A) Spatel-Verfahren mit Kanamycin Äsculin Azid Agar ...

MILA 4 / 12 Nachweis von Entero- und Staphylokokken Dr. Nagl
METHODEN ZUM NACHWEIS VON ENTEROKOKKEN
Nachweis von Streptokokken der Gruppe D nach Lancefield (Fäkalstreptokokken) in Lebensmitteln,
Trink- und Brauchwasser mit
KANAMYCIN - ÄSCULIN - AZID - MEDIEN
Das KANAMYCIN-ÄSCULIN-AZID-ANREICHERUNGSMEDIUM dient zur selektiven Anreicherung
von Streptokokken der Gruppe D nach Lancefield aus kontaminiertem Untersuchungsmaterial
(Lebensmittel, Wasser usw.). Das Wachstum von "Fäkalstreptokokken" äußerst sich im Medium durch
eine schwarze Verfärbung des Nährbodens infolge Hydrolyse von Äsculin. Bei diesem Vorgang bilden
sich aus dem Glukosid Äsculin, Glukose und Äsculetin; letztgenannte phenolartige Verbindung gibt mit
Eisen(III)Ionen einen olivgrün-schwarz gefärbten Komplex. Kanamycin und Azid hemmen die
Begleitflora weitgehend.
A) Spatel-Verfahren mit Kanamycin Äsculin Azid Agar: Methodenbuch VI M 7.8.2
(1993)
Anwendung: Milch, Milchprodukte und Wasser
Vorwiegend bei Proben mit geringer Begleitflora; sehr spezifisch bei Einhaltung aller Parameter;
Von den Verdünnungen wird jeweils 0,1 ml auf die Oberfläche des Agarnährbodens pipettiert und mit
einem sterilen Drigalski-Spatel gleichmäßig verteilt.
Bebrütung: 16 - 24 Stunden bei 37° C
Das Ergebnis ist positiv für Streptokokken der Gruppe D nach Lancefield, wenn die dunkelgrünenschwarzen
Kolonien von einem schwarzen Hof umgeben sind; Kolonien von heller Farbe werden
nicht gezählt.
Die Bestätigung der Enterokokken erfolgt mit Katalase (Enterokokken sind Katalase negativ). Die
gewachsenen Kolonien sollten unmittelbar nach der Bebrütung ausgezählt werden, da der Nährboden
völlig schwarz werden kann und andere MO wie, z.B. Sc, Mc und Lb könnten eine erhöhte KZ
ergeben.
B) Selektivagar nach SLANETZ und BARTLEY (DIN 38 411)
Selektivnährböden zur Keimzahlbestimmung von Enterokokken in Wasser, Schmutzwasser, Milch,
Milchprodukten und anderem Untersuchungsmaterial. Durch den Gehalt an Natriumazid wird die
gesamte gramnegative Begleitflora gehemmt.
Der Nährboden ist als Fertignährboden erhältlich. Die Herstellung des Nährbodens muß genau nach
Vorschrift der Erzeugerfirma erfolgen. Nach Abkühlen des Nährbodens werden Platten gegossen und
diese vor der Beimpfung 2 - 4 Std. bei 30 bis 37° C oder 24 Stunden bei Zimmertemperatur
vorgetrocknet.
Jeweils 0,1 ml der Verdünnung wird auf die Nährbodenoberfläche geimpft und mit einer Drigalski-
Spatel gleichmäßig verteilt.
Bebrütung und Auswertung der Platten:
Die Platten werden 48 Stunden bei 37° C bebrütet. Enterokokken erscheinen als rosa bis
dunkelbraun gefärbte Kolonien mit einem Durchmesser von 0,5 bis 3 mm. Die Anzahl der
Enterokokken wird unter Anwendung des jeweiligen Verdünnungsfaktors pro Gramm/Milliliter
berechnet und angegeben.
