
76 mJ/cm²
MIB1-Au
76 mJ/cm²
U937 lebend L428 lebend
U937 tot L428 tot
ohne-Au
76 mJ/cm²
ohne Au
0 mJ/cm²
Abbildung 4.29: Zellschädigungsanteil an L428 (CD30+) und U937 (CD30-) Zellen in
Abhängigkeit der Bestrahlung nach Inkubation der Zellen mit BerH2-Au (Anti CD30)
oder MIB-1-Goldkonjugaten (Anti Ki-67) bei 37◦C direkt nach der Bestrahlung; von
links nach rechts: Zellen, die mit BerH2-Au Konjugaten inkubiert und 76 mJ/cm2 bestrahlt
wurden;
Kontrollen: Zellen, die mit MIB1-Au Konjugaten inkubiert und 76 mJ/cm2 bestrahlt
wurden; Zellen, die mit 76 mJ/cm2 bestrahlt wurden; Zellen die nicht mit Goldkonjugaten
inkubiert und nicht bestrahlt wurden (scannende Bestrahlung; 35 ps Pulse;
532 nm).
In den Experimenten wurde trotz des Pilotexperimentcharakters aufgrund des hohen
Totanteils deutlich, dass die absorbervermittelte Schädigung der Zellen eine
selektive Methode zur Tötung von den Zellen darstellt, die einen zellspezifischen
Rezeptor tragen. L428 Zellen, die mit BerH2-Au inkubiert wurden, wurden zu
84% abgetötet. Es konnte auch eine partielle Schädigung von 20% der Kontrollzellen
U937, die mit MIB1-Au-Konjugaten inkubiert wurden, beobachtet werden.
In keinem der Kontrollexperimente ist es jedoch zu einer Schädigung der Zellen
gekommen, die der Schädigung bei zusammenpassender Rezeptor-Konjugat-
Kombination vergleichbar ist. Alle Proben wiesen einen relativ hohen Anteil von
toten Zellen auf, der auf die Zellkultur zurückzuführen ist.

Ergebnisse 157
4.6.3 ZelluläreEffekteinnerhalbvon24h
Da der Schaden eine hohe räumliche Präzision und die Reaktionsprodukte nach
der Bestrahlung keinen zytotoxischen Einfluß auf die Zellen haben sollten, wurden
die Zellen in allen folgenden Experimenten nach der Inkubation nicht mehr
gewaschen. Die Goldkonzentration in dem Probenpuffer war damit in den Proben,
in denen keine Konjugate an die Zellen binden sollten, so hoch, dass sich
ca. 1000 Konjugate in einer Entfernung von 100 nm zur Zelloberfläche befanden.
Da es in allen Versuchsreihen eine kleine Anzahl überlebender Zellen gab, stellte
sich die Frage, ob diese Zellen durch zeitverzögerte Effekte sterben. Entsprechend
wurden in einer Versuchsreihe die Zellen nach der Bestrahlung in 96-Well-Platten
unter Kulturbedingungen aufbewahrt und 24 h später untersucht. Innerhalb dieses
Zeitraums durchlaufen L428 Zellen unter Kulturbedingungen eine Zellteilung.
Die Ergebnisse sind in Abbildung 4.30 dargestellt.
Anteil der Zellen [%]
120
100
80
60
40
20
0
direkt nach
Bestrahlung
BerH2-Au
76 mJ/cm²
MIB1-Au
76 mJ/cm²
BerH2-Au
0 mJ/cm²
24h nach
Bestrahlung
BerH2-Au
76 mJ/cm²
MIB1-Au
76 mJ/cm²
tot
lebendig
BerH2-Au
0 mJ/cm²
Abbildung 4.30: Anteil geschädigter L428 Zellen in Abhängigkeit von der Bestrahlung
nach Inkubation der Zellen mit BerH2-Goldkonjugaten bei 37◦C; direkt nach der
Bestrahlung und 24 h nach der Bestrahlung.
Die Schädigung der Zellen direkt nach der Bestrahlung verhält sich prinzipiell genau
wie in den vorangehend beschriebenen Ergebnissen: Die L428 Zellen, die mit
dem passenden Antikörper-Gold-Konjugat inkubiert wurden, sind die einzigen,

158 Ergebnisse
dieeinestarkeSchädigung aufweisen. Die mit MIB1-Au-Konjugaten inkubierten
Zellen weisen eine schwache Schädigung von 20% auf. Auch 24 Stunden später
verändert sich der Effekt nicht. Es gab ein weiteres zeitverzögertes Sterben der
Zellen in den L428-BerH2-Au-Proben, in denen nach 24 h keine lebenden Zellen
mehr gemessen werden konnten. Die Kontrollproben haben sich dagegen in dieser
Zeit nicht wesentlich verändert, obwohl der Totanteil schon vor der Bestrahlung
hoch war.
Nach diesen Pilotexperimenten kann festgehalten werden, dass eine gezielte Schädigung
von Zellen durch die Verwendung von Goldkonjugaten, die selektiv an
einen für die Zellen charakteristischen membranständigen Rezeptor binden, möglich
ist. Die Zellen mit zu den Konjugaten passenden Rezeptoren sterben innerhalb
der ersten 24 h vollständig ab. Die Kontrollzellen, an die die Konjugate nicht
binden sollten, werden auch dann nicht abgetötet, wenn das Gold während der
Bestrahlung im Probenpuffer bleibt.
4.6.4 Einfluß der Inkubationstemperatur
Die Zellen veränderten sich im mikroskopischen Bild äußerlich bereits direkt nach
der Bestrahlung. Abbildung 4.31 zeigt L428 Zellen, die mit BerH2-Au inkubiert
wurden, direkt vor und 10 s nach der Bestrahlung. Es ist deutlich eine Abnahme
des Kontrastes und eine Grössenveränderung zu beobachten.

Ergebnisse 159
a)
Abbildung 4.31: Aufnahme der L428 Zellen in dem Bestrahlungsaufbau direkt vor
(a) und direkt nach (b) der Bestrahlung. Nach der Bestrahlung nimmt der Kontrast
der Zellen ab und die Größe zu. Zum einfacheren Größenvergleich sind 2 Hilfslinien
eingezeichnet.
Diese Veränderung der optischen Eigenschaften deutet auf einen Membranschaden
hin. Entsprechend wurde in den folgenden Versuchen die Beteiligung der
Plasmamembran an dem zellabtötenden Effekt näher untersucht, indem die Inkubation
und Bestrahlung der Proben bei Zellkulturbedingungen bzw. auf Eis
durchgeführt wurden. Die Hypothese war, dass die Fluidität der Plasmamembran
und der Zellmetabolismus auf Eis so weit heruntergesetzt werden, dass die
Zellen keine Konjugate internalisieren und in Lysosomen aufnehmen können. Der
Zellschaden sollte in diesem Fall in erster Linie durch einen Schaden der Plasmamembran
hervorgerufen werden. Bei einer Inkubation unter Zellkulturbedingungen
bei 37◦C ist es denkbar, dass die Zellen einen Teil der Konjugate in Lysosomen
aufnehmen und während der Bestrahlung die Lysosomen zerstört und so ein
Zellschaden hervorgerufen wird.
Die Abhängigkeit des Effekts von der Bestrahlung gibt neben der Inkubationstemperatur
weitere Hinweise auf den Schadensmechanismus und wurde für Inkubation
bei 37◦C und auf Eis gemessen. Einzelne durchflusszytometrische Messungen
für Bestrahlungen von 0 mJ/cm 2 bis 76 mJ/cm 2 der Experimentreihen unter 0 ◦ C
und 37 ◦ C sind in Abbildung 4.32 dargestellt.
b)

160 Ergebnisse
a)
PI Fluoreszenz (650 nm LP)
PI Fluoreszenz (650 nm LP)
b)
10 4
10 3
10 2
0 10 1
10 4
10 3
10 2
0 10 1
2
5
2
5
0 [mJ/cm²] 19 [mJ/cm²] 38 [mJ/cm²] 76 [mJ/cm²]
10 2
3
3
4
1
10 3
0 10
BCECF Fluoreszenz (520 nm)
1
4
1
10 4
10 3
10 2
0 10 1
2
5
1
10 4 10 0
2
5
3
3
4
0 10
BCECF Fluoreszenz (520 nm)
1
0 [mJ/cm²] 9 [mJ/cm²] 28 [mJ/cm²] 38 [mJ/cm²]
10 2
10 3
0 10
BCECF Fluoreszenz (520 nm)
1
10 4
10 4
10 3
10 2
0 10 1
10 2
10 2
10 3
4
1
10 3
0 10
BCECF Fluoreszenz (520 nm)
1
10 4
10 4
10 4
10 3
10 2
1
10 4
10 3
10 2
0 10 1
2
5
2
5
10 2
3
3
4
1
10 3
0 10
BCECF Fluoreszenz (520 nm)
1
4
1
10 4
0 10
BCECF Fluoreszenz (520 nm)
1
10 2
10 3
10 4
10 4
10 3
10 2
0 10 1
10 4
10 3
10 2
0 10 1
5
2
5
2
3
10 2
3
4
1
10 3
0 10
BCECF Fluoreszenz (520 nm)
1
10 2
4
1
10 3
0 10
BCECF Fluoreszenz (520 nm)
1
Abbildung 4.32: Durchflußzytometersignale von L428 Zellen, die mit BerH2-Au-
Konjugaten inkubiert wurden direkt nach Bestrahlung mit BCECF/PI Färbung; a) Zellen
die bei 37◦C inkubiert und bestrahlt wurden, zeigen eine Anfärbung in Abhängigkeit
von der Bestrahlung, bei der mit zunehmender Bestrahlung die PI Fluoreszenz zunimmt,
wobei parallel die Esterasensubstratfluoreszenz abnimmt. b) Zellen die auf Eis
inkubiert und bestrahlt wurden, nehmen PI auf bevor die Esterasensubstratfluoreszenz
abnimmt. Zur Auswertung wurden die Signale in 5 Regionen aufgeteilt: Region
1 lebend (schwache PI-, starke BCECF-Anfärbung), Region 2 tot (starke PI-, schwache
BCECF-Anfärbung), 2 Zwischenzustände Region 4 (starke PI-, starke BCECF-
Anfärbung) und Region 3 (PI- und BCECF-Anfärbung auf der Verbindungslinie der
Schwerpunkte der Areale tot und lebend), Region 5 Probenverunreinigungen und ruhende
Zellen (schwache PI-, schwache BCECF-Anfärbung).
Der Zellanteil für unterschiedliche Anfärbungen wurde wie folgt in fünf Regionen
aufgeteilt: Region 1 lebend (schwache PI-, starke BCECF-Anfärbung), Region
2 tot (starke PI-, schwache BCECF-Anfärbung), 2 Zwischenzustände Region
4 (starke PI-, starke BCECF-Anfärbung) und Region 3 (PI- und BCECF-
Anfärbung auf der Verbindungslinie der Schwerpunkte der Areale tot und lebend),
Region 5 Probenverunreinigungen und ruhende Zellen (schwache PI-, schwache
BCECF-Anfärbung).
Der Verlauf der zweiparametrischen Auftragung der Zellfluoreszenzen in Ab-
10 4
10 4

Ergebnisse 161
hängigkeit von der Bestrahlung unterscheidet sich für die Inkubationen auf Eis
im Vergleich zu der Inkubation bei 37◦C. Im Fall der auf Eis bestrahlten Zellen nahm mit der Bestrahlung zuerst die PI
Fluoreszenz zu, während die Esterasenfluoreszenz sukzessive abnahm. Im Fall
der temperiert bestrahlten Zellen nahm die Esterasensubstratfluoreszenz etwa in
dem Maß ab, wie die PI Fluoreszenz zunahm. Um diesen Trend zu quantifizieren,
wurde der Anteil der Zellen in den Zellregionen 1-5 bestimmt.
Abbildung 4.33 zeigt den Lebendanteil der L428 Zellen nach der Inkubation mit
BerH2-Au und Bestrahlungen unter Zellkulturbedingungen. D.h. der Anteil an
Zellen, die eine Anfärbung mit hoher Esterasensubstratfluoreszenz und ohne PI
Fluoreszenz aufweisen, die den unbestrahlten Kontrollzellen entspricht. Da sich
das Anfärbungsverhalten der auf Eis inkubierten und bestrahlten Zellen so weit
von dem Anfärbungsverhalten der unter Zellkulturbedingungen angefärbten Zellen
unterscheidet, wurde die Definition des Tot- und Lebendanteils verändert.
Aus diesem Grund ist nur der Lebendanteil dargestellt, der mit dem Lebendanteil
der Ergebnisse der Pilotversuche am besten übereinstimmt.

162 Ergebnisse
Anteil lebender Zellen [%]
100
90
80
70
60
50
40
30
20
10
0
BerH2-Au
76 mJ/cm²
L428
U937
BerH2-Au
76 mJ/cm²
BerH2-Au
0 mJ/cm²
ohne Au
76 mJ/cm²
Abbildung 4.33: Ergebnisse der Versuchsreihen zur laserinduzierten Schädigung von
L428 Zellen (CD30+) mit BerH2-Goldkonjugaten (anti-CD30) nach einer Inkubation
und Bestrahlung bei 37◦C. Dargestellt sind die Ergebnisse von Versuchen direkt nach
der Bestrahlung. Als Kontrollen wurden Zellen nicht bestrahlt bzw. nicht mit Goldkonjugaten
inkubiert und wurden U937 Zellen (CD30-) mit BerH2-Au inkubiert und
bestrahlt.
Die beobachtete Zellabtötung war wie in den vorhergehenden Experimenten selektiv.
Die Effizienz des Effekts von 95% Abtötung direkt nach der Bestrahlung
bei Inkubation mit dem passenden Konjugat lässt sich in diesen Experimenten
besser ablesen als in den vorhergehenden, da die Zellkultur neu angesetzt wurde
und der Totanteil auf 10 bis 20% in der Zellkultur reduziert werden konnte.
Die zu diesen Experimenten durchgeführte Vergleichsmessung bei einer Inkubation
und Bestrahlung der Zellen auf Eis ist in Abbildung 4.34 dargestellt.

Ergebnisse 163
Anteil lebender Zellen [%]
100
90
80
70
60
50
40
30
20
10
0
L428
U937
BerH2-Au
58 mJ/cm²
BerH2-Au
58 mJ/cm²
BerH2-Au
0 mJ/cm²
ohne Au
58 mJ/cm²
Abbildung 4.34: Ergebnisse der Versuchsreihen zur laserinduzierten Schädigung von
L428 Zellen (CD30+) mit BerH2- Goldkonjugaten (anti-CD30) nach einer Inkubation
und Bestrahlung bei 0◦C. Dargestellt sind die Ergebnisse von Versuchen direkt nach
der Bestrahlung. Als Kontrollen wurden Zellen nicht bestrahlt bzw. nicht mit Goldkonjugaten
inkubiert. Ebenso wurden U937 Zellen (CD30-) mit BerH2-Au inkubiert
und bestrahlt.
Die Schädigungen sind vergleichbar zu den Ergebnissen einer Inkubation bei 37◦C. Die Schädigung der U937 Kontrollzellen ist im Vergleich zu den bei 37◦C inkubierten
und bestrahlten Zellen auffällig gering.

164 Ergebnisse
Im Folgenden werden die Ergebnisse als Zellanteile in den Regionen lebend, tot
und in 3 Zwischenzuständen dargestellt. Die Zellen, die bei 37◦C, d.h. bei aktivem
Stoffwechsel inkubiert und bestrahlt wurden, weisen eine abnehmende BCECF
Färbung bei gleichzeitger Zunahme der PI Färbung mit der Bestrahlung auf. Für
die hohen Bestrahlungen von 76 mJ sind alle Zellen tot.
Zellanteil[%]
80
60
40
20
lebende Zellen (Region1)
tote Zellen (Region2)
Zellanteil[%]
60 Region 3
Region 4
40
Region 5
0
0
0 10 20 30 40 50 60 70 80 0 10 20 30 40 50 60 70 80
Bestrahlung [mJ/cm²]
Bestrahlung [mJ/cm²]
Abbildung 4.35: Anteil geschädigter Zellen in Abhängigkeit von der Bestrahlung
nach Inkubation der Zellen mit BerH2- Goldkonjugaten unter Kulturbedingungen.
Bei den gekühlten Zellen ist der Großteil der Zellen in den Zwischenzuständen
mit einer größeren Menge PI beladen (Region4).
Zellanteil [%]
80
60
40
lebende Zellen (Region1)
tote Zellen (Region2)
20
10
0
0 10 20 30 40 50 60 70 80
Bestrahlung [mJ/cm²]
Zellanteil[%]
20
60
50
40
30
20
10
0
Region 3
Region 4
Region 5
0 10 20 30 40 50 60 70 80
Bestrahlung [mJ/cm²]
Abbildung 4.36: Anteil geschädigter Zellen in Abhängigkeit von der Bestrahlung
nach Inkubation der Zellen mit BerH2- Goldkonjugaten auf Eis.
Die Abnahme des Anteils der lebenden” (d.h. gegenüber der nicht bestrahlten
”
Kontrolle unverändert angefärbten Zellen) in Abhängigkeit von der Bestrahlung
ist für die beiden Inkubationsbedingungen 0 ◦ Cbzw. 37 ◦ C nicht signifikant un-
terschiedlich (Abbildung 4.35 und Abbildung 4.36).
Die Ergebnisse der beiden Versuchsansätze unterscheiden sich jedoch in ihren Anteilen
an Zellen in den Regionen 3, 4 und 5 in Abhängigkeit von der Bestrahlung.

Ergebnisse 165
Diese Regionen stellen ein Übergangsstadium zwischen eindeutig lebenden und
toten Zellen dar. In den unter Kulturbedingungen bestrahlten Proben Abbildung
4.35 nimmt der Anteil der Zellen in Region 3, der Region mit gleichmäßig abnehmender
Esterasenaktivität und kontinuierlich zunehmender PI Fluoreszenz,
mit der Bestrahlung erst zu und ab 50 mJ/cm2 wieder ab. Bei der maximalen
Bestrahlung von 76 mJ/cm2 erreicht der Wert unter 5%.
Im Fall der auf Eis bestrahlten Zellen (Abbildung 4.36) nimmt zuerst die PI Fluoreszenz
zu und dann sukzessive die Esterasensubstratfluoreszenz ab. Dies spiegelt
sich in dem ansteigenden Anteil der Zellen in Region 4 wieder. Die Proben wurden
in dieser Meßreihe nur bis zur Maximalbestrahlung von 48 mJ/cm2 bestrahlt,
so dass der Schaden im Bereich subletaler Bestrahlungen besser dargestellt wurde.
Der zu erwartende Abfall des Anteils der Zellen in Region 4 zu höheren
Bestrahlungen analog zu dem Abfall der Zellen in Region 3 bei Bestrahlung bei
37◦C wurde demnach nicht beobachtet.
Das unterschiedliche Färbungsverhalten bleibt über 10 Stunden erhalten, was an
den überschüssigen Zellen, die 10 Stunden in der Färbungslösung bei Raumtemperatur
geblieben sind, zu sehen ist.

