Teil 2 Reaktivität von Aminosäuren, Nachweismethoden

Teil 2 Reaktivität von
Aminosäuren, Nachweismethoden

Reaktionen der Carboxygruppe
AS sind einer säurekatalysierten Veresterung leicht zugänglich; mit
EtOH und HCl führt sie zu den Ethylesterchloriden
Die freien Ester sind aus den Salzen durch Einwirkung von Basen
erhältlich und im Vakuum unzersetzt destillierbar. Auf der
fraktionierten Destillation beruht die erste Methode zur Trennung von
AS (Emil Fischer)

Bildung zyklischer Dipeptide
Freie AS-Ester neigen zur Bildung von zyklischen
Dipeptiden bzw. offenkettigen Polypeptide

Reaktionen der Aminogruppe
-Acylierung-
Als Acylierungsmittel kommen aktivierte
Säurederivate in Frage, z.B. Säurehalogenide oder
Säureanhydride.
N-Acetylaminosäuren
als Bestandteile chemisch definierter Diäten
zur Supplementierung von pflanzlichen Proteinen zur
Erhöhung der biologischen Wertigkeit
Zusatz freier AS zu LM die erhitzt werden nicht
unproblematisch
Methionin + reduzierende Zucker über Streckerreaktion
Methional (Fehlaroma)
Lysin und Threonin Verlust biologischer Wertigkeit
Asparagin : Precursor für Acrylamidbildung

Reaktionen der Aminogruppe
-Acylierung-
Analytisch von großer Bedeutung ist die Acylierung (Dansylierung) mit
5-Dimethylamino-naphthalensulfonsäurechlorid (Dansylchlorid)
Stabil gegen Säurehydrolyse
Ermittlung von N-terminalen AS und von freien ε-Aminogruppen in Peptiden und
Proteine
Auch Dimethylaminoazobenzsulfonchlorid (DABS-Cl) und 9-
Fluorenmethylchlorformiat (FMOC) führen zu empfindlich nachweisbaren AS-
Derivaten, die für säulenchromatographische Trennung und Bestimmung
geeignet sind

Vorkommen von Trimethylaminosäuren (Betaine)
(CH 3) 3N + -CHR-COO−
β-Alanin Homobetain Fleischextrakt
γ-Amino-buttersäure Actinin Muscheln
Glycin Betain Zuckerrübe
Histidin Herzynin Champignons
β-Hydroxy- γ-amino-
buttersäure Carnitin Muskelfleisch,
Hefe, Weizenkeime,
Fisch, Leber, Molke,
Muscheln
4-Hydroxyprolin Betonicin Jackbohne
Prolin Stachydrin Orangenblätter,
Alfalfa, Luzerne

O 2 N
Reaktionen der Aminogruppe
-Alkylierung & Arylierung-
2,4-Dinitrophenylderivate (DNP-AS) werden durch
Arylierung der Aminofunktion mit
1-Fluor-2,4-dinitrobenzol (DNFB) erzeugt
(Sanger-Reagenz)
DNP-AS sind gelbe, gut kristallisierbare säurestabile Verbindungen
Die Reaktion ist wichtig für die Markierung von N-terminalen AS-
Resten und freien -AS-Seitenketten in Peptiden und Proteinen
NO 2
F
NO 2
-
OH
+ H2N R
O2N N R + F + H2
O
H

Reaktionen der Aminogruppe
-Alkylierung & Arylierung-
Ebenfalls analytisch von Bedeutung ist die Reaktion
mit Trinitrobenzolsulfonsäure, die zu gelben
Derivaten führt
photometrische Bestimmung von AS und Proteinen
O 2 N
NO 2
NO 2
SO 3
-
+
N
H 2
R
pH 9.5
25°C
O 2 N
NO 2
NO 2
N
H
R

Reaktionen der Aminogruppe
-Alkylierung & Arylierung-
Der Meisenheimer Komplex ist ein
Additionsprodukt
Zwischenprodukt bei nucleophilen
aromatischen Substitutionen unter
milden Bedingungen:
am Benzolring auftretende negative
Ladung wird durch
elektronenanziehende Substituenten
stabilisiert

