A) Spatel-Verfahren mit Kanamycin Äsculin Azid Agar ...
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MILA 4 / 12 Nachweis von Entero- und Staphylokokken Dr. Nagl<br />
METHODEN ZUM NACHWEIS VON ENTEROKOKKEN<br />
Nachweis von Streptokokken der Gruppe D nach Lancefield (Fäkalstreptokokken) in Lebens<strong>mit</strong>teln,<br />
Trink- und Brauchwasser <strong>mit</strong><br />
KANAMYCIN - ÄSCULIN - AZID - MEDIEN<br />
Das KANAMYCIN-ÄSCULIN-AZID-ANREICHERUNGSMEDIUM dient zur selektiven Anreicherung<br />
von Streptokokken der Gruppe D nach Lancefield aus kontaminiertem Untersuchungsmaterial<br />
(Lebens<strong>mit</strong>tel, Wasser usw.). Das Wachstum von "Fäkalstreptokokken" äußerst sich im Medium durch<br />
eine schwarze Verfärbung des Nährbodens infolge Hydrolyse von <strong>Äsculin</strong>. Bei diesem Vorgang bilden<br />
sich aus dem Glukosid <strong>Äsculin</strong>, Glukose und Äsculetin; letztgenannte phenolartige Verbindung gibt <strong>mit</strong><br />
Eisen(III)Ionen einen olivgrün-schwarz gefärbten Komplex. <strong>Kanamycin</strong> und <strong>Azid</strong> hemmen die<br />
Begleitflora weitgehend.<br />
A) <strong>Spatel</strong>-<strong>Verfahren</strong> <strong>mit</strong> <strong>Kanamycin</strong> <strong>Äsculin</strong> <strong>Azid</strong> <strong>Agar</strong>: Methodenbuch VI M 7.8.2<br />
(1993)<br />
Anwendung: Milch, Milchprodukte und Wasser<br />
Vorwiegend bei Proben <strong>mit</strong> geringer Begleitflora; sehr spezifisch bei Einhaltung aller Parameter;<br />
Von den Verdünnungen wird jeweils 0,1 ml auf die Oberfläche des <strong>Agar</strong>nährbodens pipettiert und <strong>mit</strong><br />
einem sterilen Drigalski-<strong>Spatel</strong> gleichmäßig verteilt.<br />
Bebrütung: 16 - 24 Stunden bei 37° C<br />
Das Ergebnis ist positiv für Streptokokken der Gruppe D nach Lancefield, wenn die dunkelgrünenschwarzen<br />
Kolonien von einem schwarzen Hof umgeben sind; Kolonien von heller Farbe werden<br />
nicht gezählt.<br />
Die Bestätigung der Enterokokken erfolgt <strong>mit</strong> Katalase (Enterokokken sind Katalase negativ). Die<br />
gewachsenen Kolonien sollten un<strong>mit</strong>telbar nach der Bebrütung ausgezählt werden, da der Nährboden<br />
völlig schwarz werden kann und andere MO wie, z.B. Sc, Mc und Lb könnten eine erhöhte KZ<br />
ergeben.<br />
B) Selektivagar nach SLANETZ und BARTLEY (DIN 38 411)<br />
Selektivnährböden zur Keimzahlbestimmung von Enterokokken in Wasser, Schmutzwasser, Milch,<br />
Milchprodukten und anderem Untersuchungsmaterial. Durch den Gehalt an Natriumazid wird die<br />
gesamte gramnegative Begleitflora gehemmt.<br />
Der Nährboden ist als Fertignährboden erhältlich. Die Herstellung des Nährbodens muß genau nach<br />
Vorschrift der Erzeugerfirma erfolgen. Nach Abkühlen des Nährbodens werden Platten gegossen und<br />
diese vor der Beimpfung 2 - 4 Std. bei 30 bis 37° C oder 24 Stunden bei Zimmertemperatur<br />
vorgetrocknet.<br />
Jeweils 0,1 ml der Verdünnung wird auf die Nährbodenoberfläche geimpft und <strong>mit</strong> einer Drigalski-<br />
<strong>Spatel</strong> gleichmäßig verteilt.<br />
Bebrütung und Auswertung der Platten:<br />
Die Platten werden 48 Stunden bei 37° C bebrütet. Enterokokken erscheinen als rosa bis<br />
dunkelbraun gefärbte Kolonien <strong>mit</strong> einem Durchmesser von 0,5 bis 3 mm. Die Anzahl der<br />
Enterokokken wird unter Anwendung des jeweiligen Verdünnungsfaktors pro Gramm/Milliliter<br />
berechnet und angegeben.<br />
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MILA 4 / 12 Nachweis von Entero- und Staphylokokken Dr. Nagl<br />
METHODEN ZUM NACHWEIS VON KOAGULASE-POSITIVEN STAPHYLOKOKKEN<br />
Die Gattungen Micrococcus und Staphylococcus gehören zur Familie der Micrococcaceae. Ogston<br />
fand 1881 in humanem Abszeßeiter traubenähnliche Bakterienkluster und benannte sie aufgrund<br />