166 Ergebnisse
a)
b)
PI Fluoreszenz (650 nm LP)
PI Fluoreszenz (650 nm LP)
10 4
10 3
10 2
0 10 1
10 4
10 3
10 2
0 10 1
0 [mJ/cm²] 19 [mJ/cm²] 38 [mJ/cm²] 76 [mJ/cm²]
10 2
10 3
0 10
BCECF Fluoreszenz (520 nm)
1
10 4
10 4
10 3
10 2
0 10 1
10 2
10 3
0 10
BCECF Fluoreszenz (520 nm)
1
10 4
0 10
BCECF Fluoreszenz (520 nm)
1
0 [mJ/cm²] 9 [mJ/cm²] 28 [mJ/cm²] 38 [mJ/cm²]
10 2
10 3
0 10
BCECF Fluoreszenz (520 nm)
1
10 4
10 4
10 3
10 2
0 10 1
10 2
10 3
0 10
BCECF Fluoreszenz (520 nm)
1
10 4
10 4
10 3
10 2
0 10 1
10 4
10 3
10 2
0 10 1
10 2
10 2
10 3
10 3
0 10
BCECF Fluoreszenz (520 nm)
1
10 4
10 4
10 4
10 3
10 2
0 10 1
10 4
10 3
10 2
0 10 1
10 2
10 3
0 10
BCECF Fluoreszenz (520 nm)
1
10 2
10 3
0 10
BCECF Fluoreszenz (520 nm)
1
Abbildung 4.37: Durchflußzytometersignale von L428 Zellen, die mit BerH2-Au-
Konjugaten inkubiert wurden 10 Stunden nach Bestrahlung mit BCECF/PI Färbung;
a) Zellen die bei 37◦C inkubiert und bestrahlt wurden, zeigen eine Anfärbung in
Abhängigkeit von der Bestrahlung, bei der mit zunehmender Bestrahlung die PI Fluoreszenz
zunimmt, wobei parallel die Esterasenfluoreszenz abnimmt. b) Zellen die auf
Eis inkubiert und bestrahlt wurden, nehmen PI auf, bevor die Esterasensubstratfluoreszenz
abnimmt.
Abbildung 4.37b) zeigt durchflußzytometrische Messungen von auf Eis inkubierten
und bestrahlten Zellen, Abbildung 4.37a) zeigt die entsprechenden Signale
von bei 37◦C inkubierten und bestrahlten Zellen.
Zusammenfassend unterscheiden sich die Schädigung der Zellen nach einer Inkubation
mit Nanogoldkonjugaten und Bestrahlung auf Eis bzw. unter Kulturbedingungen
bei 37◦C darin, dass die Abnahme der Esterasenaktivität der auf
Eis bestrahlten Zellen erst bei höheren Bestrahlungen zu beobachten ist. Die
PI-Fluoreszenz nimmt bei beiden Inkubationsbedingungen in vergleichbarer Weise
mit der Bestrahlung zu. Die Verteilung der Zellen auf die unterschiedlichen
Anfärbungsregionen bleibt über mehrere Stunden stabil.
10 4
10 4

Kapitel 5
Modellierung der Schäden
5.1 Partikeltemperaturen und -fragmentierung
Für die Auswertung und Deutung der Experimente ist eine Abschätzung der
während der Bestrahlung auftretenden Partikeltemperaturen erfolgt. Da eine
direkte Messung nicht möglich war, wurden die erwarteten Temperaturverläufe
mit der analytischen Lösung der Wärmeleitungsgleichung berechnet (siehe Abschnitt
2.4). Die Temperaturrechnung beruht auf aus der Literatur entnommenen
Werten für die Dichte ρ, dieWärmekapazität cp und der Wärmeleitfähigkeit K
der Partikel und des Wassers. Die absorbierte Energie ∆Q pro Partikel kann
durch den Absorptionskoeffizienten µa oder über den Q-Faktor angegeben werden,
der das Verhältnis von optischem zu geometrischem Querschnitt der Partikel
angibt. Ist der komplexe Brechungsindex gut genug bekannt, so kann die Absorption
pro Partikel auch nach der Mie-Theorie berechnet werden (siehe Abschnitt
2.5.1).
Für die Temperaturrechnungen wurden die physikalischen Parameter der Partikel
und von Wasser bei Zimmertemperatur eingesetzt. Veränderungen der physikalischen
Parameter der beteiligten Materialien durch die Bestrahlung und Temperaturerhöhung
wie z. B. Phasenübergänge, temperaturabhängige Veränderungen
des Brechungsindex’ oder Temperaturabhängigkeiten in der Wärmeleitung wurden
nicht berücksichtigt.
Die Werte von cp,ρ und K der mikrometergroßen Absorber waren nicht bekannt
und wurden von den Grundmaterialien ausgehend abgeschätzt. Die Abschätzung
167

168 Schadensmodellierung
Material ρ[g/cm 3 ] cp[J/gK] K[W/Km]
Wasser 1 4.19 0.561
Gold 19.3 0.129 318
Tabelle 5.2: Dichte, spezifische Wärmekapazität und Wärmeleitfähigkeit von Gold
und Wasser.
erfolgte anhand der Massenanteile, indem die cp,ρ und K den Massenanteilen
nach gemittelt wurden. Für die Polystyrenpartikel, die zu 12% aus Magnetit
und zu 88% aus Polystyren bestehen, ergeben sich die in der folgenden Tabelle
aufgelisteten Werte. Dabei sind ρ die Dichte, cp die spezifische Wärmekapazität
und K die Wärmeleitfähigkeit.
Material ρ[g/cm 3 ] cp[J/gK] K[W/Km]
Polystyren 0.906 1.75 0.033
SiO2 2.196 0.74 0.85
Magnetit 6.6 0.45 7
Dynabead 1.59 0.61 0.87
SikaM 2.76 0.70 1.65
Tabelle 5.1: Dichte, spezifische Wärmekapazität und Wärmeleitfähigkeit der Mikropartikel
und der Grundmaterialien.
Die Wärmeleitungseigenschaften der Silikapartikel wurden wie bei den Kunststoffpartikeln
unter Benutzung der Wärmeleitfähigkeit von eisenhaltigem Glas
abgeschätzt [112]. Für die Partikel, die zu 13% aus Magnetit und zu 87% aus Silikat
bestehen, ergeben sich die in der vorangehenden Tabelle aufgelisteten Werte.
Für Wasser und Gold wurden die in der folgenden Tabelle aufgelisteten Parameter
bei der Temperaturberechnungen genutzt.
Die Absorption pro Partikel lässt sich am besten als Q-Faktor angeben. Für die
Rechnungen wurden die Q-Faktoren aus der folgenden Tabelle eingesetzt.
In den folgenden Abschnitten wird die Temperaturverteilung und der Temperaturverlauf
für Bestrahlungsexperimente mit Mikro-, Nano- und Pikosekundenlasern
dargestellt.

Schadensmodellierung 169
Material Q-faktor
Gold 0.7
PM-Partikel 0.28
SM-Partikel 0.74
Tabelle 5.3: Verhältnis von optischem zu geometrischem Querschnitt (Q-Faktor) der
Partikel.
5.1.1 Temperaturverlauf auf Mikropartikeln
Zur Berechnung des Temperaturverlaufs auf den Mikropartikeln wurde mit Hilfe
der Wärmeleitungsgleichung 2.4 die Lösung der Greenfunktion an der Partikeloberfläche
von 2.8 µm PM-Absorbern und 8 µm SM-Absorbern berechnet. Durch
Faltung mit dem normierten 15 µs Pulsverlauf des Ti:Sa wurden anschließend die
Temperaturerhöhung pro mJ/cm2 Bestrahlung berechnet. Der berechnete Temperaturverlauf
auf der Partikeloberfläche von 6 µm SM-Konjugaten ist in Abbildung
5.1 dargestellt. Die Temperaturabschätzungen mit diesen Rechnungen nur
bis zur Blasenbildungsschwelle sinnvoll. Die Rechnung für SM-Absorber zeigt den
2
T [K/(mJ/cm )]
0.15
0.125
0.1
0.075
0.05
0.025
0
0µm
1µm
2µm
10 20 30 40 50
t [µs]
Abbildung 5.1: Temperaturverlauf auf der Absorberoberfläche von 6 µm Silika-
Magnetit-Absorbern, in 1 µm und 2 µm Entfernung; Bestrahlung mit 15 µs Ti:Sa Puls.

170 Schadensmodellierung
Temperaturverlauf solcher Partikel im Mikrometerbereich. Die relativ lange thermische
Relaxationszeit der Partikel im Verhältnis zu den Intensitätsmodulationen
des Ti:Sa Lasers glättet den Temperaturverlauf. Die Temperatur ist erst in 2 µm
Entfernung von der Partikeloberfläche auf 20% abgefallen, so dass ein relativ
großes Volumen durch Wärmeleitung erhitzt wird. Die Temperaturen an der
OberflächevonPM-Absorbernmit2.8µmDurchmesser sind vom prinzipiellen
Verlauf her vergleichbar. Die Maximaltemperatur, die an der Oberfläche durch
6 µs Farbstofflaserpulse induziert wird beträgt 0.3 K/(mJ/cm2 ), in 2 µm Entferung
beträgt sie 0.15 K/(mJ/cm2 ).
Diese prinzipiellen Abhängigkeiten lassen sich mit Hilfe der Rechnungen gut darstellen.
Bei der Berechnung der absoluten Temperaturen ergeben sich jedoch
Fehler, die wie folgt abgeschätzt werden können. Die Berechnung von cP ,ρ
und K über eine Mittelung nach den Massenanteilen der Grundsubstanzen ist
problematisch, da schon geringe Beimischungen von einer Fremdsubstanz die
Wärmeleitung von Materialien stark verändern können, wenn die Beimischungen
auf atomarer Ebene in die Grundsubstanz eingebaut werden. Deutlich wird dies
am Beispiel von Metalllegierungen bzw. Gläsern, deren thermische Leitfähigkeit
als reine Grundsubstanz im Vergleich zur Legierung um den Faktor 2 variieren
können [112]. Im Fall von SiO2 reduziert sich die Wärmeleitfähigkeit unter Zusatz
von Fe2O3 zu 20% und Na2O zu 18% von 1.5 W/Km auf 0.95 W/Km bei
100◦C [112]. Außerdem variiert die Wärmeleitung in Abhängigkeit von der Temperatur
jeweils selbst. So verändert sich z. B. die thermische Leitfähigkeit von
Glas (SiO2) von -150◦C bis zu 100◦C von 0.85 W/Km auf 1.5 W/Km. Die von
Wasser verändert sich von 0.6 W/Km bei 20◦C auf auf 0.68 W/Km bei 150◦C und nimmt anschließend auf 0.45 bei 350◦C ab [172, 112]. Aus der abnehmenden
Wärmeleitfähigkeit der Materialien und den Fehlern durch die Mittelung der Eigenschaften
der Grundsubstanzen lässt sich demnach ein Fehler von ca. 20% bis
30% in den berechneten Temperaturen erwarten. Eine weitere problematische
Größe ist der Absorptionskoeffizient der Partikel. Dieser konnte nicht gemessen
werden, da die Größenverteilung und die Homogenität der Partikelbeladung mit
Magnetit variierten. Allein durch die Größenverteilung der SM-Partikel, die vom
Hersteller angegeben ist, würden sich Fehler in der Bestimmung des Absorptionskoeffizienten
pro Partikel von 50% ergeben.

Schadensmodellierung 171
5.1.2 Temperaturverlauf auf Gold-Nanopartikeln
Im Gegensatz zu den Mikropartikeln sind die physikalischen Eigenschaften von
Gold-Nanopartikeln ausführlich untersucht worden. So ist für Gold der komplexe
Brechungsindex, aus dem sowohl der Streu- als auch der Absorptionskoeffizient
genau berechnet werden kann, von mehreren Gruppen in unterschiedlichen
Verfahren gemessen worden [83, 112, 141, 45]. Da der Q-Faktor für Gold empfindlich
vom komplexen Brechungsindex abhängt, ergeben sich aus verschiedenen
Messungen für die verwendeten Partikel Q-Faktoren, die um den Faktor 2 von
0.7 bis 1.4 variieren. Zusätzlich ist der Q-Faktor selbst temperaturabhängig und
Q-Faktor
1.4
1.2
1.0
0.8
0.6
0.4
500
2
4
1
3
510 520 530 540 550
Wellenlänge [nm]
Abbildung 5.2: Q-Faktor für die Absorption von 15 nm Goldpartikeln nach Angaben
von van der Hulst (1), Otter(2), CRC (3) und Doremus (4) [83, 141, 112, 45].
nimmt für flüssiges Gold um den Faktor 4 ab [141, 102]. Ein weiterer Effekt,
der die Goldabsorption besonders bei Bestrahlung mit ps-Pulsen beeinflußt, ist
ein Ausbleichen der Absorptionsresonanz. Werden die Partikel mit zu hohen
Intensitäten bestrahlt, können die optisch angeregten Elektronen nicht mehr relaxieren,
so dass sich die Resonanzfrequenz verschiebt [91]. Entsprechend ist
auch für Gold die Absorption mit einer gewissen Unsicherheit behaftet. Um eine
Abschätzung der Mindesttemperaturen erstellen zu können, wurde der niedrigste

172 Schadensmodellierung
Q-Faktor nach den Angaben von van der Hulst [83] für die Rechnungen zugrundegelegt.
Die Veränderung der physikalischen Eigenschaften von Gold und Wasser
mit der Temperatur wurden nicht berücksichtigt. Die Fehler, die hierdurch entstehen,
lassen sich in Teilen abschätzen. Die Abnahme der Wärmeleitung um
20% bei einer Temperaturerhöhung von 300 auf 1200 K [112] spielt keine Rolle,
da die Wärmeleitung nach wie vor so viel höher ist als die von Wasser, dass
die Temperaturverteilung in den Goldpartikeln in guter Näherung als homogen
angenommen werden kann.
In den Rechnungen wurde die hohe Wärmeleitfähigkeit von Wasser bei Zimmertemperatur
eingesetzt, so dass die berechnete Temperatur eine Mindesttemperatur
darstellt. Die räumlichen und zeitlichen Temperaturverläufe, die man um
15 nm Goldpartikel bis zu Temperaturen vom spinodalen Punkt erwarten kann,
sind für eine Bestrahlung mit 35 ps Pulsen in Abbildung 5.3 dargestellt.
T [K/(mJ/cm²)]
100
10
räumliche Temperaturentwicklung zeitliche Temperaturentwicklung
Wasser Wasser
Protein Gold Protein
nach 50 ps
100 ps
200 ps
500 ps
1000 ps
0
0
-15 -10 -5 0 5 10 15
0 500 1000
a) b)
Radius [nm] Zeit [ps]
T [K/(mJ/cm²)]
100
10
0nm
5nm
10 nm
10 nm
1500 2000
Abbildung 5.3: a) Berechneter räumlicher Temperaturverlauf nach Bestrahlung mit
35 ps Pulsen in der Schnittebene durch ein Goldpartikel und die direkte Umgebung am
Ende des Laserpulses. b) Zeitlicher Temperaturverlauf in Abhängigkeit von der Entfernung
zur Goldoberfläche. Die Temperatur nimmt schon innerhalb der Ausdehnung
einer Proteinlage stark ab und hält nur für 10 bis 15 ps an.
In dieser Abbildung wird die starke Temperaturerhöhung pro eingestrahlter Be-
strahlung von 100 K/( mJ/cm 2 ) deutlich. Schon mit 3 mJ/cm 2 werden Tempe-
raturen an der Partikeloberfläche bis zum spinodalen Punkt von Wasser induziert.
Außerdem ist der starke Temperaturgradient bemerkenswert, der um die Partikel

Schadensmodellierung 173
zu erwarten ist. Die Temperaturen haben in einem Abstand von nur 15 nm (1
Proteinlage) bereits um einen Faktor 10 im Vergleich zu den Maximaltemperaturen
abgenommen.
Unter den oben genannten Annahmen von linearer Wärmeleitung und Vernachlässigung
der latenten Wärme für Schmelzen und Verdampfen ergaben sich bei
den genutzten Bestrahlungsparametern, unter denen eine Enzyminaktivierung
beobachtet werden konnte (54 mJ/cm2 ,35psPulslänge), Oberflächentemperaturen
von 4500 K und 9000 K für die 15 nm und 80 nm Partikel. Da diese Temperaturen
oberhalb der Phasenübergänge von Wasser und Gold liegen, können mit dem verwendeten
einfachen thermischen Modell die bei der Inaktivierung auftretenden
Temperaturen nicht mehr berechnet werden.
Oberhalb vom spinodalen Punkt muss mit einer Blase um die Partikel gerechnet
werden, so dass diese thermisch isoliert werden und entsprechend schneller
bis zum Schmelzpunkt von Gold erhitzt werden können. Ab der Schmelztemperatur
muss die latente Schmelzwärme von 63 J/g zugeführt werden, um eine
weitere Temperaturerhöhung zu bewirken. Ab der Verdampfungstemperatur
muss die latente Verdampfungswärme von 1.65 kJ/g aufgebracht werden, bevor
die Partikel vollständig verdampft sind. Mit der spezifischen Wärmekapazität
von 0.129 J/gK und einem Q-Faktor von 0.7 kann eine Maximaltemperatur abgeschätzt
werden, die sich unter Vernachlässigung der Wärmeleitung oberhalb
vom spinodalen Punkt ergibt. Zum Vergleich sind die Energien, die bei unverändert
anhaltender Wärmeleitung aufgebracht werden müssten, in der folgenden
Tabelle aufgeführt. In der Tabelle sind die Energien aufgelistet, die benötigt
werden, um bis zu einer der Temperaturen bzw. einem vollständigen Aufschmelzen
oder einem vollständigen verdampfen nötig sind. Analog zu den Temperaturrechnungen
mit ps-Pulsen ist in Abbildung 5.4 der zeitliche Temperaturverlauf für
6 ns Pulse bei Temperaturen unterhalb vom spinodalen Punkt dargestellt. In der
vorhergehenden Tabelle sind ebenfalls die Energien aufgeführt, die benötigt werden,
um die Partikel bis zum spinodalen Punkt von Wasser, zum Schmelzpunkt
und zum Verdampfungspunkt zu heizen bzw. vollständig zu verdampfen. Die
Wärmeleitung spielt bei Bestrahlung mit Nanosekundenpulsen im Vergleich zu
den Pikosekundenpulsen eine wichtige Rolle, was an der geringeren erreichbaren
Maximaltemperatur und daran, dass der Temperaturverlauf dem Laserpulsverlauf
leicht folgt, zu sehen ist. Die Temperaturerhöhung im umgebenden Wasser
weist wie bei einer Bestrahlung mit ps-Pulsen einen starken Temperaturgradi-