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METHODEN ZUM NACHWEIS VON KOAGULASE-POSITIVEN STAPHYLOKOKKEN
Die Gattungen Micrococcus und Staphylococcus gehören zur Familie der Micrococcaceae. Ogston
fand 1881 in humanem Abszeßeiter traubenähnliche Bakterienkluster und benannte sie aufgrund
dieser Form „Staphylokokken“. Rosenbach konnte diese Bakterien 3 Jahre später kultivieren und gab
ihnen, aufgrund der goldgelben Pigmentierung, den Beinamen „aureus“. Seit Rosenbach waren
postoperative Wundinfektionen mit Staphylokokken gefürchtet und galten bis zur Einführung von
Penicillin, in den späten 1940ern, als nicht therapierbar. Durch die Bildung von beta-Lactamase,
waren bereits 1950 mehr als 80 % der hospitalen Staphylococcus aureus-Infektionen
penicillinresistent. Die in den 1960ern eingeführten halbsynthetischen Penicilline lösten dieses
Problem nur kurzfristig, da sich umgehend methycillinresistente Staphylococcus aureus-Stämme
(MRSA) bildeten.
Die Mikrokokken und Staphylokokken sind weit verbreitet und stammen überwiegend von Euter, Haut
und Nasenschleim. In Milch und Milchprodukte gelangen sie entweder über Kontamination durch
ungenügend gereinigte und desinfizierte Gerätschaften und Luft oder unmittelbar durch Mensch und
Tier.
Staphylokokken sind grampositive, unbewegliche, kugelige Bakterien mit einem Durchmesser von 0,5
bis 1,5 μm. Sie kommen einzeln, paarweise und in Tetraden vor. Staphylokokken teilen sich
charakteristischerweise in mehr als einer Ebene, sodass unregelmäßige Haufen entstehen.
Mikrokokken können die Kurzzeiterhitzung im Gegensatz zu Staphylokokken überstehen. Typische
Stopffwechselerscheinungen von Mikrokokken in neutralen Milchprodukten sind Bitterstoffe und
Süßgerinnung/Flockenbildung. Verantwortlich für die relativ häufigen Lebensmittelvergiftungen sind
entertoxinbildende Staphylococcus aureus-Stämme. Die Enterotoxine können 2 – 6 h nach der
Aufnahme Erbrechen, Durchfall und Kreislaufstörungen hervorrufen.
Die Pathogenität von Staphylococcus aureus ergibt sich aus der Summe der einwirkenden Enzyme
und dem Zusammenwirken von der Anwesenheit der Mikroorganismen mit der Empfänglichkeit des
Wirtes. Folgende Enzyme könne von Staphylococcus aureus gebildet werden:
Koagulase Haftung im Gewebe
Leukocidin Schutz gegen Abwehrreaktion
Hyaluronidase Durchdringung von Zellwänden
Toxine lokale Gewebsnekrosen
Hämolysine Auflösung von Erythrozyten
Enterotoxine Lebensmittelvergiftung (thermostabil)
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A) Selektivanreicherung mit Giolitti-Cantoni-Bouillon
MPN-Technik (IMV-Standard 60C:1997)
1. Anlegen einer Vedünnungsreihe mit Ringerlösung (9 ml)
Probe
2. Überimpfen in Giolitti-Cantoni-Bouillon (ev. 20min bei 100° C erhitzen um Sauerstoff aus Bouillon zu
entfernen)
1 ml
3. Zugabe von 0,1 ml einer 1%igen K-Tellurit-Lösung
V 0
1 ml
V 0
4. Überschichten mit 2 ml Wasseragar
5. Bebrütung für 24 – 48 h bei 37 ° C
1 ml
1 ml 1 ml
V 1 V 2 V 3
1 ml 1 ml 1 ml
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1 ml
1 ml
V 1 V 2 V 3

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6. Isolierung mit einer Öse auf Baird Parker Agar mittels fraktioniertem Ausstrich,
nur Röhrchen mit schwarzem Niederschlag werden zur Isolierung herangezogen
V0 V1 V2 V3
7. Bebrütung für 24 – 48 h bei 37 ° C
typische Kolonien: schwarz glänzend mit schmalen grau-weißem Rand, umgeben von einer