dieser Form „Staphylokokken“. Rosenbach konnte diese Bakterien 3 Jahre später kultivieren und gab<br />
ihnen, aufgrund der goldgelben Pigmentierung, den Beinamen „aureus“. Seit Rosenbach waren<br />
postoperative Wundinfektionen <strong>mit</strong> Staphylokokken gefürchtet und galten bis zur Einführung von<br />
Penicillin, in den späten 1940ern, als nicht therapierbar. Durch die Bildung von beta-Lactamase,<br />
waren bereits 1950 mehr als 80 % der hospitalen Staphylococcus aureus-Infektionen<br />
penicillinresistent. Die in den 1960ern eingeführten halbsynthetischen Penicilline lösten dieses<br />
Problem nur kurzfristig, da sich umgehend methycillinresistente Staphylococcus aureus-Stämme<br />
(MRSA) bildeten.<br />
Die Mikrokokken und Staphylokokken sind weit verbreitet und stammen überwiegend von Euter, Haut<br />
und Nasenschleim. In Milch und Milchprodukte gelangen sie entweder über Kontamination durch<br />
ungenügend gereinigte und desinfizierte Gerätschaften und Luft oder un<strong>mit</strong>telbar durch Mensch und<br />
Tier.<br />
Staphylokokken sind grampositive, unbewegliche, kugelige Bakterien <strong>mit</strong> einem Durchmesser von 0,5<br />
bis 1,5 μm. Sie kommen einzeln, paarweise und in Tetraden vor. Staphylokokken teilen sich<br />
charakteristischerweise in mehr als einer Ebene, sodass unregelmäßige Haufen entstehen.<br />
Mikrokokken können die Kurzzeiterhitzung im Gegensatz zu Staphylokokken überstehen. Typische<br />
Stopffwechselerscheinungen von Mikrokokken in neutralen Milchprodukten sind Bitterstoffe und<br />
Süßgerinnung/Flockenbildung. Verantwortlich für die relativ häufigen Lebens<strong>mit</strong>telvergiftungen sind<br />
entertoxinbildende Staphylococcus aureus-Stämme. Die Enterotoxine können 2 – 6 h nach der<br />
Aufnahme Erbrechen, Durchfall und Kreislaufstörungen hervorrufen.<br />
Die Pathogenität von Staphylococcus aureus ergibt sich aus der Summe der einwirkenden Enzyme<br />
und dem Zusammenwirken von der Anwesenheit der Mikroorganismen <strong>mit</strong> der Empfänglichkeit des<br />
Wirtes. Folgende Enzyme könne von Staphylococcus aureus gebildet werden:<br />
Koagulase Haftung im Gewebe<br />
Leukocidin Schutz gegen Abwehrreaktion<br />
Hyaluronidase Durchdringung von Zellwänden<br />
Toxine lokale Gewebsnekrosen<br />
Hämolysine Auflösung von Erythrozyten<br />
Enterotoxine Lebens<strong>mit</strong>telvergiftung (thermostabil)<br />
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MILA 4 / 12 Nachweis von Entero- und Staphylokokken Dr. Nagl<br />
A) Selektivanreicherung <strong>mit</strong> Giolitti-Cantoni-Bouillon<br />
MPN-Technik (IMV-Standard 60C:1997)<br />
1. Anlegen einer Vedünnungsreihe <strong>mit</strong> Ringerlösung (9 ml)<br />
Probe<br />
2. Überimpfen in Giolitti-Cantoni-Bouillon (ev. 20min bei 100° C erhitzen um Sauerstoff aus Bouillon zu<br />
entfernen)<br />
1 ml<br />
3. Zugabe von 0,1 ml einer 1%igen K-Tellurit-Lösung<br />
V 0<br />
1 ml<br />
V 0<br />
4. Überschichten <strong>mit</strong> 2 ml Wasseragar<br />
5. Bebrütung für 24 – 48 h bei 37 ° C<br />
1 ml<br />
1 ml 1 ml<br />
V 1 V 2 V 3<br />
1 ml 1 ml 1 ml<br />
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1 ml<br />
1 ml<br />
V 1 V 2 V 3
MILA 4 / 12 Nachweis von Entero- und Staphylokokken Dr. Nagl<br />
6. Isolierung <strong>mit</strong> einer Öse auf Baird Parker <strong>Agar</strong> <strong>mit</strong>tels fraktioniertem Ausstrich,<br />
nur Röhrchen <strong>mit</strong> schwarzem Niederschlag werden zur Isolierung herangezogen<br />
V0 V1 V2 V3<br />
7. Bebrütung für 24 – 48 h bei 37 ° C<br />
typische Kolonien: schwarz glänzend <strong>mit</strong> schmalen grau-weißem Rand, umgeben von einer<br />
klaren Zone im trüben <strong>Agar</strong><br />
8. Überimpfen <strong>mit</strong> einer Öse in Hirn-Herz-Bouillon (5ml)<br />
9. Bebrütung für 24 h bei 37 ° C<br />
10. Bestätigung<br />