174 Schadensmodellierung
Bestrahlung [mJ/cm 2 ] ps-Pulse ns-Pulse
zum Erreichen Isolation ab keine Isolation Isolation ab keine Isolation
von 300 ◦ C 300 ◦ C
300 ◦ C 2.8 2.8 160 160
1064 ◦ C 8.2 10.4 165 597
∆HSchmelz. 12 14 169 600
2857 ◦ C 25 32 182 1624
∆HVerdampf. 115.4 123 272 1715
Tabelle 5.4: Energie die für ps-Pulse bzw. ns-Pulse benötigt wird, um die 15 nm
Goldpartikel bis auf 300 ◦ C, 1064 ◦ C und 2857 ◦ C zu heizen bzw. die Schmelz- und Ver-
dampfungsenthalpie zuzuführen. Die Werte sind für die Annahmen angegeben, dass 1. )
die Partikel ab dem spinodalen Punkt bei 300◦C vollständig isoliert werden bzw. 2. )
unter der Annahme, dass die Wärmeleitung über den gesamten Temperaturbereich
unverändert anhält.
enten auf, der jedoch deutlich geringer ist als im Fall der ps-Pulse. So fällt die
Temperatur innerhalb der ersten 10 nm nur von 1.7 K auf 0.55 K pro mJ/cm2 ab.
Nach diesen Temperaturrechnungen benötigt man für Nanosekundenpulse
160 mJ/cm2 , um die Partikel bis zum spinodalen Punkt zu erhitzen. Geht man
für höhere Temperaturen von einer vollständigen Isolation durch eine entstehende
Blase aus, so müßten die Partikel bei 165 mJ/cm2 aufgeschmolzen sein.
Somit ergeben sich auch im Fall der Nanosekundenpulse für die Bestrahlungen,
mit denen Proteine inaktiviert werden können, im Bereich ab 500 mJ/cm2 Temperaturen
weit oberhalb vom spinodalen Punkt von Wasser.
5.2 Berechnung der Proteinschäden
Eine Berechnung der Proteinschäden nach dem thermischen Schadensmodell,
das der Arrheniusgleichung folgt und nach einem Schwellprozeß für die Gold-
Nanopartikel, wurde durchgeführt, da sowohl die Laserpulsverläufe als auch die
Inhomogenitäten in einem Teil der Experimente einen Einfluß auf die Abhängigkeit
der Inaktivierung von der Bestrahlung haben und nicht einfach durch idealisierte
Pulsverläufe und Strahlprofile genähert werden konnten. Berechnet wurden die

Schadensmodellierung 175
T [K/(mJ/cm²)]
1.75
1.5
1.25
1
0.75
0.5
0.25
0nm
5nm
10 nm
0
0 10 20 30 40 50
Zeit [ns]
Abbildung 5.4: Temperaturverlauf auf der Oberfläche von 15 nm Goldpartikeln, in
5 nm und 10 nm Abstand bei Bestrahlung mit einem 6 ns Puls (532 nm). Die Temperatur
nimmt innerhalb der ersten Proteinlage auf die Hälfte ab und folgt zeitlich der
Laserpulsintensität.
Temperaturverläufe jeweils an der Oberfläche, in 5 nm Entfernung und in 10 nm
Entfernung von der Partikeloberfläche, da diese Entferungen der Größenordnung
von Proteinen entsprechen.
Das räumliche Strahlprofil und die Probengeometrie wurden berücksichtigt. Zur
Berechnung der Bestrahlung und damit der Temperatur an jedem Ort in der
Probe wurde das als Videosignal aufgenommene Strahlprofil durch eine Funktion
beschrieben, so dass ein Wert für die lokale Bestrahlung an jedem Ort vorlag.
Als Funktionen wurden eine Gaußfunktion, die entweder an das mit einer
CCD-Kamera aufgenommene Strahlprofil gefittet wurde oder mit der aus der
Messerschneidetechnik erhaltenen Halbwertsbreiten berechnet wurde bzw. eine
zweidimensionale Funktion, die die Intensität des Videobilds wiedergibt, genutzt.
Die Probenform wurde berücksichtigt, indem die Probenhöhe für jeden Ort als
Wichtungsfaktor in die Berechnung einging.
Der Abfall der normierten Enzymaktivität wurde für alle Punkte in der Probe in

176 Schadensmodellierung
Abhängigkeit von der Bestrahlung aus dem Schadensintegral nach
berechnet.
caktiv
c0
= e −Ω(t)
Ω(t) = −
� ∞
0
k(t)dt ′
(5.1)
(5.2)
Der Beitrag von jedem Probenpunkt, der aufgrund der Tropfenform zum Rand
der Tropfen hin abnimmt, wurde wie folgt gewichtet:
�
G(RTropfen) = R2 Tropfen − r2 für RTropfen ≥ r (5.3)
0 für RTropfen

Schadensmodellierung 177
Auf diese Weise können auch Ergebnisse von Proben, die mit einem inhomogenen
Strahlprofil bestrahlt wurden, mit theoretischen Vorhersagen verglichen werden.
Als alternativer Schadensmechanismus wurde die Inaktivierung aufgrund einer
Zerstörung der Proteine oberhalb einer bestimmten Schwellentemperatur berechnet.
Mögliche Prozesse mit Schwellentemperatur, die Proteine zerstören könnten,
sind die Phasenübergänge von Wasser (flüssig-gasförmig) und von Gold (festflüssig-gasförmig).
Für die Berechnung wurde angenommen, dass es zu einem
vollständigen Schaden nach dem Übergang kommt und vor dem Übergang kein
Schaden verursacht wird. Diese Bedingung wird durch die Gewichtung
Ω(x, y) =0 für Temperatur(x, y) ≤ Temperatur Phasenübergang (5.6)
∞ für Temperatur(x, y) > Temperatur Phasenübergang (5.7)
beschrieben. Der normierte Gesamtschaden ist unter Berücksichtigung der Tropfenform
mit der Gewichtung aus Gleichung 5.3 erfolgt, so dass sich der Gesamtschaden
nach Gleichung 5.5 berechnen ließ.
5.2.1 Berechnung der Schäden an Nanogoldkonjugaten
nach der Arrheniusgleichung
Im folgenden Abschnitt wird der gemessene Verlauf der Inaktivierung mit einem
berechneten Schaden nach der Arrheniusgleichung verglichen.
Für α-Chymotrypsin liegen als grundlegende Messungen zur thermischen Denaturierungskinetik
die Messungen von Pohl [149] und Lange [105] vor. Pohl gibt an,
dass seine Werte die vollständige Entfaltung beschreiben. Die von Lange gemessenen
Raten wurden keinem Entfaltungsprozess eindeutig zugeordnet. Es wurde
angenommen, dass die spektroskopisch beobachteten Strukturveränderungen zu
einer Inaktivierung durch fehlerhafte Rückfaltung oder Aggregation führen.
Durch Extrapolation dieser Raten zu hohen Temperaturen und kurzen Zeiten
erfolgte die Berechnung der thermischen Schäden von α-Chymotrypsin . Für
alkalische Phosphatase wurden die Raten extrapoliert, die für die thermische
Denaturierung im Zeitbereich von Sekunden in Wasserbad-Temperatursprungexperimenten
gemessen wurden.

178 Schadensmodellierung
Es wurden folgende Arrheniusparameter verwendet:
Ea
−
RateArrhenius : k = A0 · e R·T (5.8)
23 1
RateaP : A0 =1.85 · 10
s Ea
5 J
=1.61 · 10 (5.9)
mol
39 1
Ratechymo : A0 =8.28 · 10
s Ea
3 J
= 250 · 10 (5.10)
mol
In Abbildung 5.6 ist die errechnete aP-Au-Restaktivität und die chymo-Au-
Restaktivität in Abhängigkeit der Bestrahlung mit dem inhomogenen gaußähnlichen
Strahlprofil zusammen mit den Messergebnissen dargestellt. Aufgetragen
ist die Bestrahlung im Maximum des gaußähnlichen Strahlprofils.
Restaktivität [%]
100
1Puls aP-Schaden
100
80
berechnet
80
Restaktivität [%]
60
1 Puls aP-Goldkonjugate
60
1 Puls chymo-Schaden
berechnet Rate Pohl
1 Puls chymo-Schaden
berechnet Rate Lange
40 40
1Puls chymo-Goldkonjugate
20
5nm
100 Pulse aP-Goldkonjugate
0nm 10nm
0
0 800 1600 2400 3200
20
0
0
5nm
0nm 10 nm
0nm
800
5nm
1600
10 nm
2400 3200
a) Bestrahlung [mJ/cm²] b) Bestrahlung [mJ/cm²]
Abbildung 5.6: Berechnete und gemessene Restaktivität von Gold-Konjugaten nach
Bestrahlung mit 16 ns Pulsen. Die Restaktivität wurde für den Temperaturverlauf an
der Oberfläche der Partikel, in 5 nm Entfernung und in 10 nm Entfernung von der Partikeloberfläche
berechnet. a) aP-Au-Konjugate-Probentropfen, Bestrahlung durch 1 und
100 Pulse; b) chymo-Au-Konjugate, Bestrahlung durch 1 Puls; ab 160 mJ/cm2 wird
der spinodale Punkt im Zentrum der Probe erreicht; ab 280 mJ/cm2 wird der spinodale
Punkt in der gesamten Probe aufgrund des inhomogenen gaußähnlichen Profils
überschritten.
Die berechneten Schäden decken sich für keines der Experimente mit den beobachteten
Inaktivierungen.
Ab einer Bestrahlung von 160 mJ/cm2 werden zentral Temperaturen oberhalb
des spinodalen Punktes an den Partikeln induziert, so dass die Proben einen
sukzessive mit der Bestrahlung größer werdenden Anteil an Partikeln enthielten,
um die mit Blasenbildung gerechnet werden musste. Ab 280 mJ/cm2 muss mit
Blasenbildung um alle Partikel gerechnet werden. Die Inaktivierung ist in allen

Schadensmodellierung 179
Fällen erst bei Bestrahlungen um einen Faktor 2 bis 4 höher erfolgt, als dies nach
den berechneten thermischen Schäden erwartet worden wäre.
Die inhomogene Bestrahlung führt zu einer Abflachung der Inaktivierungskurven
in Abhängigkeit von der Bestrahlung im Vergleich zu den für ein homogenes
Strahlprofil erwarteten Kurven.
Die Berechnung der Inaktivierung von chymo-Au-Konjugaten auf der Basis der
Extrapolation der Pohlschen Denaturierungsraten ist in Abbildung 5.6 b) dargestellt.
Das Ergebnis entspricht dem der alkalische Phosphatase -Inaktivierungen.
Der prinzipielle Verlauf ist richtig, die experimentell beobachteten Kurven verlaufen
zu flach und die berechneten Bestrahlungen liegen um einen Faktor 2 zu
niedrig.
Da in Temperatursprungexperimenten von Lange mit einer Zeitauflösung im Mikrosekundenbereich
[105] Raten mit einer geringeren Steigung in Abhängigkeit
von der Temperatur im Vergleich zu den Raten induzierte Raten von Tryptophan-
Absorptionsänderungen für α-Chymotrypsin als von Pohl gemessen wurden, wurden
diese Raten zusätzlich in den Modellrechnungen herangezogen. Die entsprechenden
Inaktivierungen nach den Raten von Lange sind jeweils zusätzlich in
Abbildung 5.6 dargestellt.
Nach den Rechnungen kann mit diesem Strahlprofil maximal eine Inaktivierung
von 50% von chymo-Au Konjugaten nach den Raten von Pohl bei Temperaturen
unterhalb des spinodalen Punktes, d. h. ohne Blasenbildung erwartet werden.
Experimentell konnte diese Inaktivierung jedoch nicht beobachtet werden.
Um die Artefakte auszuschließen, die durch das inhomogene Strahlprofil und
daraus folgende Blasenbildung hervorgerufen werden können, wurden chymo-Au-
Konjugate mit einem homogenen Strahlprofil bestrahlt (Abbildung 5.7). Die
Blasenbildung kann ab einer Bestrahlung von 160 mJ/cm2 in der gesamten Probe
erwartet werden.

180 Schadensmodellierung
Restaktivität [%]
100
80
60
40
20
0
0
5nm
0nm 10 nm
400
0nm 5nm
Raten Lange
Raten Pohl
15nm Chym.- Gold
Restaktivität
10 nm
800 1200 1600
Bestrahlung [mJ/cm²]
Abbildung 5.7: Berechnete und gemessene Restaktivität von chymo-Goldkonjugaten
nach Bestrahlung mit 6 ns Pulsen. Die Restaktivität wurde für den Temperaturverlauf
an der Oberfläche der Partikel, in 5 nm Entfernung und in 10 nm Entfernung von der
Partikeloberfläche berechnet. Ab 160 mJ/cm2 wird der spinodale Punkt im Zentrum
der Probe erreicht.
Nach den Rechnungen kann eine vollständige Inaktivierung ab 100 mJ/cm2 und
einem Puls nach den Raten von Pohl erwartet werden. Eine Inaktivierung wurde
jedoch erst bei Bestrahlungen ab 600 mJ/cm2 weit oberhalb des spinodalen
Punktes beobachtet.
Die Berechnung der thermischen Schäden durch Bestrahlung mit Pikosekundenpulsen
nach dem Arrheniusmodell erfolgte analog zu der Berechnung der Schäden
im Fall der Nanosekunden-Experimente. Abbildung 5.8 zeigt die theoretisch erwarteten
Denaturierungskurven von aP-Au-Konjugaten. Die Diagramme zeigen
die berechnete Inaktivierung für die Temperaturen an der Partikeloberfläche, in
5 nm Entfernung und in 10 nm Entfernung in Abhängigkeit von der Bestrahlung
mit jeweils 500 bzw. 10000 Pulsen. In der Berechnung der Schäden wurde das
Abscannen der Proben berücksichtigt. Ab einer Bestrahlung von 3 mJ/cm2 wird
die Temperatur von 300◦C der Goldpartikel am Maximum des scannenden Strahls
überschritten. Ab einer Bestrahlung von 5 mJ/cm 2 wird diese Temperatur in der

Schadensmodellierung 181
in der gesamten Probe überschritten. Im Fall der Phosphatase wurde 16 Felder
abgescannt (siehe 3.2.5).
Restaktivität [%]
100
80
60
40
20
0nm
5nm
500 Pulse
10nm
Restaktivität [%]
0
0 10 20 30 40 50
0
0 10 20 30 40 50
a) Bestrahlung [mJ/cm²]
b) Bestrahlung [mJ/cm²]
100
80
60
40
20
0nm
5nm
10nm
10000 Pulse
Abbildung 5.8: Berechnete Inaktivierung von alkalische Phosphatase -
Goldkonjugaten auf der Basis eines thermischen Schadens zusammen mit den
Messergebnissen unter Berücksichtigung der scannenden Bestrahlung a) 500 Pulse b)
10000 Pulse. Die Restaktivität wurde für den Temperaturverlauf an der Oberfläche
der Partikel, in 5 nm Entfernung und in 10 nm Entfernung von der Partikeloberfläche
berechnet.
Bei scannender Bestrahlung von aP-Au-Konjugaten setzt die erwartete Inaktivierung
erst bei Bestrahlungen ein, bei denen im Zentrum des scannenden
Strahls der spinodale Punkt bereits überschritten wurde. Bei der Bestrahlung
von 5 mJ/cm2 , ab der in der gesamten Probe mit einer Blasenbildung zu rechnen
ist, kann maximal eine Inaktivierung von 60% erwartet werden. Eine Messung
der thermischen Denaturierungskinetik ohne Blasen kann demnach nicht mit der
scannenden Bestrahlung erfolgen. Die experimentell beobachteten Kurven verlaufen
wesentlich flacher als die nach der Arrheniusgleichung berechneten.
Der thermische Schaden nach Bestrahlung mit Pikosekundenpulsen wurde für
α-Chymotrypsin auf der Basis der thermischen Denaturierungskonstanten von
Pohl berechnet. Im Unterschied zu den Experimenten mit alkalische Phosphatase
wurden die Konjugate mit 64 Feldern und mit einem Strahlprofil bestrahlt,
das einen um den Faktor 1.4 höheren Spitzenbestrahlungswert hatte. Eine Blasenbildung
kann wiederrum ab 3 mJ/cm2 erwartet werden. Eine Blasenbildung
um alle Partikel in der Probe ab 3.45 mJ/cm2 .

182 Schadensmodellierung
Restaktivität [%]
100 100
80 80
60 60
10 nm 10 nm
500 Pulse
40 40
5nm
5nm
Restaktivität [%]
20 20
10 000 Pulse
0nm
0
0 10 20 30 40 50 60 70 80
0nm
0
0 10 20 30 40 50 60 70 80
a) Bestrahlung [mJ/cm²]
b) Bestrahlung [mJ/cm²]
Abbildung 5.9: Berechnete Inaktivierung von Chymotrypsin-Goldkonjugaten auf
der Basis eines thermischen Schadens zusammen mit den Messergebnissen unter
Berücksichtigung der scannenden Bestrahlung a) 500 Pulse b) 10000 Pulse. Die Restaktivität
wurde für den Temperaturverlauf an der Oberfläche der Partikel, in 5 nm
Entfernung und in 10 nm Entfernung von der Partikeloberfläche berechnet.
Eine vollständige Inaktivierung unterhalb des spinodalen Punktes konnte demnach
erwartet werden, wenn man die Oberflächentemperatur für den Schaden
verantwortlich macht. Der Temperaturgradient um die Partikel ist jedoch so
stark, dass man keine Inaktivierung unterhalb des spinodalen Punkts mehr erwarten
kann, wenn das gesamte Protein (5 nm) auf Temperaturen nahe 300◦C erhitzt werden muss.
Experimentell konnten Inaktivierungen erst bei Bestrahlungen beobachtet werden,
die um einen Faktor 3 bis 10 höher lagen, als den Rechnungen nach zu
erwarten ist. In den Rechnungen wird deutlich, dass eine Inaktivierung erst
oberhalb des spinodalen Punktes erfolgt. Zusätzlich ist der Temperaturgradient
innerhalb der 10 nm d. h. innerhalb der Proteine so groß, dass die Bestrahlung
schon um einen Faktor 4 höher sein muss, wenn man die Proteinmitte auf die
gleiche Temperatur heizen will wie die goldzugewandte Proteinseite. Der Inaktivierungsverlauf
im Fall der Bestrahlung mit 10000 Pulsen ist weniger von der
Bestrahlung abhängig als dass dies von der thermischen Schädigungstheorie her
erwartet wird. D. h. dass trotz des extrem hohen Temperaturgradienten und
der hohen Temperaturen die Inaktivierung von α-Chymotrypsin nicht mit einem
thermischen Schaden erklärt werden kann, der mit den von Pohl beschriebenen
Raten abläuft.