klaren Zone im trüben Agar
8. Überimpfen mit einer Öse in Hirn-Herz-Bouillon (5ml)
9. Bebrütung für 24 h bei 37 ° C
10. Bestätigung
V 0
Agglutinationstest
Koagulase-Test
zuvor Katalasetest, dann überimpfen
V 1 V 2 V 3
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B) Direktansatz auf Platten
Spatelverfahren (IMV-Standard 138: 1986)
1. Jeweils 1 ml der Ausgangssuspension auf 2 Petrischalen (∅ 140 mm) mit Baird-Parker-Agar
ausspateln
2. Bebrütung für 24 – 48 h bei 37 ° C
3. Auszählung aller Kolonien, die Staphylokokken sein könnten
4. Überimpfung von 5 Kolonien/Platte in Hirn-Herz Bouillon
5. Bebrütung für 24 h bei 37 ° C
6. Bestätigung
Agglutinationstest
Koagulase-Test
Probe
1 ml
V 0
Katalasetest
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1 ml

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C) Koloniezählung mit RPF-Medium
Plattengussverfahren (IMV-Standard 145A:1997)
1. Anlegen einer Vedünnungsreihe mit Ringerlösung
Probe
1 ml
2. Überimpfen in leere sterile Petrischalen
3. Vermischung mit Baird Parker RPF-Agar
V 0
4. Bebrütung für 24-(48) h bei 37 ° C
1 ml 1 ml
V 1 V 2 V 3
1 ml 1 ml 1 ml
1 ml 1 ml 1 ml
5. Auszählung aller Kolonien, die Staphylokokken sein könnten
grau-schwarze Kolonien, umgeben von einem opaken Hof
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1 ml
V 0 V 1 V 2 V 3

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Bestätigungsreaktionen:
Koagulasetest
Koagulase ist ein Enzym mit der Fähigkeit, Plasma zu koagulieren. Staphylococcus aureus bildet freie
und gebundene Koagulase, die im Röhrchentest nachgewiesen werden kann.
Von jeder Kultur in Hirn-Herz-Bouillon gibt man 0,1 ml unter aseptischen Bedingungen zu 0,5 ml
Kaninchen-Plasma (wenn der Hersteller keine andere Menge vorschreibt) in sterilen
Koagulaseröhrchen und bebrütet diese bei 35 – 37 ° C. Die Prüfung auf die Gerinnung des Plasmas
erfolgt nach 4 – 6 Std. Der Koagulase-Test gilt als positiv, wenn die Kulturen mindestens 3+ positive
Koagulase-Reaktionen liefern.
negativ keine Anzeichen von Fibrinbildung
1+ positiv kleine, unzusammenhängende Gerinnsel
2+ positiv kleine, kompakte Gerinnsel
3+ positiv große, kompakte Gerinnsel
4+ positiv Gesamtinhalt des Röhrchens koaguliert und verrutscht auch nicht beim
Umdrehen des Röhrchens.
Zur Kontrolle gibt man 0,1 ml sterile Hirn-Herz-Bouillon zu der empfohlenen Menge Kaninchen-Plasma
und bebrütet ohne Beimpfung. Das Kontroll-Plasma darf keine Anzeichen von Gerinnung zeigen,
sonst ist der Test ungültig.
Latex-Agglutination
Staphylokokken können mit Agglutinationstests (z.B. Bactident®Staph, Avipath-Staph, Staphytect®)
weiter differenziert werden. Der Latex-Agglutinationstest dient zur Differenzierung zwischen
Staphylokokken, die gebundene Koagulase (Clumping-Faktor) und/oder Protein A bilden und solchen,
die diese Eigenschaften nicht aufweisen. Protein A ist in der Lage, den Fc-Anteil des Immunglobulins
G (IgG) zu binden. Der Bactident®Staph besteht aus roten Latex-Partikeln, die mit Rinderfibrinogen
und IgG beschichtet sind. Wenn Staphylokokken-Kolonien, die die Fähigkeit zur Bildung
zellwandgebundener Koagulase und/oder Protein A an der Zelloberfläche haben, mit dem Latex-
Reagenz gemischt werden, kommt es infolge der Vernetzung zu einer deutlich sichtbaren
Agglutination der Latex-Partikel.
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