V 0<br />
Agglutinationstest<br />
Koagulase-Test<br />
zuvor Katalasetest, dann überimpfen<br />
V 1 V 2 V 3<br />
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MILA 4 / 12 Nachweis von Entero- und Staphylokokken Dr. Nagl<br />
B) Direktansatz auf Platten<br />
<strong>Spatel</strong>verfahren (IMV-Standard 138: 1986)<br />
1. Jeweils 1 ml der Ausgangssuspension auf 2 Petrischalen (∅ 140 mm) <strong>mit</strong> Baird-Parker-<strong>Agar</strong><br />
ausspateln<br />
2. Bebrütung für 24 – 48 h bei 37 ° C<br />
3. Auszählung aller Kolonien, die Staphylokokken sein könnten<br />
4. Überimpfung von 5 Kolonien/Platte in Hirn-Herz Bouillon<br />
5. Bebrütung für 24 h bei 37 ° C<br />
6. Bestätigung<br />
Agglutinationstest<br />
Koagulase-Test<br />
Probe<br />
1 ml<br />
V 0<br />
Katalasetest<br />
12 Entero- und Staphylokokken © by gnagl SEITE 5 VON 7<br />
1 ml
MILA 4 / 12 Nachweis von Entero- und Staphylokokken Dr. Nagl<br />
C) Koloniezählung <strong>mit</strong> RPF-Medium<br />
Plattengussverfahren (IMV-Standard 145A:1997)<br />
1. Anlegen einer Vedünnungsreihe <strong>mit</strong> Ringerlösung<br />
Probe<br />
1 ml<br />
2. Überimpfen in leere sterile Petrischalen<br />
3. Vermischung <strong>mit</strong> Baird Parker RPF-<strong>Agar</strong><br />
V 0<br />
4. Bebrütung für 24-(48) h bei 37 ° C<br />
1 ml 1 ml<br />
V 1 V 2 V 3<br />
1 ml 1 ml 1 ml<br />
1 ml 1 ml 1 ml<br />
5. Auszählung aller Kolonien, die Staphylokokken sein könnten<br />
grau-schwarze Kolonien, umgeben von einem opaken Hof<br />
12 Entero- und Staphylokokken © by gnagl SEITE 6 VON 7<br />
1 ml<br />
V 0 V 1 V 2 V 3
MILA 4 / 12 Nachweis von Entero- und Staphylokokken Dr. Nagl<br />
Bestätigungsreaktionen:<br />
Koagulasetest<br />
Koagulase ist ein Enzym <strong>mit</strong> der Fähigkeit, Plasma zu koagulieren. Staphylococcus aureus bildet freie<br />
und gebundene Koagulase, die im Röhrchentest nachgewiesen werden kann.<br />
Von jeder Kultur in Hirn-Herz-Bouillon gibt man 0,1 ml unter aseptischen Bedingungen zu 0,5 ml<br />
Kaninchen-Plasma (wenn der Hersteller keine andere Menge vorschreibt) in sterilen<br />
Koagulaseröhrchen und bebrütet diese bei 35 – 37 ° C. Die Prüfung auf die Gerinnung des Plasmas<br />
erfolgt nach 4 – 6 Std. Der Koagulase-Test gilt als positiv, wenn die Kulturen mindestens 3+ positive<br />
Koagulase-Reaktionen liefern.<br />
negativ keine Anzeichen von Fibrinbildung<br />
1+ positiv kleine, unzusammenhängende Gerinnsel<br />
2+ positiv kleine, kompakte Gerinnsel<br />
3+ positiv große, kompakte Gerinnsel<br />
4+ positiv Gesamtinhalt des Röhrchens koaguliert und verrutscht auch nicht beim<br />
Umdrehen des Röhrchens.<br />
Zur Kontrolle gibt man 0,1 ml sterile Hirn-Herz-Bouillon zu der empfohlenen Menge Kaninchen-Plasma<br />
und bebrütet ohne Beimpfung. Das Kontroll-Plasma darf keine Anzeichen von Gerinnung zeigen,<br />
sonst ist der Test ungültig.<br />
Latex-Agglutination<br />
Staphylokokken können <strong>mit</strong> Agglutinationstests (z.B. Bactident®Staph, Avipath-Staph, Staphytect®)<br />
weiter differenziert werden. Der Latex-Agglutinationstest dient zur Differenzierung zwischen<br />
Staphylokokken, die gebundene Koagulase (Clumping-Faktor) und/oder Protein A bilden und solchen,<br />
die diese Eigenschaften nicht aufweisen. Protein A ist in der Lage, den Fc-Anteil des Immunglobulins<br />
G (IgG) zu binden. Der Bactident®Staph besteht aus roten Latex-Partikeln, die <strong>mit</strong> Rinderfibrinogen<br />
und IgG beschichtet sind. Wenn Staphylokokken-Kolonien, die die Fähigkeit zur Bildung<br />
zellwandgebundener Koagulase und/oder Protein A an der Zelloberfläche haben, <strong>mit</strong> dem Latex-<br />
Reagenz gemischt werden, kommt es infolge der Vernetzung zu einer deutlich sichtbaren<br />
Agglutination der Latex-Partikel.<br />
12 Entero- und Staphylokokken © by gnagl SEITE 7 VON 7