Schadensmodellierung 183
5.2.2 Berechnung der Schäden an Nanogoldkonjugaten
nach einem Schwellwertprozeß
Neben einem Schaden nach der Arrheniusgleichung kann es zu einer Inaktivierung
durch Phasenübergänge mit den daraus folgenden chemischen Veränderungen der
Umgebung kommen. Die erwarteten Bestrahlungsabhängigkeiten unter der Annahme,
dass es zu einer vollständigen Proteininaktivierung nach dem Erreichen
der Schmelztemperatur von Gold kommt, ist in Abbildung 5.10 für die homogene
als auch die inhomogene Bestrahlung der Goldkonjugate mit Nanosekunden-
Pulsen dargestellt.
Restaktivität [%]
100 100
80 80
Restaktivität [%]
60 60
40 40
20 20
0
0 800 1600 2400 3200 3800
0
0 160 320 480 640 800 960 1120
a) Bestrahlung [mJ/cm²] b) Bestrahlung [mJ/cm²]
Abbildung 5.10: Berechnete Inaktivierung von Enzym-Gold-Konjugaten durch einen
Phasenübergang bei 1064◦CinAbhängigkeit von der Bestrahlung nach einem Puls zusammen
mit den Ergebnissen der Inaktivierung von chymo-Au-Konjugaten. a) inhomogenes
gaußähnliches Strahlprofil b) homogenes Strahlprofil (16 ns bzw. 6 ns-Puls; 15
nm Gold; Bestrahlung in Probentropfen).
Die Temperatur der Partikel, bei der einen Inaktivierung beobachtet werden kann,
liegt bei Temperaturen deutlich oberhalb des spinodalen Punktes, so dass die Inaktivierung
nicht in direktem Zusammenhang mit Blasenbildung und einer Temperatur
von ca. 300◦C stattfindet.
Für das homogene Strahlprofil stimmt die gemessene Inaktivierung mit einem
Schaden durch einen Phasenübergang von Gold überein. Diese Übereinstimmung
in der Schwellentemperatur ist entweder zufällig oder spricht dafür,dassesnicht
zu einer vollständigen Isolierung der Partikel durch Blasen kommt. Ein Indiz
dafür, dass es nicht zu einer vollständigen Isolierung kommt, ist, dass in diesem
Fall bei ca. 270 mJ/cm2 eine vollständige Verdampfung der Partikel zu erwarten

184 Schadensmodellierung
wäre und kaum vorstellbar ist, dass durch eine vollständige Verdampfung der
Partikel die Proteine nicht geschädigt werden.
Der Verlauf der Inaktivierung durch einen Schwellwertprozess für das gaußähnliche
Strahlprofil des MBB Lasers zeigt sowohl in den Rechnungen als auch in den Experimenten
einen vergleichbaren Kurvenverlauf.
Betrachtet man analog zu den Rechnungen mit Nanosekundenpulsen den Schaden,
der in Folge des Schmelzens der Goldpartikel während der Pikosekundenpuls-
Bestrahlung verursacht wird, so sind die Bestrahlungen, die experimentell benötigt
wurden, um ca. einen Faktor 3 höher als die berechneten Bestrahlungen, die für
ein Aufheizen des Goldes auf 1064◦C an der Partikeloberfläche benötigt werden.
Restaktivität [%]
100
80
60
40
20
0
0
0nm
20
10000 Pulse
500 Pulse
40 60 80 100
Bestrahlung [mJ/cm²]
Abbildung 5.11: Berechnete Inaktivierung von Enzym-Goldkonjugaten durch die
scannende Bestrahlung mit 35 ps Pulsen auf der Basis eines Schadens ab der Schwellentemperatur
von 1064◦C an der Partikeloberfläche zusammen mit den Ergebnissen
der scannenden Bestrahlung von chymo-Au.

Kapitel 6
Diskussion
6.1 Thermische Mikroeffekte
Die selektive laserinduzierte Inaktivierung von Zellen über selektive Absorption
in Gewebe ist die Grundlage therapeutischer Ansätzen zur selektive Therapie
des retinalen Pigmentepithels (SRT) oder der selektiven Haarentfernung mit
Lasern [170, 24, 159, 160, 7, 21]. Nach extrapolierten thermischen Denaturierungsraten
von unterschiedlichen Proteinen und Gewebe ist es denkbar, dass es
zu einer thermischen Denaturierung von Proteinen in der Umgebung von Absorbern
innerhalb von Mikrosekunden kommen kann [84]. Für die Partikel kann
eine Oberflächentemperatur während der Bestrahlung ohne Blasenbildung bis
zum spinoidalen Punkt von Wasser erwartet werden, sofern die Partikel nicht
als heterogener Nukleationskeim wirken. Durch heterogene Nukleation setzt die
Blasenbildung bei mikrometergroßen Partikeln allerdings meist schon bei geringeren
Temperaturen ein. Ist eine Überhitzung von Wasser bis in die Nähe des
spinoidalen Punkts (ca. 270 ◦ C bis 305 ◦ C) möglich, ohne dass es zu einer Blasen-
bildung kommt, so kann eine thermische Inaktivierung nach den extrapolierten
Raten sogar innerhalb von Nanosekunden erwartet werden. Die Ergebnisse der
Bestrahlung der Enzym-Absorberkonjugate für Bestrahlungen unterhalb der Blasenbildungsschwelle
werden im folgenden Abschnitt in Hinblick auf die möglichen
thermischen Mikroeffekte diskutiert. Die Bestrahlung der mikrometer- und nanometergroßen
Konjugate mit Mikro-, Nano- und Pikosekunden Pulslänge und
die dadurch induzierten Temperatursprünge an Proteinen in den drei Zeitbereichen,
die sich jeweils um drei Größenordnungen unterscheiden, sollten dabei einen
185

186 Diskussion
Überblick über mögliche Reaktionen geben, die bei den hohen Temperaturen und
kurzen Zeiten ablaufen können.
Das Modellsystem, bestehend aus Enzymen, die an der Oberfläche von anorganischen
Partikeln immobilisiert sind, wurde für die Untersuchung der thermischen
Denaturierungskinetik von Proteinen gewählt, da die Enzyme eine einfache Aussage
über die biologische Aktivität der Proteine nach der Bestrahlung erlauben.
Die mit Proteinen beschichteten Partikel stellen außerdem in Hinblick auf die Effekte
in Zellen eine stark vereinfachte, aber in einem zentralen Punkt vergleichbare
Situation dar: Die Proteine sind an der Partikeloberfläche dicht gepackt,
so dass sie mit ihren direkten Nachbarn reagieren können und liegen in einer
durch die Bindung geordneten Struktur vor, die Proteinbewegungen und Reaktionen
einschränkt. Dies ist in Zellen z.B. für membranständige Proteine der
Fall. In einem Teil der Experimente wurde vollständig denaturiertes Protein in
hoher Konzentration zu den Proben zugesetzt, um eine Aggregation der Enzyme
mit Peptiden im Puffer zu bewirken. Die Situation ist nicht unbedingt mit
der Situation in Zellen vergleichbar. Zellen sind zwar ebenfalls sehr dicht mit
Proteinen gefüllt, diese reagieren im gefalteten Zustand jedoch nicht unbedingt
mit einzelnen über eine lokale Heizung entfalteten Proteinen. Außerdem gibt es
zusätzlich eine Reihe von Reparaturproteinen, die fehlgefaltete Proteine in der
Zelle abbauen. Um bei thermischen Mikroeffekten nicht speziell von dem verwendeten
System abhängig zu sein, war die Identifizierung von einem thermisch
induzierbaren Effekt, der weitgehend unabhängig von der Proteinstruktur und
der Proteinumgebung ist, besonders interessant. Im Folgenden wird diskutiert,
ob solch ein Effekt an dem Modellsystemen beobachtet werden konnte.
Bei den Experimenten an Mikropartikeln ohne Aggregationsprotein wurden an
der Oberfläche der Partikel mit Hilfe der Druckkammer Temperaturen von mindestens
180◦C induziert, ohne dass eine Inaktivierung beobachtet werden konnte,
obwohl dies nach den extrapolierten Raten erwartet wurde. Bei der Interpretation
diese Ergebnisses stellt sich natürlich die Frage nach dem Einfluß der Konjugation
auf die thermische Stabilität der Proteine.

Diskussion 187
6.1.1 Einfluß der Protein-Partikel-Bindungen auf die
thermische Denaturierungskinetik
Einerseits kommt es durch Anheftung der Proteine an eine Oberfläche zu einer
Stabilisierung in Hinblick auf eine Entfaltung [63]. Andererseits werden Reaktionsschritte
innerhalb der Proteine wie Reaktionen der Untergruppen oder
die Trennung einzelner Bindungen nicht unbedingt behindert. Auf diese Weise
können an Oberflächen gebundene Proteine eine andere Denaturierungskinetik
als Proteine in Lösung zeigen.
Es ist bekannt, dass sowohl die Bindung von α-Chymotrypsin als auch von alkalischer
Phosphatase an Oberflächen einen Einfluß auf die Aktivität der Enzyme
haben kann [26, 210, 203]. Durch die chemischen Schritte bei der kovalenten Koppelung
der Proteine an die Mikrometerpartikel können auch die Proteine selber
chemisch modifiziert oder sogar vernetzt werden. Um den Einfluß der mit der kovalente
Koppelung verbundenen Veränderungen des Proteins auf seine Proteinstabilität
abschätzen zu können, ist entscheidend, wie weit Enzyme in ihrer Struktur
verändert werden können, ohne ihre Aktivität zu verlieren. Nach dem Schlüssel-
Schloß Prinzip, das enzymatischen Reaktionen zugrunde liegt [183], müssen die
Enzyme eine gewisse Labilität aufweisen, damit das Substrat in dem aktiven
Zentrum des Enzyms binden kann. Dass diese Beweglichkeit sowohl ein wichtiger
Bestandteil für die Funktion eines Proteins als auch für die Thermostabilität
der Proteine ist, läßt sich gut damit illustrieren, dass das Temperaturoptimum
und die thermische Stabilität von Enzymen identischer Funktion unterschiedlicher
Lebewesen an die Umgebungstemperatur der Lebewesen angepaßt sind
[108, 110, 109]. Zusätzlich korreliert die Lebensdauer der Enzyme innerhalb des
Organismus mit der thermischen Stabilität [189]. Zusammenfassend ist damit ein
Enzym, das chemisch soweit modifiziert ist, dass seine Stabilität stark zunimmt,
auch nicht mehr aktiv. Gianfreda [63] kommt entsprechend zu dem Schluß, dass
aktive immobilisierte Enzyme ein gutes Modellsystem für Enzyme in der Mikroumgebung
von Zellen darstellen, da Enzyme dort auch nur beschränkt frei
beweglich sind. Bikerstaff [17] hat für Proteinstrukturuntersuchungen deshalb
den Schluß gezogen, dass immobilisierte Enzyme, solange sie aktiv sind, gute Untersuchungen
in Hinblick auf die Struktur zulassen. In der vorliegenden Arbeit
wird demnach davon ausgegangen, dass die enzymatisch aktiven Proteine so weit
unverändert bleiben, dass sie sich auch in Hinblick auf ihre thermische Stabilität

188 Diskussion
nicht grundsätzlich anders verhalten als ungebundene Enzyme.
Der Einfluß der kovalenten Bindungen an die Mikropartikel auf die Enzymstabilität
wurden im Gegensatz zum Einfluß der Goldkonjugation experimentell untersucht,
da die Experimente an den Mikrometerpartikeln in Hinblick auf die
thermischen Mikroeffekte besonders wichtig sind. Der Vergleich der Denaturierung
von Enzym Mikropartikelkonjugaten mit der Denaturierung von gelöstem
Enzym in Wasserbadtemperatursprungexperimenten hat keine signifikanten Unterschiede
ergeben. Sowohl alkalische Phosphatase als auch α-Chymotrypsin werden
durch die kovalente Koppelung nicht um mehr 5◦C, d.h. im Rahmen der
Meßgenauigkeit der Enzymaktivität in ihrer Inaktivierungstemperatur bei 10 s
Temperatursprüngen bzw. 100 s Temperatursprüngen verändert.
Für α-Chymotrypsin wurde der Einfluß einer kovalenten Modifizierung von einer
Aminogruppe des Proteins auf die thermische Stabilität im Detail von Mozhaev
untersucht [131]. Entscheidend für die Veränderung der Thermostabilität ist
dabei die Ladung der Seitenkette des Moleküles, mit der α-Chymotrypsin gekoppelt
wird, da über die Ladungen der Gruppen die Hydrophobizität der Proteine
verändert werden kann. Eine Erhöhung der Hydrophobizität führt zu einer
Stabilisierung unter physiologischen Bedingungen, da sich die Proteine gegen
einen höheren Zusammenhalt entfalten müssen. Für die genutzte Konjugation
ohne zusätzliche Ladungen an einer hydrophilen Oberfläche erwartet man nach
Mozhaev keine grundlegende Veränderung der thermischen Denaturierungskinetik.
6.1.2 Temperaturen an Mikroabsorbern
Die Temperatur, die an den Partikeloberflächen ohne Blasenbildung mindestens
erreicht wird, ist für die Interpretation der Ergebnisse entscheidend. Diese Mindesttemperatur
kann über den äußeren Druck beeinflußt werden. Eine Berechnung
der Temperatur war nicht mit der nötigen Präzision möglich, da die physikalischen
Parameter der Partikel nicht ausreichend genau bekannt waren. Einen
Aufschluß über die erreichten Mindesttemperaturen erhält man jedoch über die
Blasenbildung.
Für die Magnetit beladenen Polystyren-Absorber kann nach der Temperaturabschätzung
von einer Temperatur im Bereich von 100◦C ausgegangen werden,

Diskussion 189
da sich innerhalb der Partikel eine mit Magnetit gesättigte Polystyren Matrix
befindet, die Reste von Lösungsmittel enthalten kann, die verdampfen können.
Das Polystyren selbst kann bei Temperaturen über 100◦CseineIntegrität verlieren,
da der Schmelzpunkt von Polystyren bei 89◦C liegt. Die Beobachtung, dass
ein Teil der Blasen Lebensdauern im Minutenbereich hatte, spricht dafür, dass es
zumindest teilweise zu einer Verdampfung von organischen Substanzen kommt,
die dann ein schwer lösliches Gas in den Blasen bilden. Die Temperaturen an der
Oberfläche der PM-Partikel direkt unterhalb der Blasenbildungsschwelle sollten
demnach im Bereich von 100◦C liegen.
Die Silikatpartikel sind in Hinblick auf ihre thermische Stabilität sehr viel besser
geeignet, um hohen Temperaturen zu widerstehen. Ihrem Herstellungsverfahren
nach sind sie bis mindestens 800◦C stabil. Deshalb wurde eine Fragmentierung
nie beobachtet. Die Blasenkinetik an SM-Partikeln verhält sich, wie es bei ausschließlicher
Verdampfung von Wasser erwartet wird: die Blasen schwingen auf
und kollabieren wieder mit einer charakteristischen Blasenlebensdauer.
Bei 15 Mikrosekundenpulsen und den Partikeldurchmessern von 2 bis 8 Mikrometer
ermöglicht die homogene Nukleation keine Blasenbildung unterhalb des
spinoidalen Punktes. Neben der homogenen Nukleation kann auch heterogene
Nukleation zu einer Blasenbildung führen. Inwieweit die Partikel als heterogener
Siedekeim wirken, hängt von der Hydrophobizität der Beschichtung der Partikel
ab. Dies lässt sich am Beispiel einer hydrophoben Kugel mit einem Radius
von 10 µm veranschaulichen, die eher wie eine Blase entsprechender Grösse wirken
sollte. Ist die Kugel vollständig hydrophil beschichtet, so verhält sie sich
eher wie Wasser, d.h. heterogene Nukleation tritt erst bei höheren Temperaturen
auf. Für die Partikel-Proteinkonjugate bedeutet das, dass die Beschichtung der
Partikel mit den Proteinen eine entscheidende Rolle für die Wirkung der Partikel
als Nukleationskeim spielt. Da die verwendeten Enzyme in ihrer aktiven
Form wasserlöslich sind, verhalten sie sich eher hydrophil, solange sie nicht entfaltet
oder denaturiert sind. Die Oberfläche der Silikapartikel wurde bewusst
hydrophil gewählt. Man muß demnach davon ausgehen, dass die Partikel nicht
als starker Nukleationskeim wirken und somit eine Überhitzung der Konjugate
möglich ist. Die Beobachtung, dass die Blasen an einem SM-Partikel immer an
der gleichen Stelle entstehen, spricht dafür, dass die Partikel bei entsprechend
hoher Temperaturen als heterogene Siedekeime wirken. Experimente, in denen
Kelly die Temperatur an der Blasenbildungsschwelle um 3 µm Graphitpartikel

190 Diskussion
nach Bestrahlung mit 6 ns Pulsen bestimmt hat, haben eine Temperatur von
180◦C ergeben [92]. Die Temperaturen oberhalb der Blasenbildungsschwelle lassen
sich mit den mathematischen Modellen, die in der Arbeit zur Berechnung
der Partikeltemperatur benutzt wurden, nicht abschätzen, da durch die Blase
hervorgerufenen Linsen-, Isolations- und Konvektionseffekte nicht berücksichtigt
wurden.
6.1.3 Inaktivierung nach dem Arrheniusmodell
Im Folgenden wird diskutiert, inwieweit die Kinetik der Inaktivierung der Konjugate
mit der Arrhenius-Gleichung beschrieben werden kann. Nach der Extrapolation
der Denaturierungskinetik rechnet man für alkalische Phosphatase mit
einer Denaturierung innerhalb von 15 µs Pulsen bei 180◦C. Für α-Chymotrypsin
rechnet man für dieselbe Zeit nach den Raten von Pohl [149, 150, 151] mit einer
vollständigen Entfaltung schon bei einer Temperatur von 97◦C. In der Arbeit
wurde davon ausgegangen, dass diese Entfaltung einen irreversiblen Schaden zur
Folge hat.
Die möglichen Prozesse, die zu einer Inaktivierung eines nativen Proteins (N)
führen können, sind eine Entfaltung (D), mit einer darauffolgenden fehlerhaften
Rückfaltung, eine Schädigung der entfalteten Polypeptidkette durch kovalente
Modifikationen (I2) odereinedirekteSchädigung des Proteins ohne vorherige
Entfaltung ( I1). Die Vorgänge können durch das folgendes Diagramm beschrieben
werden.
N
k1(T )
⇀↽
k2(T )
D
k3(T ) ↓ ↓k4(T )
I1
I2
(6.1)
Betrachtet man zuerst die Ergebnisse der Messungen mit alkalischer Phosphatase,
die auf Kunstoffpartikeln (PM-Konjugate) immobilisiert war, so kann für
die Partikel nur mit einer Maximaltemperatur von 100◦C um den Schmelzpunkt
von Polystyren gerechnet werden, da die Partikel oberhalb der Blasenbildungsschwelle
fragmentiert wurden. Mit bis zu 1000 Pulsen konnte keine wesentliche
Inaktivierung der aP-PM-Konjugate beobachtet werden. Lediglich oberhalb der

Diskussion 191
Blasenbildungsschwelle ist es zu einer schwachen Inaktivierung von 20% gekommen.
Einen starken Einfluss auf die Restaktivität nach der Bestrahlung hatte der
Zusatz von Aggregationsprotein”. Mit dem Zusatz aus thermisch denaturiertem
”
Protein konnte eine vollständige Inaktivierung innerhalb der 1000 Pulsen unterhalb
der Blasenbildungsschwelle erzielt werden. Innerhalb von 100 Pulsen wurde
jedoch kein Effekt beobachtet. Der Zusatz von Aggregationsprotein hatte in den
Wasserbadtemperatursprungexperimenten keinen Einfluß auf die Inaktivierung.
Da die Raten der thermischen Schäden exponentiell mit der reziproken Temperatur
anwachsen sollten, wurden mit den aP-SM-Konjugaten Versuche unter 10 bar
Druck durchgeführt. Es konnte auch in Experimenten bei 10 bar Druck, d.h. bei
Temperaturen bis zu 180◦C bei Verwendung der thermisch stabilen Silika-Partikel
(aP-SM-Konjugate) keine Inaktivierung beobachtet werden. Die Experimente zur
Denaturierung von alkalischer Phosphatase können in einem einfachen Modell erklärt
werden, wenn man eine weitgehend reversible Entfaltung annimmt, in der
sich zuerst die Dimere trennen und anschliessend die Monomere entfalten. Diese
Subgruppen müssten dann während der Abkühlung zu nahezu 100% renaturieren.
Innerhalb von Mikrosekunden entfernen sich die getrennten Monomere nicht
so weit, dass sie nicht wieder dimerisieren können. In der Gegenwart von Aggregationsprotein
aggregieren die Proteinuntereinheiten mit in der Lösung befindlichen
Polypeptidketten und eine Rückfaltung wird so verhindert. In den 100 s
Wasserbadtemperatursprüngen ist kein Einfluß von Aggregationsprotein vorhanden,
da die Monomere in 100 s ausreichend Zeit haben, um sich durch Diffusion
so weit von den Ausgangseinheiten zu entfernen, dass eine Renaturierung nicht
mehr möglich ist. Eine solche Abfolge bei der Denaturierung von Phosphatase,
während der es zu einer Dissoziation der Dimere und zu einer darauffolgenden
Modifikation der Monomere kommt, wurde von Das, Falk, Schlesinger und
Levinthal beobachtet [39, 55, 164, 165]. Von den Autoren wurden je nach Puffer,
Temperatur und Pufferzusätzen nach Temperatursprüngen sowohl reversibel
gefaltete inaktive als auch kovalent modifizierte Proteinformen beobachtet. Die
wichtigsten auftretenden kovalenten Modifikationen an alkalischer Phosphatase
waren dabei die Fehlbindungen von Schwefelbrückenbindungen, deren Modifikation
in Sulfhydrylgruppen, die Entfernung oder Blockade der Zinkionen und die
chemische Veränderung der Cysteingruppen [165].
Die Experimente mit Chymotrypsin-Konjugaten geben mehr Aufschluß über die
Beiträge der einzelnen Reaktionen, da aufgrund der Messungen von Pohl, Tsong

192 Diskussion
und Lange davon ausgegangen werden kann, dass sich die Polypeptidkette von
α-Chymotrypsin innerhalb von Nanosekunden teilweise entfaltet [149, 190, 105]
und damit kovalente Modifikationen zu der irreversiblen Enzymschädigung führen
könnten. Finden die Aggregation oder die kovalenten Modifikationen nicht statt,
so kann nach den Messungen von Pohl mit einer Renaturierung der Proteine
zu einem hohen Anteil gerechnet werden. Die Messungen geben damit Aufschluß
über mögliche schnelle Prozesse, die zu einer Denaturierung durch chemische Modifikation
einer Polypeptidkette an Mikropartiklen innerhalb von Mikrosekunden
führen.
Weder mit einem Puls bis zur Blasenbildungsschwelle noch bei Bestrahlungen 3
fach darüber konnte eine Inaktivierung von chymo-SM-Konjugaten erzielt werden.
Auch mit zunehmendem Druck bei 5 bar und 9 bar konnte keine Inaktivierung
beobachtet werden. Nach diesen Experimenten kommt es somit zu keiner
irreversiblen Schädigung der Enzyme innerhalb der 15 µs Pulsdauer, obwohl man
nach den extrapolierten Daten von Pohl mit einer Schädigung schon ab 97◦C rechnen kann.
Selbst Aggregationsprotein, das bei alkalischer Phosphatase zu einer vollständigen
Inaktivierung nach 1000 Pulsen geführt hat, hat bei sehr hoher Bestrahlung
von 4 bis 10 J/cm2 und einem Druck von 9 bar zu keiner Inaktivierung von
α-Chymotrypsin geführt. Auch wenn die Experimente zur Inaktivierung von
chymo-SM-Konjugaten aufgrund der kleinsten Probenplatten mit 40% Fehler
durch das Pipettieren per Hand behaftet waren, ist die schwache Inaktivierung
von nur 30% bei 10 J/cm2 erstaunlich, die dabei noch im Rahmen der Messfehler
liegt. Erst 100 Pulse haben zu einer Inaktivierung unter diesen Bedingungen bis
auf eine Restaktivität von 15% geführt. Man kann demnach einen schwachen inaktivierenden
Effekt unter diesen Extrembedingungen beobachten, der weit hinter
den erwarteten extrapolierten Raten für eine thermische Entfaltung zurückbleibt
und dafür spricht, dass auch Aggregation nicht in jedem Fall zu einer schnellen
irreversiblen Schädigung der Proteine führt.
Nachdem in den Mikrosekunden-Temperaturerhöhungen an den Mikrometer-Konjugaten
keine Inaktivierung bis 175◦C festgestellt werden konnte, ist für die Goldkonjugate
und die dort beobachtete Enzyminaktivierung die Frage, inwieweit dort
ein thermischer Schaden für die Inaktivierung verantwortlich sein kann. Die Temperaturen,
die an nanometergroßen Goldpartikeln erwartet werden können, lassen
sich bei den genutzten Bestrahlungen in zwei Bereiche unterteilen: den Bereich

Diskussion 193
bis zum spinoidalen Punkt d.h. bis zu einer erwarteten Blasenbildung und den
Bereich der Temperaturen darüber. Eine Inaktivierung bei Temperaturen unterhalb
des spinoidalen Punktes bei ca. 300◦C konnte in keinem der Experimente
mit aP-Au-Konjugaten bzw. chymo-Au-Konjugaten, die homogen mit Nanosekundenpulsen
bestrahlt wurden, beobachtet werden. Das Gleiche gilt für aP-Au-
Konjugate, die mit Pikosekundenpulsen und maximal 2.1 mJ/cm 2 (ca. 210 ◦ C)
homogen mit bis zu 10000 Pulsen bestrahlt wurden und für die scannende Bestrahlung
von chymo-Au-Konjugaten, bei der ebenfalls eine Inaktivierung bei
Temperaturen unterhalb des spinoidalen Punkts erwartet werden konnte.
Die Ergebnisse der Bestrahlungen mit ps-Pulsen sind jedoch nur schwer in Hinblick
auf eine thermische Proteindenaturierung zu interpretieren, da der Temperaturgradient
um die Partikel so stark ist, dass die Temperatur schon innerhalb
der einen Proteinschicht um mehr als die Hälfte abfällt. Nimmt man an, dass
die Temperatur an der von der Goldoberfläche abgewandten Proteinseite die nach
der Extrapolation erwartete Temperatur erreichen muss, so ist die Temperatur an
Innenseite der Proteinschicht bereits so hoch, dass man dort mit Blasenbildung
rechnen muss.
Auch für Goldkonjugate konnte somit keine thermische Inaktivierung in dem
erwarteten Temperatur- und Zeitbereich gemessen werden.
Zusammenfassende Diskussion thermischer Mikroeffekte
Es kann in Hinblick auf eine thermische Denaturierung festgestellt werden, dass
eine Extrapolation der Raten, die bei Heizdauern im Sekundenbereich und Temperaturen
bis zu 100◦C beobachtet wurden, nach dem Arrheniusgesetz zu hohen
Temperaturen und kurzen Zeiten nicht möglich ist.
Mögliche kovalente proteininhärenten Schäden, wie die Deamidierung von Asparagin-
und Glutaminsäureresten, die Cysteinoxidierung und die Thiol-katalysierten
Disulfidbrückenveränderungen [11, 199, 38, 2, 197, 196, 98], die für α-
Chymotrypsin beobachtet wurden [131, 178], sowie die für alkalische Phosphatase
von Schlesinger beobachteten Schäden, die bei Temperaturen bis 100◦Cfür eine
irreversibel thermische Schädigung der Enzyme verantwortlich sind, spielen bei
den kurzen Zeiten keine entscheidende Rolle.
Dies lässt sich mit den bei verschiedenen Temperaturen beobachteten Raten an

194 Diskussion
einzelnen Aminosäuren erklären, die um 1 bis 3 Grössenordnungen zu langsam
sind, [199, 11], um direkt für den Schaden verantwortlich sein zu können. Für
große Proteine aus vielen hundert Aminosäuren, für die die Schadenswahrscheinlichkeit
entsprechend steigt, kann eine Inaktivierung durch Modifikationen kovalenter
Bindungen jedoch nicht ausgeschlossen werden.
Der Einfluss kovalenter Modifikationen, die eine thermische Stabilität von Proteinen
zu hohen Temperaturen hin begrenzen sollten, ist nach Daniel [38] auch
abhängig von dem Entfaltungsgrad der Proteine, da die Reaktionspartner für die
kovalenten Reaktionen durch den hydrophoben Proteinkern nicht zu den entsprechenden
Gruppen gelangen können.
Zusammen mit der Tatsache, dass an α-Chymotrypsin -Konjugaten keine Inaktivierung
durch Aggregation mit zugesetztem Protein beobachtet werden konnte,
stellt sich damit die Frage, ob die Proteine intakt bleiben, weil die Proteine zu
nahezu 100% zurückfalten oder ob sie sich in den kurzen Heizzeiten gar nicht erst
ausreichend entfalten, um irreversible Schäden zu unterlaufen.
Die von Lange mit einer hohen Zeitauflösung gemessenen Raten [105] liegen bei
den Temperaturen bis 40◦C, bei denen Pohl die Entfaltung messen konnte, höher
als die Pohlschen Raten, nehmen jedoch sehr viel langsamer mit der Temperatur
zu als die Pohlschen Raten. Es ist somit vorstellbar, dass die von Lange beobachteten
Raten durch eine teilweise Entfaltung hervorgerufen wird, die jedoch
erfolgen muss, bevor die vollständige Entfaltung erfolgen kann, so dass diese Rate
die Geschwindigkeit limitiert.
Vergleicht man die Rate von Lange mit weiteren Raten, die bei Chymotrypsin
und ähnlichen Strukturen beobachtet wurden, so konnte Tsong [190] Absorptionsänderungen
von Chymotrypsinogen bei 280 nm mit zwei unterschiedlichen
exponentiellen Zeitabhängigkeiten verfolgen. Eine der Raten ist dabei deutlich
höher als die von Lange beobachtete. Die zweite entspricht im Rahmen der Fehler
der von Lange gemessenen Rate. Aufgrund der geringsten Stabilität von β-
Haarnadelschleifen im Vergleich zu β-Faltblatt- oder α-Helixstrukturen ist die Assoziation
der schnellen Raten mit der Entfaltng von äusseren β-Haarnadelschleifen
denkbar. Die Rate der Entfaltung dieser Struktur wurde von Munoz [132] expe-
rimentell zu 1·10 6 1/s bei 50 ◦ C bestimmt und von Pande [142] modelliert. In den
Modellrechnungen kommt es bereits nach 300 ps bei 127 ◦C zu einer weitgehenden
Entfaltung. Die Raten liegen damit 4 Grössenordnungen über den von Lange be-

Diskussion 195
obachteten Raten. Diese schnelle Raten weisen alle eine geringere Zunahme mit
der Temperatur auf als die von Pohl gemessene Rate und können die Raten zu
hohen Temperaturen limitieren.
Die Tatsache, dass von Tsong zwei Raten gleichzeitig beobachtet wurden und
alle Raten zusammen mit denen von Munoz und Pohl 8 Grössenordnungen im
gleichen Temperaturbereich von 12 ◦ Cbis45 ◦ C umspannen, deutet darauf hin,
dass die Inaktivierung von α-Chymotrypsin ein komplexer mehrstufiger Prozess
ist und vorstellbar ist, dass es lediglich zu einer Teilentfaltung kommt.
Für eine komplexere Entfaltung mit Zwischenkonformationen, die nicht ausreichend
schnell weiter entfalten, spricht zusätzlich, dass eine Aggregation der Proteine
auf den Partikeln auch ohne Zusatz von Aggregationsprotein wahrscheinlich
ist. Die Proteine auf der Oberfläche sind dicht an dicht immobilisiert und für
den Fall, dass alle entfalten, kann eine Agreggation der Proteine untereinander
erwartet werden.
Eine Nicht-Arrheniuskinetik” der Inaktivierung mit mindestens einem Zwischen-
”
zustand wurde von Ahern, Klibanov, Siksnis und Mozhaev [2, 131] für einzelne
Proteinstrukturen unter anderem von modifiziertem α-Chymotrypsin zu hohen
Temperaturen hin für die geringe beobachtete Inaktivierung verantwortlich gemacht.
Mozhaev hat Sprünge in den Inaktivierungsraten mit steigendender Temperatur
für α-Chymotrypsin und deren Derivate beobachtet. Mozhaev kommt zu
dem Schluss, dass für modifiziertes α-Chymotrypsin nur bedingt eine Inaktivierung
entsprechend der Arrheniuskinetik angenommen werden kann und erklärt
diesen Sprung in der thermischen Denaturierungskinetik damit, dass das Enzym
aus dem Grundzustand parallel auf mindestens zwei Wegen mit unterschiedlichen
Ratenkonstanten inaktiviert werden kann. Ein Reaktionsweg läuft dabei
über einen Zwischenzustand. Kommt das Enzym in diesen Zwischenzustand,
so denaturiert es nach den Untersuchungen durch kovalente Veränderungen wesentlich
langsamer als aus dem nativen Zustand. Das Protein befindet sich in
einer Art kinetischen Falle” , die in einem bestimmten Temperaturbereich eine
”
Abnahme der Denaturierungsrate mit steigender Temperatur bewirkt.
Zusammenfassend können die Ergebnisse erklärt werden, indem man eine gehemmte
Entfaltung der Proteine oder eine fast ideal reversible Entfaltung annimmt.
Chemische Modifikationen der Proteine scheinen nicht zu einer Inaktivierung
zu führen. Aggregation war der einzige Mechanismus, der zu einer

196 Diskussion
Inaktivierung in Mikrosekunden geführt hat.
Für die Schädigung von Zellen entspricht das dem aus der Hyperthermie bekannten
Schadensmechanismus, der Aggregation von Proteinen in Zellen, die
vollständig geheizt werden [110]. Will man mikrometergrosse absorbierende Partikel
in Zellen nutzen, um einen thermischen Schaden zu induzieren, so ist nach
den vorliegenden Ergebnissen damit zu rechnen, dass die Proteine in der geheizten
Kugelschale um die Absorber effektiv renaturieren. Zusätzlich kann ein Zellschaden
bei stark lokalisierter Erhitzung wesentlich geringer ausfallen, als wenn die
gesamte Zelle erhitzt wird, da nur ein sehr kleiner Anteil an Proteinen in der
gesamten Zelle entfaltet, und dadurch eine starke Aggregation verhindert wird.
6.2 Inaktivierung von Proteinen
durch Gold-Nanopartikel
Die zweite Fragestellung der Arbeit, inwieweit Nanopartikel genutzt werden können,
um selektiv Proteine zu inaktivieren und Zellen schädigen zu können, wird in
dem folgenden Abschnitt diskutiert. Einen Hinweis aus den Ergebnissen auf einen
proteinunabhängigen Schadensmechanismus an den Partikeln, erhält man durch
die auffällig ähnliche Abhängigkeit der Inaktivierung von der Bestrahlung bei aP-
Au-Konjugaten und chymo-Au-Konjugaten trotz der strukturellen Unterschiede
der Proteine.
6.2.1 Fragmentierung und Blasenbildung
Aufgrund der starken Änderung von Absorption und Wärmeleitung oberhalb des
spinoidalen Punktes von Wasser (ca. 300◦C) können die bei der Inaktivierung
der Proteine auftretenden Temperaturen sehr schlecht abgeschätzt werden. Nach
den Temperaturrechnungen ist aber zu erwarten, dass der Schmelzpunkt von
Gold überschritten wird. Für eine Abschätzung der erreichten Temperaturen ist
deshalb die Fragmentierung der genutzten Goldpartikel ein wichtiger Anhaltspunkt.
Bis zu Bestrahlungen von ca. 10 mJ/cm2 bei Pulsen mit 35 ps Pulslänge
und ca. 600 mJ/cm2 bei Nanosekundenpulsen kann man nach den Temperaturrechnungen
davon ausgehen, dass 15 nm Goldpartikel intakt bleiben, d.h. nicht

Diskussion 197
schmelzen. Elektronenmikroskopische Untersuchungen zeigten nach Bestrahlung
mit 35 ps Pulsen bis 34 mJ/cm2 noch keine Fragmentierung der 15 nm Partikel.
Bei 55 mJ/cm2 wurde eine schwache Fragmentierung beobachtet. Oberhalb
dieser Bestrahlungen kommt es zu einer Zerstörung der Partikel. 80 nm Partikel
wurden bereits bei 54 mJ/cm2 vollständig bis auf eine Fragmentgrösse unter
10 nm zerstört.
Ein Vergleich der Temperaturen, die unter der Annahme einer über den gesamten
Temperaturbereich unveränderten Kühlung durch Wärmeleitung bzw. einer
vollständigen Isolation ab 300 ◦CinAbhängigkeit von der Bestrahlung abgeschätzt
wurden, zeigt, dass die Fragmentation bei Bestrahlungen auftritt, die
erwartet werden, um die Partikel bis über den Schmelzpunkt zu erwärmen, die
im Fall der Pikosekundenpulse jedoch nicht ausreichen, um die Partikel zu verdampfen.
Die Zerstörung von Gold- und Silberkolloiden unter Bestrahlung mit
Nanosekundenpulsen bei 532 nm wurde auch von Takami und Kamat beschrieben.
Unter Bestrahlung von bis zu 160 mJ/cm2 wurde eine Umwandlung von
Partikeln mit 50 bis 36 nm Durchmesser in 10 nm grosse Partikel beobachtet.
Für hohe Konzentrationen an Gold oder für Goldcluster wurde eine Goldpartikelfusion
beobachtet und für elliptische oder eckige Partikel eine Umwandlung in
runde [103, 91, 153, 185]. Die Fragmentierung von 40 bis 50 nm Partikel, die unter
Bestrahlung mit 7 ns Pulsen bei 30 mJ/cm2 beginnt, führt zu kleineren Partikeln.
Bei 28 mJ/cm2 konnte Takami bereits die Verformung von eckigen in runde Goldpartikel
beobachten, die bei 14 mJ/cm2 noch nicht beobachtet werden konnte.
Die maximale Fragmentgrösse nimmt mit der Bestrahlung kontinuierlich ab und
erreicht ab 250 mJ/cm2 die Endgrösse von ca. 10 nm, die bis zu einer Bestrahlung
von 900 mJ/cm2 unverändert bleibt [184]. Die aus dem Temperaturmodell der
vorliegenden Arbeit berechnete Temperaturerhöhung beträgt für die Partikel die
Takami in seinen Versuchen eingesetzt hat 13.5 K/(mJ/cm2 ) (36 nm Partikel)
und 21 K/(mJ/cm2 ) (50 nm Partikel) bei voller Wärmeleitung. Die beim Einsetzen
der Fragmentierung erwarteten Temperaturen liegen demnach über 300◦C. Der genaue Wert hängt stark von der Kühlung der Partikel ab. Bei den Temperaturabschätzungen
von Takami [184] wurde angenommen, dass an der Oberfläche
verdampfendes Wasser die Abkühlung der Partikel durch Wärmeleitung
auf 10 6 W/cm 2 begrenzt. Stimmt diese Abschätzung, werden Temperaturen zwi-
schen 10000 und 30000◦C erwartet, ohne dass die latente Wärme berücksichtigt
ist. Berücksichtigt man diese, so werden Temperaturen zwischen Schmelz- und

198 Diskussion
Siedepunkt von Gold erwartet. Bei den resultierenden 10 nm Partikeln würde eine
Bestrahlung von 160 mJ/cm2 dagegen nur eine Temperaturerhöhung von 200 K
erzeugen. Die Autoren dieser Arbeiten erklären die Veränderung der Partikelgrösse
durch ein Aufschmelzen und Verdampfen des Goldes, dass zu einer Fragmentierung
der Goldpartikel führt. Da aber das wahre Ausmaß der Wärmeleitung
nach Entstehung der Blase, das gerade bei ns-Pulsen die Temperaturen stark beeinflusst,
nicht bekannt ist, ist der Wert solcher Temperaturabschätzungen stark
zu bezweifeln.
Neben der hohen Temperatur können thermoelastische Effekte für die Fragmentierung
verantwortlich sein. Die Stärke thermoelastischer Effekte wird durch das
Verhältnis der Laserpulsdauer τL zur sogenannten akustischen Relaxationszeit
τakust bestimmt. τakust ist die Zeit, die der Schall benötigt, um die erhitzte Struk-
tur, hier die Goldpartikel, zu durchqueren.
τakust = d
vSchall
Die Stärke der thermoelastischen Druck- und Zugwellen wird durch den Faktor
A = 1 − e− τ L
τ akust
τL
τakust
(6.2)
(6.3)
bestimmt [32], der im Falle des akustischen Einschlusses 1 wird. Für eine Fragmentierung
können in erster Linie Zugwellenanteile, die an der Grenzfläche Gold-
Wasser entstehen und in das Partikel zurücklaufen [113], verantwortlich sein. Für
eine Schallgeschwindigkeit von 2000 m/s in Gold und 35 ps Pulslänge beträgt A
bei 80 nm Goldkugeln mit 0.7 dreimal so viel wie bei 15 nm Partikeln. Damit
könnten bei 80 nm Goldpartikeln thermoelastische Effekte bei der Fragmentierung
eine Rolle spielen. Vor allem nach Aufschmelzen der Partikel kann die Zugwelle
den flüssigen Goldtropfen leicht zerreißen. Der Unterschied in der Fragmentierung
von 15 und 80 nm Goldpartikeln kann damit neben dem großen Unterschied
im Q-Faktor auch mit dem Unterschied der thermoelastischen Eigenschaften erklärt
werden. Für die 15 nm Partikel wird ein geringerer Einfluss akustischer
Effekte auf die Fragmentierung erwartet.
Blasenbildung um die Partikel
Nach Überschreiten des spinoidalen Punktes bei ca. 300◦C durch die Oberflächentemperatur
wird das Entstehen eines gasgefüllten Hohlraumes um die Partikel

Diskussion 199
erwartet. Hierdurch ändert sich die Umgebung der Proteine grundlegend, so dass
die in Lösung auftretenden Phänomene wie Entfaltung oder chemischen Modifikation
nur in veränderter Form auftreten können und zusätzlich neue Effekte
erwartet werden. Die Blasenbildung um Gold-Nanopartikel wurde mit Laserpulsen
der Dauer 280 ns, die weit außerhalb des akustischen Einschlusses liegt,
untersucht. Es konnte für aufgereinigte 15 nm und 80 nm Partikel keine simultane
Blasenbildung an allen Partikeln beobachtet werden, die ausreicht, um sich
als großflächige Verdampfung im bestrahlten Gebiet zu zeigen. Die vereinzelt
beobachteten Blasen scheinen mit Verdampfung um wenige in der Suspension
verbliebenen Absorber-Clustern zusammenzuhängen, die bei niedrigeren Temperaturen
einsetzt und größere Blasen erzeugt. Die Blasen, die an den einzelnen
Partikeln ab dem spinoidalen Punkt erwartet werden können, müssen demnach
wesentlich kleiner als die optische Auflösung des mikroskopischen Aufbaus von
ca. 1 µm sein, da sonst wegen der hohen Dichte der Partikel mit einer kompletten
Blase über den gesamten bestrahlten Bereich gerechnet werden müßte. Blasen
an Partikeln in einer Grösse nahe der optischen Auflösung machen sich durch
eine veränderte Absorption und Streuung bemerkbar. Dies wurde in Messungen
zum sogenannten optical limiting”-Effekt beobachtet. Bei den Messungen
”
von Francois wurde eine Reduzierung der Transmission für nicht gestreutes Licht
um 70% durch Blasenbildung an 200 nm Partikeln beobachtet [59]. In Untersuchungen
an 15 nm Goldclustern konnte durch Bestrahlung mit 14 ns Pulsen
bei 532 nm eine exponentiell mit der Bestrahlung zunehmende Reduktion der
Transmission der Proben beobachtet werden, die bei 100 mJ/cm2 einsetzt und
sich bis 10 J/cm2 fortsetzt. Die Ergebnisse sprechen aufgrund der zu erwartenden
Temperaturen von ca. 175 bis 200◦C, bei denen der Effekt einsetzt, für eine
Blasenbildung und nicht für ein Schmelzen von Gold, wie es in der Arbeit von
Francois diskutiert wird. Pump-Probe-Experimente mit ps-Pulsen zeigten, dass
die Reduktion der Transmission schon nach wenigen Nanosekunden ihr Maximum
erreicht. Blasenbildung wird von den Autoren als Ursache hierfür ausgeschlossen,
da aus Experimenten mit Graphitpartikeln kein Unterschied der Kinetik
der Transmissionsänderung zwischen Wasser und Ethanol als Lösungsmittel
gefunden wurde [49]. Dieses Argument ist nicht schlüssig, da bei den hohen
Oberflächentemperaturen in diesen Experimenten nicht unbedingt zu erwarten
ist, dass sich die dagegen relativ geringen Unterschiede der thermischen Eigenschaften
der Lösungsmittel auf die Kinetik der Blasenentstehung auswirken. Ein

200 Diskussion
weiteren Hinweis darauf, dass Blasen schon in den ersten Pikosekunden nach der
Temperaturerhöhung über den spinoidalen Punkt auftreten können, erhält man
aus Modellrechnungen, in denen die Temperatur und die Dampfblasenbildung
an Goldoberflächen molekulardynamisch berechnet wurde [47, 46]. Nach diesen
Rechnungen löst sich eine Wasserschicht aus 48 Wassermoleküllagen innerhalb
von 230 ps vollständig von der Goldoberfläche ab. Die hier vorliegenden und
zitierten Experimente deuten somit auf eine Entstehung von Blasen mit einem
Durchmesser im Nanometerbereich hin, sobald die Oberflächentemperatur den
spinoidalen Punkt überschreitet.
Nimmt man an, dass alle Proteine nach Entstehung einer Blase innerhalb der
Blasenlebensdauer vollständig inaktiviert werden, so hängt der Inaktivierungsverlauf
mit Bestrahlung nur noch von den Inhomogenitäten des Laserstrahls ab.
Dann müsste eine drastische Inaktivierung für Bestrahlungen beobachtet werden,
die Temperaturen im Bereich von 280 ◦ C bis 375 ◦ C zwischen dem spinoidalen und
dem kritischen Punkt von Wasser induzieren. Dies war nach den Temperaturberechnungen
in keinem der Experimente der Fall.
Auch bei Experimenten mit Mikrometerpartikeln hatte die Blasenbildung keinen
inaktivierenden Einfluß auf die Proteine. Selbst bei einem Vielfachen der Blasenbildungsschwelle
und Blasenlebensdauern von mehreren Mikrosekunden konnte
keine Inaktivierung beobachtet werden. Zusätzlich hat die Blasenbildung die Proteine
nicht von den Partikeln abgelöst. Die Blasenbildung führte somit in allen
Versuchen zu keinem Verlust der Proteinaktivität.
Nachdem Blasenbildung allein als Schadensmechanismus ausgeschlossen werden
kann, ist die Frage, wie sich das Aufschmelzen und die Fragmentierung der Partikel
auf die Aktivität der Proteine auswirkt.
Der Vergleich der experimentellen Ergebnisse mit den Schadensmodellrechnungen
bestätigt, dass bei Bestrahlung mit Nanosekunden-Pulsen und einem homogenen
Strahlprofil nach den Berechnungen Temperaturen am oder über dem Schmelzpunkt
von Gold erwartet werden. Auch im Fall der inhomogenen Bestrahlung
gibt die Berechnung eines Schadens mit einer hohen Schwelle am besten den
experimentell beobachteten Inaktivierungsverlauf wieder.
Bei der Bestrahlung mit ps-Pulsen wurde eine Bestrahlung zur Inaktivierung
benötigt, die nach den Temperaturrechnungen selbst bei andauernder Wärmeleitung
ab 31 mJ/cm2 zu einer Verdampfung der Partikel führen sollte. Im Widerspruch

Diskussion 201
dazu wurde erst bei Bestrahlungen über 55 mJ/cm2 ein hoher Anteil der Partikel
fragmentiert, so dass die Partikel eventuell erst bei Bestrahlungen über
55 mJ/cm2 aufschmelzen und fragmentiert werden. Dies könnte mit den Annahmen
erklärt werden, dass entweder die Blasen Laserlicht streuen, so dass die
Partikel weniger geheizt werden oder die Absorption der Partikel stark abnimmt.
Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass nicht die hohe Temperatur allein für den
Schaden verantwortlich ist, sondern eventuell die strukturelle Veränderung von
Gold und eine Fragmentierung nötig ist, um die Proteine zu inaktivieren. Bemerkenswert
dabei ist, dass nach der Bestrahlung der 15 nm Partikel bis zur Fragmentierung
der Partikel keine Veränderung der elektronenmikroskopisch sichtbaren
Proteinhülle erfolgt. Die Proteine werden demnach bei den Temperaturen am
Goldschmelzpunkt weder verdampft noch karbonisiert. An den Fragmenten der
Partikel, die bei hohen Bestrahlungen entstehen, ist ausserdem noch Protein an
der Partikeloberfläche zu finden. Ob es sich dabei um Protein handelt, das sich
nach der Bestrahlung wieder an die Fragmente angelagert hat, da diese chemisch
derart verändert wurden, dass es wieder zu einer Bindung kommen konnte, oder
ob es sich um Protein handelt, das unverändert an der Oberfläche haften blieb,
kann nicht sicher festgestellt werden.
Zusammenfassend wird die Inaktivierung der Konjugate durch einen Schadensmechanismus
in Zusammenhang mit dem Aufschmelzen und der Fragmentierung
von Gold für ns und ps Pulse am besten widergegeben. Blasenbildung führt nicht
zur Inaktivierung der Proteine.
6.2.2 Photochemie
Die Proteine könnten auch durch photochemische oder oberflächenkatalysierte
Prozesse inaktiviert werden. Für einen photochemischen Schaden kommt klassische
Photochemie nach Einphotonenabsorption nicht als Mechanismus in Frage,
da sowohl die Inaktivierung von Proteinen in Lösung im Vergleich zur Inaktivierung
der Protein-Absorberkonjugate zu vernachlässigen ist als auch keine lineare
Abhängigkeit von der Bestrahlungsenergie beobachtet werden kann. Dies wird
besonders in den Experimenten unter ps Bestrahlung mit unterschiedlichen Pulszahlen
deutlich. Eine Bestrahlung mit 20 mJ/cm2 und 500 Pulsen führt nicht
zu dem gleichen Effekt wie eine Bestrahlung mit 10000 Pulsen und 1 mJ/cm2 .

202 Diskussion
Beides ist jedoch charakteristisch für photochemische Prozesse. Zwei- oder Mehrphotonen
Photochemie kann jedoch für die Inaktivierung verantwortlich sein. Die
20% Inaktivierung der Enzymlösungen nach Bestrahlung mit 10000 Pulsen mit
35 ps Pulslänge bei 55 mJ ohne entsprechende Inaktivierung bei Bestrahlung mit
Nanosekundenpulsen könnte mit einem 2-Photonen-Prozeß erklärt werden. Eine
Abschätzung zeigt, dass eine durch 2-Photonenabsorption induzierten Photochemie
an den aromatischen Aminosäuren eine Rolle spielen kann. Aminosäuren
zeigen bei Bestrahlung mit 254 nm eine chemische Dekomposition mit einigen
Prozent Quantenausbeute ηPD [135]. Die photochemische Schädigungsrate k2Ph
kann mit Hilfe des 2 Photonenabsorptionsquerschnitts: σ2Ph =10 50 cm2 s
P hoton für
die Bestrahlungsparameter berechnet werden [201]. Das Schadensintegral bei
Bestrahlung mit nPuls Pulsen ergibt sich zu:
�
Ω=
k2Phdt = nPulsηPDσ2Ph
�
E
τPulsEPh
� 2
τPuls
(6.4)
Für eine Pulsbreite von τPuls =36ps, einer Bestrahlung E=54 mJ/cm 2 ,einer
Quanteneffizienz der Photodekomposition von 5% und 105 Pulsen ergibt sich
das Schadensintegral Ω zu 2 × 10−3 . Die Ergebnisse der Berechnung des Schadensintegrals
sind in der folgenden Tabelle für die verschiedenen angewandten
Bestrahlungen zusammengefaßt.
τlaser Pulszahl Bestrahlung [mJ/cm 2 ] Schadensintegral
6ns 1 395 9.6 ∗ 10 −8
6ns 100 160 1.5 ∗ 10 −6
35 ps 500 55 1.5 ∗ 10 −4
35 ps 10000 28 7.5 ∗ 10 −4
Tabelle 6.1: Schadensintegral durch 2-Photonenphotochemie an Aminosäuren für ps-
Puls und ns-Puls Bestrahlung.
Es ist ersichtlich, dass die zu berechnenden photochemischen Schäden um mehr
als eine Größenordnung zu gering sind. Die Unsicherheit der Quantenausbeute
ηPD und des 2 Photonenabsorptionsquerschnitts σ2Ph sowie die Anwesenheit vie-
ler Aminosäuren in einem Protein kann die photochemischen Schäden dennoch
erklären. So enthält alkalische Phosphatase 44 aromatische Aminosäuren (Phe,
Trp, Tyr) und α-Chymotrypsin 29. ZähltmanHistidinzudenphotochemisch

Diskussion 203
labilen Aminosäuren, so erhöht sich die Zahl bei alkalischer Phosphatase um 262
und bei α-Chymotrypsin um 19. Aufgrund der deutlich stärkeren Inaktivierung
der Goldkonjugate muss jedoch ein mit der Goldoberfläche zusammenhängender
Effekt für die Inaktivierung hinzukommen. Eine an einzelnen metallischen Nanostrukturen
und Gold-Nanopartikeln beobachtete Feldverstärkung [192, 146, 187]
könnteeineVerstärkung der in den Proteinen absorbierten Energie um ein bis
zwei Größenordnungen bewirken. Eine solche Verstärkung reicht aus, um die
Inaktivierungskurven der Proteine nach Pikosekundenbestrahlung über eine photochemische
Denaturierung zu erklären.
Eine weiterer photochemischer Mechanismus wurde in Zusammenhang mit der
Bestrahlung von Gold-Nanopartikeln von Zhang [205] und McGrath vorgeschlagen.
Bei Bestrahlung von 100 nm Goldpartikeln mit etlichen J/cm2 (532 nm;
ns-Pulse) konnte eine Verringerung der Partikelgröße in Verbindung mit der Bildung
von Au3+ Ionen nachgewiesen werden [121]. Diese wurden durch Zusatz
von CN − , das das Gold als [Au (CN) 4 ] − bindet, nachgewiesen. Außerdem ver-
schwand die für Goldkolloide charakteristische Absorptionsbande bei 530 nm. Angenommen
wird von McGrath ein thermisch erzeugter Übergang von Elektronen
aus den Partikeln ins Wasser, dem die Ablösung von Goldionen folgt. Bei hohen
Temperaturen ist die Bildung von freien Elektronen vergleichbar mit der
Freisetzung von thermischen Elektronen von heißen Metallen im Vakuum. Die
Lebensdauer ist jedoch aufgrund der reaktiven Umgebung wesentlich kürzer und
kann am ehesten mit der Lebensdauer von freien Elektronen in Wasser verglichen
werden, die im Bereich von 10 ps liegt [116]. Die freien Ladungsträger können
eine chemische Denaturierung von Proteinen bewirken.
Die Diskussion möglicher Schadensmechanismen der stark lokalisierten Proteininaktivierung
durch Gold-Nanopartikel zeigt, dass sich aus der vorliegenden Arbeit
und der Literatur noch kein vollständiges Bild der physiaklisch-chemischen
Prozesse und der Kinetik der beteiligten Prozesse ergibt. In den verschiedenen
Zeit- und Bestrahlungsparameterbereichen kann jedoch mit einer Blasenbildung
ab dem spinoidalen Punkt und einer anschließenden weiteren Erhöhung der Temperatur
bis über den Schmelzpunkt von Gold gerechnet werden. Dabei kommt es
auch zu einer Fragmentation der Partikel. Chemische Reaktionen wurden in Zusammenhang
mit Goldpartikeln, die bei diesen Bedingungen bestrahlt wurden, in
der Literatur beschrieben. Aufgrund dieser extremen Bedingungen an den Partikeloberflächen
nach Bestrahlung ist eine Trennung thermischer, mechanischer

204 Diskussion
und chemischer Schadensmechanismen für die Proteininaktivierung nicht mehr
möglich.
6.3 Selektive Schädigung von Zellen
Ziel der Zellversuche war zu zeigen, ob an Zellen mit Hilfe von Antikörper-
Goldkonjugaten selektiv Schäden durch Laserbestrahlung verursacht werden können.
Als erstes Ziel wurde eine selektive Abtötung von Tumorzellen gewählt, da mögliche
Ziele mit medizinischer Relevanz für eine subzelluläre Schädigung von Zellen erst
noch identifiziert werden müssen. Gleichzeitig wurde erwartet, dass bei einer
starken Anreicherung der Partikel an Zellrezeptoren und hohen Bestrahlungen
ein letaler Effekt induziert werden kann.
Für diese ersten Versuche wurde die CD30-positive Zelllinie L428 gewählt. Die
Zellen tragen eine mit anderen Rezeptoren vergleichbare Menge an CD30 Rezeptoren
von ca. 5 · 104 bis 3 · 105 [204, 107], so dass bei einer Sättigung der
Rezeptoren mit Partikeln eine großflächige Belegung der Plasmamembran mit
Partikeln erwartet werden kann. Die Zellen wurden mit Konjugaten aus BerH2
(anti-CD30) und 15 nm Gold inkubiert und bestrahlt. Als Kontrollen wurden
die CD30-negative Zelllinie U937, unbestrahlte und nicht inkubierte Zellen sowie
mit einem weiteren Antikörperkonjugat (MIB1-Au) inkubierte Zellen untersucht.
Das Antigen Ki-67 zu MIB-1 liegt nicht an der Zelloberfläche, sondern
wird im Zellinneren exprimiert. Die Ergebnisse der Bestrahlungen belegen eine
selektive und effektive Schädigung der L428-Proben nach Inkubation mit BerH2-
Goldkonjugaten.
Die Abtötung der Zellen ist mit >95% weder vollständig noch bleiben die Kontrollen
vollständig verschont. Die Kontrolle der mit BerH2-Gold inkubierten
U937-Zellen hat zu einer schwachen Schädigung bei den angewandten hohen Bestrahlungen
geführt. Eine für eine potentielle Tumortherapie entscheidende Frage
war somit, ob die 5% überlebenden L428-Zellen mit passenden Konjugaten innerhalb
eines Zellzyklus sterben und ob die leicht geschädigten Kontrollen innerhalb
eines Zellzyklus überleben. Nach den experimentellen Ergebnissen sind die
restlichen 5% L428-Zellen innerhalb von 24 Stunden vollständig gestorben. Die
Schäden waren selektiv durch das spezifische Konjugat bedingt. Die Kontrollzellen
haben sich in dieser Zeit nicht weiter verändert. Dass sich die Kontrollzellen

Diskussion 205
nicht wieder zu einem hohen Maß regeneriert haben, kann damit erklärt werden,
dass durch einen unspezifischen leichten Bestrahlungsschaden die Zellzyklusdauer
verlängert wurde und darüber hinaus die Zellkulturbedingungen in den 96-Well-
Platten suboptimal waren, was sich auch im hohen Anteil toter Zellen in der
Zellkultur schon vor der Bestrahlung widerspiegelt.
6.3.1 Schadensreichweite der Goldkonjugate
Die Abhängigkeit der partikelinduzierten Schäden von der Goldkonzentration im
Bestrahlungspufffer wurde qualitativ untersucht. In den ersten Experimenten
wurden Zellen nach Goldkonjugatinkubation gewaschen. In weiteren Experimenten
wurden Zellen im Inkubationspuffer bestrahlt. Eine nur grob mögliche
Abschätzung der Konzentration der Goldpartikel über die Verluste der einzelnen
Versuchsschritte ergibt ca. 5 · 105 bis 1 · 106 Partikel pro Zelle. Für Konjugate,
die nicht an die Zellen binden, entspricht das einer Konzentration, bei der in der
Umgebung von ca. 1 µm Schichtdicke der Zellen noch jeweils ca. 1000 Partikel
vorliegen. An Zellen ohne Konjugatbindung sollte insofern durch den ausgebliebenen
Waschschritt nur dann ein unspezifischer Schaden zu sehen sein, falls die
Schadensreichweite ca. 100 nm im Durchmesser überschreitet.
Die Experimente zur Abstandsabhängigkeit des Schadens an alkalischer Phosphatase
lassen eine wesentlich höhere räumliche Selektivtät bei einer Schichtdicke einer
Antikörperlage von ca. 10 nm erwarten. Ein Schaden mit dieser geringen Ausdehnung
kann durch einen thermischen Schadensmechanismus bei ps-Bestrahlung
erwartet werden, da der Temperaturgradient um die Partikel rechnerisch so hoch
ist, dass der Schaden auf eine Proteinlage begrenzt bleiben sollte. Für photochemische
Effekte oder Schäden in Zusammenhang mit dem Aufschmelzen von Gold
kann erwartet werden, dass die Schadensreichweite ebenfalls im Bereich einer
Proteinlage liegt, da die Diffusionslängen von Radikalen [111, 88, 167] und von
Elektronen [116] in proteinhaltiger Lösung im Bereich von wenigen Nanometern
liegen.
Kommt es zum Aufschmelzen von Gold und gleichzeitig zu einer spinodalen Dekomposition
des Wassers, so kann die explosive Blase das geschmolzene Gold in
dieser Region verteilen und so zu weiteren Reaktionen und Schäden führen. Da an
den Goldpartikeln nach Bestrahlung jedoch noch Proteinfragmente in der Größe

206 Diskussion
vollständiger Proteine zu finden waren, scheint das fragmentierte Gold nicht so
reaktiv zu werden, dass es die Proteine zerstört.
6.3.2 Mechanismen der Zellschäden
Um der Frage weiter nachzugehen, welcher Mechanismus für den Zelltod verantwortlich
ist, und welche Rolle die Plasmamembran spielt, wurde die Energieabhängigkeit
der Zellschädigung für unter physiologischen Bedingungen inkubierte
Zellen mit auf Eis inkubierten Zellen verglichen. Die Zellen wurden nach Inkubation
nicht gewaschen. Die Partikel lagen demnach in einer Konzentration vor,
dass sich ca. 1000 Partikel allein aufgrund ihrer hohen Konzentration nahe der
Zelloberfläche befanden. Die Fluoreszenzverteilung der lebend-/tot-Anfärbung
der Zellen (PI/BCECF) in Abhängigkeit von der Bestrahlung zeigte ein sehr unterschiedliches
Bild für die Inkubation auf Eis im Vergleich zur Inkubation bei
37◦C. Die auf Eis inkubierten Zellen nehmen PI auf, bevor die Esterasensubstratfluoreszenz
abnimmt (Zwischenzustand 4). Der Anteil der Zellen in dieser Region
nimmt bis zu der Bestrahlung von 54 mJ/cm2 zu. Ein Übergang in eindeutig
tote Zellen (Region 2) wurde nicht beobachtet. Diese Ergebnisse deuten darauf
hin, dass die Membran in einen porierten Zustand gebracht wird und so lange
so verbleibt, dass PI noch 5 Minuten nach Bestrahlung in die Zelle diffundiert
konnte. Der Schaden ist jedoch so gering, dass die sehr viel größeren Esterasen
nicht austreten konnten.
Die bei 37◦C inkubierten Zellen nehmen PI in dem Maße auf wie die Esterasensubstratfluoreszenz
abnimmt (die Zellen wandern von Region 1 in Region 2). Dies
äußert sich in der Zunahme der Zellen in Region 3, die Region 1 und 2 verbindet.
Oberhalb von 40 mJ/cm2 nimmt die Anzahl der Zellen in dieser Zwischenregion
wieder ab. Die gleichzeitige Zunahme der PI-Fluoreszenz und BCECF-Abnahme
deutet darauf hin, dass die Membran eine Poration schnell wieder beseitigen
kann, weil die von der Temperatur abhängigen Fluidität nicht beeinträchtigt ist.
So sind bei 37◦C zu einem Zeitpunkt weniger Möglichkeiten für PI vorhanden als
auf Eis, um durch Poren in die Zelle einzudringen.
Nach den Ergebnissen reagieren Zellen, die auf Eis bestrahlt wurden, nicht so
stark auf eindiffundierende Stoffe, was neben der erniedrigten Fluidität der Plas-

Diskussion 207
mamembran am reduzierten Stoffwechsel während der Bestrahlung liegen könnte.
Der Stoffwechsel der Zelle ist durch die Kühlung reduziert und kann nicht auf den
gesetzten Schaden reagieren.
Die bei 37◦C bestrahlten Zellen können dagegen schon während der ersten Minuten
auf den Plasmamembranschaden reagieren. Die mit der PI Zunahme gleichzeitige
Abnahme der Esterasenaktivität könnte durch solch eine biologische Antwort
erklärt werden. Diese könnte außerdem zur Auslösung von Apoptose führen,
die für den vollständigen Zelltod innerhalb von 24 h verantwortlich sein könnte.
Als weiterer Schadensmechanismus kommt eine Schädigung von Lysosomen in
Frage, in die Konjugate eventuell unspezifisch aufgenommen werden. Bei einer
Bestrahlung würden dann die Lysosomen geschädigt werden und könnten damit
den Zelltod bewirken. Sind mehrere Lysosomen betroffen, so kommt es durch die
pH-Veränderung zu einem Zusammenbruch des Plasmamembranpotentials und
durch die Ausschüttung von Verdauungsenzymen zu einem Abbau der aktiven
Enzyme in der Zelle. Der Anteil der auf diese Weise getöteter Zellen sollte durch
Inkubation auf Eis stark reduziert sein, da die Aufnahme der Konjugate in Lysosomen
durch eine quasikristalline Membran nicht mehr möglich ist.
Da die auf Eis inkubierten Zellen mit 40% einen deutlich höheren Anteil porierter
aber nicht eindeutig toter Zellen aufweisen, könnte ein Lysosomenschaden
zumindest teilweise für den Zelltot bei Bestrahlung unter physiologischen Bedingungen
verantwortlich sein. Gegen eine Lysosomembeteiligung spricht, dass
sich die Abhängigkeit des Anteils ungeschädigter Zellen (Region 1) von der Bestrahlung
bei den unterschiedlichen Inkubationbedingungen auch bei niedrigen
Bestrahlungen nicht signifikant unterscheidet.
Dies legt nahe, das der zuerst beschriebene Membranschaden für den Zellschaden
verantwortlich ist und damit der Unterschied zwischen der Inkubation auf Eis
und der Inkubation bei 37◦C in der Reaktion auf die Poration zu suchen ist.
Einen vergleichbaren Zellmembranschaden durch Goldkonjugate konnte Lin [114,
148] in Versuchen nach Bestrahlung mit 500 mJ/cm2 und 6 ns-Pulsen induzieren,
in denen Zellen mit 30 nm-Goldpartikeln über den CD8-Rezeptor markiert waren.
Lin geht in seinem Fall von einem Schaden durch Blasenbildung aus, der die Zellen
poriert. Als Indiz für die Poration wurde die Aufnahme von 10 kDA Fluorescein-
Dextran nach einer Markierung und Bestrahlung von Maus-Fibroblasten mit
20 nm kationischem Gold nachgewiesen, das nicht über eine Rezeptorkopplung,

208 Diskussion
sondern aufgrund der Ladung unspezifisch an die Zellmembran bindet. Nach diesen
Experimenten kommt Lin zu dem Schluss, dass Nanogold zur Poration von
Zellmembranen genutzt werden kann.
Zusammenfassend kann festgehalten werden, dass ein selektiver Effekt an der
Plasmamembran durch die Bestrahlung der mit Goldkonjugat markierten Zellen
ausgelöst wird. Die experimentellen Daten deuten darauf hin, dass ein Membranschaden
für den Zelltod verantwortlich ist und nicht eine Schädigung über
konjugatbeladene Lysosomen. Es ist aufgrund des Anteils nicht-toter Zellen nach
der Inkubation auf Eis zu vermuten, dass die Konjugate bei geeigneter Bestrahlung
sowohl für eine Poration der Zellen als auch für eine selektive Schädigung
bestimmter Zellrezeptoren genutzt werden können. Eine Nutzung der Konjugate
zur selektiven Zerstörung von Zellen ist bei hohen Bestrahlungen effektiv möglich.

Kapitel 7
Ausblick
Zu den Schwerpunkten der Arbeit über die Nutzung von nano- bis mikrometergrossen
Partikeln in der Lasermedizin und Biotechnologie, sowie zu den Beiträgen
zum Verständinis der thermischen Proteindenaturierung und schließlich zu Probenbestrahlungstechniken
soll in den folgenden Abschnitten ein kurzer Ausblick
gegeben werden.
7.1 Thermische Proteindenaturierung
Die Experimente haben in Hinblick auf eine thermische Proteindenaturierung
ergeben, dass es in den Modellsystemen zu keiner thermischen Denaturierung
nach extrapolierten Raten bei hohen Temperaturen im Bereich von über 180◦Cin Zeiten unter Mikrosekunden kommt. Dies kann in erster Linie durch eine effektive
Rückfaltung der entfalteten Enzyme oder durch eine gar nicht erst stattfindende
Entfaltung erklärt werden.
In zukünftigen Untersuchungen, in denen eine Inaktivierung von Proteinen ohne
Berücksichtigung der Umgebung erreicht werden soll, sollte man sich demnach an
der Kinetik von kovalenten Strukturveränderungen vor allem an Asparagin- und
Cysteinsäure orientieren. Für Untersuchungen der thermischen Denaturierungskinetik
von Proteinen in Zellen oder Gewebe sollte in zukünftigen Versuchen ein
Augenmerk auf die Umgebung, d.h. auf Stoffe im Puffer der untersuchten Proben
gerichtet werden, die zu einer Aggregation führen. Die Umgebung sollte von
der Stoffzusammensetzung und der -konzentration einer zellulären Umgebung, in
209

210 Ausblick
der das Testprotein vorkommt, entsprechen, da Proteine durch ihre Umgebung
häufig auch stabilisiert werden. Ein mögliches Modellsystem zur Untersuchung
der Konzentrationseinflüsse besteht darin, Proteine in inversen Micellen zu untersuchen,
in denen sie sowohl hydrophobe Grenzflächen als auch eine hohe Proteinkonzentration
vorfinden. Neben der Umgebung der Proteine sollte in den
Untersuchungen ein verstärktes Gewicht auf Strukturuntersuchungen nach der
Denaturierung gelegt werden, d.h. auf Beantwortung der Fragen, welche Proteinstrukturen
primär an der thermischen Denaturierung beteiligt sind, ob sich
ein Dimer in Monomere trennt oder wo kovalente Veränderungen auftreten. Dies
kann z.B. über eine einfache Massenanalyse in einer Gelektrophorese [206] erfolgen.
Da sich in den Versuchen der Zeitbereich von Mikro- bis Millisekunden als besonders
wichtig in Hinblick auf die thermischen Effekte herauskristallisiert hat,
leistungsfähige Laser für eine homogene Bestrahlung jedoch technisch aufwendig
und teuer sind, stellt sich die Frage, ob nicht dünne metallische Schichten, die
als ohmscher Widerstand elektrisch geheizt werden können, für solche Untersuchungen
geeignet sind. Enzyme, die an solche Schichten gekoppelt sind, können
mit einem einfachen Strompulsgenerator homogen erhitzt werden. Die Heiz- und
Abkühldauern lassen sich wie bei Mikropartikeln bis in den Mikrosekundenbereich
bringen, sofern die Schichten ausreichend dünn sind. Die Veränderungen
der Proteine auf den Schichten kann über Fluoreszenztechniken oder auch über
ellipsiometrische Messungen verfolgt werden. Zur Verfolgung der Entfaltung einzelner
Substrukturen bietet es sich an, Techniken analog zu den sogenannten
” molecular beacons “zu nutzen, so dass die Proteine derart modifiziert werden,
dass sie im gefalteten Zustand einen Farbstoff enthalten, der im entfalteten Zustand
fluoreszierend wird [207].
7.2 Biologisch beschichtete Absorber
als Mikroreaktoren
Die Experimente zeigen, dass sowohl alkalische Phosphatase als auch Chymotrypsin
bis deutlich über 100◦C bei Erhitzung mit Mikrosekundenpulsen stabil
blieben. Dies könnte für die praktische Nutzung solcher Partikel von Bedeutung
sein. Man kann danach für alle Proteine oder Biomoleküle, für die die thermische

Ausblick 211
Inaktivierungskinetik zu höheren Temperaturen abflacht, Reaktionen auf Partikeloberflächen
ablaufen lassen, die diffusionslimitiert sind und einen komplexen
zeitlichen Temperaturverlauf erfordern. Die hohen Temperaturen induzieren Blasen,
die für eine aktive Durchmischung des Mediums sorgen. Außerdem bewirken
die hohen Temperaturen eine erhöhte Reaktionsrate, die Reaktionen erlaubt, die
bei Zimmertemperatur nicht ablaufen. Ein Beispiel für eine mögliche Reaktion an
solchen Partikeloberflächen ist eine Polymerasekettenreaktion (PCR). In den meisten
herkömmlichen Aperaturen wird die PCR durch zwei Faktoren limitiert: Die
geringe Geschwindigkeit der Polymerasen und die langsamen Temperatursprungzeiten
aufgrund der großen Probenvolumen. Die Geschwindigkeit der Polymerasenkanninherkömmlichen
PCRs nicht durch Proteinmodifikationen wesentlich
verändert werden, da die Polymerasen bis zur Denaturierungs”-Temperatur der
”
DNA, d.h. 90◦C dauerhaft thermisch stabil sein müssen. Führt man nun eine
PCR analog zu einer solid Phase PCR [140] an Mikroabsorberoberflächen durch,
so können 4 Dinge kombiniert werden: 1.) Temperaturanstiegs- und Abfallszeiten
im Mikrosekundenbereich, 2.) über die Laserleistung einstellbare Temperaturen
an den Partikeloberflächen, 3.) keine wesentlich erhöhte Mediumstemperatur bei
ausreichender Verdünnung der Partikel und 4.) eine große aktive Oberfläche pro
Volumen. Die schnellen Temperaturabfallszeiten erlauben es bei allen involvierten
Reaktionen an das Geschwindigkeitslimit zu gehen, so dass diese Schritte
zeitlich minimiert werden können. Die über die Laserleistung wählbaren Temperaturen
ermögliche nahezu beliebige zeitliche Temperaturverläufe, die an die
optimalen Temperaturen für die Reaktionen angepasst werden können. Die Lokalisierung
der Temperatur auf die nahe Umgebung der Absorber erlaubt den
Einsatz von Polymerasen, die eine möglichst hohe Geschwindigkeit haben und
die nicht temperaturstabil sind. In Abbildung 7.1 ist schematisch der Ablauf
einer PCR auf Partikeloberflächen dargestellt.

212 Ausblick
vor
annealing
&
Primer
verlängerung
während
Laserpuls
Denaturierung
während des
Laserpulses
100°C
30°C
nach
annealing
&
Primer
verlängerung
Abbildung 7.1: Schematische Darstellung von drei Schritten einer partikelbasierten
Polymerasekettenreaktion(PCR). Das Beispiel soll illustrieren, dass Mikropartikel genutzt
werden können, um schnelle Temperaturverläufe zu induzieren, die biochemische
Reaktionen an den biologischen Geschwindigkeitslimits wie z.B. der Geschwindigkeit
der Polymerase ermöglichen. Außerdem ist es möglich, in der direkten Umgebung der
Absorber temperaturlabile Stoffe in den Prozeß einzubinden, da das Gesamtvolumen
nicht erhitzt wird. So sollte es z.B. möglich sein, auf Geschwindigkeit optimierte aber
nicht temperaturstabile Polymerasen für die PCR einzusetzten.
7.3 Selektive Proteininaktivierung
oder Zellabtötung
Die Versuche mit nanometergrossen Goldkonjugaten haben gezeigt, dass eine Inaktivierung
von Proteinen mit einer räumlichen Auflösung im Nanometerbereich
möglich ist. Zusätzlich haben die Experimente gezeigt, dass mit solchen Konjugaten
Zellen selektiv letal geschädigt werden können und bei entsprechender
Bestrahlung und Lokalisation der Konjugate gezielt die Zellmembran angegriffen
werden kann. Das macht das grosse Potential der Nanopartikel deutlich. Bei
Bestrahlungen, die für das umgebende Gewebe unbedenklich sind, können Zellen
lokal manipuliert bis abgetötet werden. Der Schlüssel für eine breite Anwendungen
auch gegen intrazelluläre Proteine oder Strukturen liegt in der Selektivität,

Ausblick 213
d.h. in der Beschichtung der Konjugate. Da für Konjugate mit einem Durchmesser
von 10 bis 15 nm Diffusion nicht ausreicht, um sie an Ihren Zielort zu bringen,
müssen biologische Stoffwechselwege genutzt werden. Hier wird der Vorteil
von Nanopartikeln gegenüber Farbstoffen deutlich. Sie können wesentlich besser
funktionalisiert werden, ohne dass sich die einzelnen Funktionen sterisch behindern.
Diese gute Funktionalisierbarkeit wurde in letzter Zeit für verschiedenen
Nanopartikel gezeigt. Quantum-Dots mit einer Peptidbeschichtung reichern sich
selektiv an Zellen und intrazellulär an [27, 4, 174, 30]. Goldpartikel mit mehreren
Funktionalitäten werden für Färbungen und therapeutische Anwendungen
wie z.B. der Blutwäsche [71, 72, 73] oder der DNA-Färbung mit Goldpartikeln
[144] untersucht.
Eine mögliche Anwendung liegt in der Aufklärung von Proteinfunktionen, da
sich goldnanopartikelmarkierte Proteine zu einem gewünschten Zeitpunkt, z.B.
einer morphologisch feststellbaren Zellzyklusphase inaktivieren lassen. Am Medizinischen
Laserzentrum Lübeck wird in Kooperation mit der Arbeitsgruppe Tumorbiologie
des Forschungszentrums Borstel die Nutzung der Partikel aufgrund
der Ergebnisse der Arbeit weiter untersucht werden. Dabei soll die Funktion
des Kernproteins Ki-67, das sich während der Zellteilung um die DNA anlagert
und ein potenter Zellwachstumsmarker ist, geklärt werden. In ersten Versuchen
konnte gezeigt werden, dass sich 15 nm Goldkonjugate, die mit dem Antikörper
MIB-1, der gegen Ki-67 gerichtet ist, selektiv an Ki-67 in Zelllysat und auch in
porierten Zellen an Ki-67 anlagern.
Außer zur Inaktivierung von Proteinen und deren Funktionsaufklärung sollen die
Partikel auf ihre Anwendbarkeit für eine Zellporation und Transfektion untersucht
werden. Dafür sollen Partikelkonjugate an die Zellmembran gebracht werden und
Laserparameter bestimmt werden, mit denen die Plasmamembran poriert werden
kann, so dass Plasmide oder andere Proteine in die Zellen eintreten können, ohne
die Zellen letal zu schädigen. Vor allem die nach den theoretischen Abschätzungen
erwarteten Mikroblasen mit einem Durchmesser von 50 bis 100 nm lassen auf eine
effektive Poration hoffen.
Die selektive Abtötung von nanopartikelmarkierten Zellen bei hohen Bestrahlungen
scheint eine aussichtsreiche Methode, um zirkulierende entartete Zellen oder
z.B. Bakterien abzutöten bzw. um Gewebekulturen aufzureinigen. Es ist gut
vorstellbar, dass man Blut im Durchflußverfahren extrakorporal in einer Küvette
bestrahlt, nachdem dem Patienten Nanopartikelkonjugate injiziert wurden, die

214 Ausblick
sich selektiv an maligne Zellen anlagern. Der Hauptvorteil gegenüber dem bisher
verwendeten Verfahren einer Aufreinigung über magnetische Partikel liegt in der
möglichen langen Inkubationsdauer im Körper und der schnellen Aufreinigung in
der Küvette.
Für eine Aufklärung der Schadensmechanismen um die Gold-Nanopartikel ist eine
direkte Temperaturmessung der Partikel während der Bestrahlung besonders interessant,
da die unsicheren physikalischen Parameter in der Wärmeleitung und
die Blasenbildung eine Berechnung der Temperaturen nicht ausreichend genau
zulässt. Erste Experimnete zur Messung der Temperatur über Schwarzkörperstrahlung
wurden von Serbin und Takami [173, 184] durchgeführt. Neben Messungen
der Schwarzkörperstrahlung scheint die Messung akustischer Signale, die
durch die Blasenbildung hervorgerufen werden, vielversprechend.
7.4 Handhabung von Nanoliterproben
Für die Bestrahlung und Auswertung der Partikelkonjugate und Zellen wurde
ein Aufbau entwickelt, in dem miniaturisierte Proben auf einfachen planen
Trägern bestrahlt werden können. In dem entwickelten Aufbau sind die Proben
vollständig unabhängig voneinander, so dass für Screeninganwendungen der Aufbau
modifiziert werden kann und eine hohe Dichte an Proben mit einem geringen
Material- und Kostenaufwand untersucht werden kann. Desweiteren kommt es
z.T. bei bisher zur Fluoreszenzassay-Herstellung verwendeten Techniken z.B. in
der Genom-Analytik zum Eintrocknen der Proben während der Herstellung von
Probenarealen. Dies erschwert eine quantitative Messung, da nur Fluoreszenzfarbstoffe
genutzt werden können, die auch in eingetrocknetem Zustand noch
auswertbar sind, wie z.B. Cy3 oder Cy5 und gleichmäßig antrocknen. Probleme,
die bei der Inkubation durch Eintrocknen auftreten, die bisher durch lipidhaltige
Schutzstoffe, Schutzgase [60], Betain [42] oder eine Kühlung auf nahe 0◦C verhindert werden, stellen in dem hier vorgestellten Aufbau kein Problem dar.
Vielmehr kann die Reaktionstemperatur auf das Temperaturoptimum der biochemischen
Reaktionen eingestellt werden, da sich das Wasserbad im thermischen
Gleichgewicht mit den Proben befindet. Baut man in den Deckel des Aufbaus
eine Pipettieranlage ein, die auch Teile von Proben entnehmen kann, so ist es
vorstellbar, auch Zellen in den Tröpfchen über einen Zeitraum von mehr als ei-

Ausblick 215
nem Tag zu kultivieren und zu untersuchen. Dies wäre vor allem für zellbasierte
Analyseverfahren im Bereich Wirkstofftestung (Drug Discovery) von Interesse.

216 Ausblick

Kapitel 8
Zusammenfassung
In der Lasermedizin wird die selektive Absorption feiner Strukturen zur gezielten
Schädigung von deren direkter Umgebung genutzt. In der vorliegenden Arbeit
wurde untersucht, ob durch Bestrahlung von künstlichen absorbierenden Partikeln
Schäden an Proteinen, Zellstrukturen oder Zellen induziert werden können.
Ausgangspunkt der Arbeit war, dass man mit für Zellen unbedenklichen Bestrahlungen
direkt um absorbierende Partikel hohe Temperaturen induzieren kann, die
thermische, mechanische und chemische Schäden bewirken können.
Im Fall eines rein thermischen Schadens wird eine der Arrheniusgleichung folgende
Denaturierungskinetik von Proteinen erwartet. Soll bei der Schadensinduktion
eine räumlich hohe Präzision erreicht werden, ist die nutzbare Heizzeit aufgrund
der Wärmeleitung begrenzt. Nach Extrapolation der thermischen Denaturierungsraten
bis zur thermischen Relaxationszeit von Partikeln mit zellulären bis
subzellulären Ausmaßen setzt die thermische Denaturierung im Temperaturbereich
von 100 bis 200◦C innerhalb von Mikro- bis Pikosekunden ein. Davon
ausgehend wurden zwei Fragestellungen untersucht:
1. Kann die Denaturierungskinetik von Proteinen zu hohen Temperaturen und
kurzen Zeiten nach der Arrheniusgleichung extrapoliert werden?
2. Können zelluläre Schäden durch laserbestrahlte Nanopartikel induziert werden?
Die Grundidee zur Klärung der ersten Fragestellung ist, über die Partikel Temperatursprünge
an den Proteinen vom Mikro- bis in den Pikosekundenbereich zu
217

218 Zusammenfassung
realisieren, die Untersuchungen der Denaturierungskinetik erlauben.
Als Modellsystem wurde die Bestrahlung von Enzym-Absorberkonjugaten etabliert,
wobei die Enzyminaktivierung als Maß für eine Proteinschädigung diente.
Die Wahl von Enzym-Goldkonjugaten mit 15 nm Partikeldurchmesser in Kombination
mit Bestrahlungspulslängen von 35 ps und 6 ns bzw. magnetithaltigen
Silikapartikeln mit > 8 µm Durchmesser in Kombination mit einer Bestrahlungspulslänge
von 15 µs ermöglichte eine Untersuchung der Denaturierungsrate der
Enzyme über 6 Größenordnungen in der Zeit.
Eine intensive homogene Bestrahlung wurde erreicht, indem ein Aufbau zur
Erstellung, Bestrahlung und Auswertung von Proben im Nanoliterbereich mit
Durchmessern unterhalb von nur 500 µm entwickelt wurde.
Experimentell konnte weder im Zeitbereich von Mikrosekunden bei Temperaturen
bis 180◦C noch im Zeitbereich von Nano- und Pikosekunden bei Temperaturen
bis 280◦C eine Inaktivierung beobachtet werden. Da die erwartete Inaktivierung
der Enzyme ausblieb, wurde geschlossen, dass die Denaturierungsraten der verwendeten
Proteine nach der Arrheniusgleichung nicht zu hohen Temperaturen
und kurzen Zeiten extrapoliert werden können.
Um eine Schädigung von zellulären Strukturen durch Nanopartikel nachweisen
zukönnen, wurde zur Beantwortung der zweiten Fragestellung die Bestrahlung
erhöht. Hierfür wurden die Proben mit einem gaußschen Strahl abgescannt.
Bei Bestrahlung mit Pikosekundenpulsen (35 ps) wurde eine Inaktivierung der
Enzym-Goldkonjugate erzielt, die bei 10 mJ/cm2 einsetzte und kontinuierlich bis
auf 70% Inaktivierung nach einer Bestrahlung mit 10 4 Pulsen bei 76 mJ/cm 2 zu-
nahm. Die Abhängigkeit der Inaktivierung von der Bestrahlung von alkalischer
Phosphatase und von α-Chymotrypsin war vergleichbar.
Zur Identifikation eines möglichen Schadensmechanismus wurden die experimentell
beobachteten Schäden mit Modellrechnungen verglichen. Ein thermischer
Effekt nach den extrapolierten Raten für die thermische Denaturierung kann
danach ausgeschlossen werden. Nach den Modellrechnungen und den Ergebnissen
kann ein bei einer bestimmten Schwellentemperatur einsetzender Prozeß die
Abhängigkeit der Inaktivierung von der Bestrahlung erklären. Die wahrscheinlichste
Schwellentemperatur ist der Schmelzpunkt von Gold. Das Schmelzen der

Zusammenfassung 219
Goldpartikel wird aufgrund der experimentell beobachteten Fragmentierung der
Partikel vermutet.
Eine Schädigung durch lineare photochemische Prozesse kann ausgeschlossen werden,
da die experimentell gemessenen Schäden nicht ausschließlich von der zugeführten
Energie abhängig waren. Nichtlineare photochemische Prozesse, Elektronenemission
der Partikel am Schmelzpunkt und oberflächenverstärkte Mehrphotonen-Photochemie
wurde an Goldpartikeln bei den in dieser Arbeit verwendeten
Bestrahlungen beschrieben, ohne dass Raten für diese Prozesse bekannt
sind. Daher können sie als Schadensmechnismus nicht ausgeschlossen werden.
Eine Blasenbildung um die Goldpartikel und um mikrometergrosse magnetithaltige
Silikapartikel führte nicht zu einer Inaktivierung der Proteine.
Die Präzision des Schadens um Nanogoldpartikel wurde bestimmt, indem Antikörper
als Abstandshalter zwischen alkalischer Phosphatase und dem Partikel
eingebaut wurden. In diesen Experimenten konnte nachgewiesen werden, dass
der Schaden auf die Proteinlage direkt auf der Partikeloberfläche begrenzt blieb.
Erstmals wurden Zellen (CD30 positiv) mit Hilfe von Nanogoldkonjugaten durch
Bestrahlung mit Pikosekundenpulsen selektiv letal geschädigt. Dafür wurden
Bestrahlungen von 10 mJ/cm 2 bis 50 mJ/cm 2 benötigt, die deutlich oberhalb
der erwarteten Blasenbildungsschwelle um die Partikel lagen.
Unterschiede in der Fluoreszenzanfärbung von Zellen, die bei physiologischen Bedingungen
und im Vergleich dazu auf Eis mit den Nanogoldkonjugaten inkubiert
und bestrahlt wurden, deuten darauf hin, dass hauptsächlich Schäden an der
Plasmamembran auftreten. Eine Poration lebender Zellen erscheint bei angepasster
Bestrahlung möglich.
Die vorliegende Arbeit zeigt, dass Zellen und Proteine mit Hilfe von absorbierenden
Partikeln laserinduziert mit hoher Präzision geschädigt werden können. Die
Extrapolation von Proteindenaturierungsraten nach der Arrheniusgleichung über
mehrere Grössenordnungen bis in den Nanosekundenzeitbereich ist nicht möglich.

220 Literaturverzeichnis

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chymotrypsin adsorbed on polystyrene surfaces. Coll. Interfaces B: Biointerfaces
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240
.

Danksagung
241
Ich danke Herrn Prof. Dr. Reginald Birngruber für die Ermöglichung dieser Arbeit
als auch für seine Unterstützung und den großzügigen Freiraum bei der
Durchführung der Arbeit.
Mein besonderer Dank gilt Herrn Dr. Gereon Hüttmann, der mir als Betreuer
stets mit Rat und Tat zur Seite stand. Sein großer Erfahrungsschatz und die
stete Möglichkeit einer offenen Diskussion und sein kritisches Hinterfragen waren
häufig Triebkraft für neue Ideen und Fragen, unter denen die Details der Arbeit
beleuchtet wurden.
Besonderer Dank gebührt Herrn Prof. Dr. Johannes Gerdes, der immer ein offenes
Ohr für Diskussionen hatte und mit seinem biologischen Fachwissen den Horizont
der Arbeit wesentlich erweitert hat.
Allen übrigen Mitarbeitern der Arbeitsgruppe Mikroeffekte, insbesondere Jesper
Serbin, Maik Frede, Björn Lange und vor allem auch Herrn Dr. Elmar Endl
möchte ich für die Unterstützung und die gute Zusammenarbeit und nicht zuletzt
für die gute Stimmung, die das Projekt über die gesamte Zeit getragen hat,
danken.
Ein weiterer Dank gebührt Herrn Dr. Michael Hoppert, der mich in die Geheimnisse
der Enzym-Goldkonjugation eingewiesen hat und ohne dessen wertvolle
Ratschläge und die Elektronenmikroskopie vieles im Dunkeln geblieben wäre.
Allen Mitarbeitern und Kooperateuren des Medizinischen Laserzentrums Lübeck
danke ich für ihre Unterstützung sowie für die angenehme und produktive Arbeitsatmosphäre.
Die Arbeit wurde finanziert durch ein Stipendium des Landes Schleswig-Holstein
und Projektgelder der DFG (Förderkennziffer Bi:321/3-1und Bi:321/3-2). Der
Besuch internationaler Konferenzen wurde mir durch Gelder der Fazit-Stiftung
ermöglicht.
Meinen Eltern und Christiane Scheffer danke ich für ihre Unterstützung in jeglicher
Hinsicht, durch die sie letztlich auch diese Arbeit mit getragen haben.

Benno Radt
Geboren 20.05.1973 in Istanbul
Familienstand ledig
Nationalität Deutsch
Doktorarbeit
Lebenslauf
1999-2002 Wissenschaftlicher Angestellter im Rahmen des DFG Forschungsprojekts
„Selektive Mikroeffekte“ am Medizinischen Laserzentrum Lübeck
1998-1999 Vorversuche und Beantragung des Projekts „Selektive Mikroeffekte“
unter der Leitung von Dr. G. Hüttmann im Rahmen des
„Promotionsstipendiums zur Förderung des wissenschaftlichen und
künstlerischen Nachwuchses“ des Landes Schleswig Holstein
1998 Arbeit an der Veröffentlichung der Ergebnisse der Diplomarbeit in
Verbindung mit weiteren Experimenten am Medizinischen Laserzentrum
Lübeck
Diplomarbeit
1997 Experimentelle Untersuchungen zur Biomechanik und zur thermischen
Denaturierung von Kornea am Medizinischen Laserzentrum Lübeck (unter
der Betreuung von Prof. Dr. R. Birngruber und Prof. Dr. G. Huber)
Physikstudium
1993- 1998 Physikstudium an der Universität Hamburg
Schwerpunkte in: Bio-, Festkörper- und Laserphysik
1991- 1993 Physikgrundstudium an der Technischen Hochschule Darmstadt
Tätigkeiten während des Studiums
1995- 1996 Tutor für Physik I an der Technischen Universität Hamburg Harburg
1995 Praktikum am Institut für Biophysik und Strahlenbiologie am
Universitätskrankenhaus Eppendorf, Hamburg
1992-1993 Hilfsassistent am Institut für Lichttechnik; TH Darmstadt
Schulausbildung
1985- 1991 Deutsches Gymnasium in Istanbul mit dem
Abschluss der Allgemeinen Hochschulreife
Lübeck den 19.11.2002