Nachweis des Komplexes
Isolierung des
Additionsproduktes bei
der Reaktion von
2,4,6-Trinitroanisol mit
Kaliumethylat

Reaktionen der Aminogruppe
-Alkylierung & Arylierung-
Analog verläuft die Reaktion mit 1,2-Naphtochinon-4sulfonsäure
(Folin-Reagenz), bei der ein roter Farbstoff
entsteht
Es handelt sich um eine
nukleophile aromatische
Substitution, die über ein
Additionsprodukt
(Meisenheimer-
Komplex) verläuft

Reaktionen der Aminogruppe
-Thiocarbamoylierung-
AS reagieren mit Isocyanaten zu Carbamoylderivaten
diese zyklisieren beim Erhitzen im Sauren zu 2,4-Dioxoimidazolidinen
(Hydantoinen)
Durch Reaktion von Aminogruppen mit Phenylisothiocyanat ist ein
stufenweiser Abbau von Peptiden (Edman-Abbau) möglich
für Sequenzanalyse von großer Bedeutung

Reaktion mit Phenylisothiocyanat
(Edmanabbau)
Anilinothiazolinon Phenylthiocarbamoylaminosäure

Reaktionen der Aminogruppe
-Edman-Abbau-
Beim Edman-Abbau addiert sich die endständige Aminogruppe an das
Reagenz, wobei ein Thioharnstoffderivat entsteht.
Beim Behandeln mit einer schwachen Säure unter Bedingungen, unter denen
die Peptidbindungen nicht hydrolysiert werden, spaltet das Molekül die markierte
Aminosäure als Phenylthiohydantoin ab, der Rest des Polypeptids bleibt
unverändert :

Automatisierter Edmanabbau
meist automatisiert an Proteinen oder Peptiden
vollzogen, die über die C-terminale Carboxylgruppe
an einen Aminogruppen-haltigen Träger gebunden
sind
Identifizierung
durch HPLC
oder TLC
PHT-AS
Umwandlung
PITC
PITC
PITC
N-Terminus C-Terminus
H2N-a1-a2-a3- - -an-COOH Polypeptid
Kupplung
-HN-a 1-a 2-a 3- - -a n-COOH
H
a 1
Thiazolinon
Spaltung
PTC-Peptid
H 2N-a 2-a 3- - -a n-COOH
Wdh.

Reaktionen mit Carbonylverbindungen
Strecker-Abbau Reaktion
mit Dicarbonyl-Verbindungen
aus Maillard-Reaktion (siehe
Kohlenhydrate)
Aus Dicarbonyl-Verbindungen
entstehen zahlreiche
Folgeprodukte, z.B. Alkyl- u.
Methoxypyrazine als
Aromastoffe und braune
Melanoidine

Reaktionen mit Carbonylverbindungen
-Ninhydrinreaktion-
Ein Spezialfall des Strecker-Abbaus ist die Ninhydrinreaktion, die für
quantitative photometrische Bestimmung (Ruhmanns Violett) von AS von
großer Bedeutung ist.
Die Nachweisgrenze liegt bei ~ 500 pmol.

Formolzahl nach Sörensen
Bestimmung freier AS durch Titration mit 0,1 N NaOH bei pH
8,1, wobei die Basizität der Aminogruppe durch Formaldehyd
zurückgedrängt wird
Erfasst werden:
Aminogruppen, NH 3, prim. Amine (vollständig), sek. Aminogruppen
und phenolische Hydroxygruppen (teilweise).
Nicht erfasst werden:
tert. Amine, Thiol-Gruppen und aliphatische Hydroxygruppen.
Kennzahl zur Charakterisierung mancher Fruchtsäfte

Derivatisierung mit o-Phthaldialdehyd
(OPA)
HPLC-Trennung der Isoindolderivate und Fluoreszenzdetektion:
ex= 330 nm; em= 455 nm
Nachweisgrenze: 1 pmol

Aminosäure-Analytik
Klassisch werden AS mittels Ionenaustauschchromatographie getrennt
und durch Farbreaktion (Ninhydrin oder Phthalaldehyd) nachgewiesen.
Zunehmend findet heute die HPLC Anwendung, wobei die AS zuvor mit
OPA in Gegenwart einer Thiolverbindung zu fluoreszieren den
Derivaten umgesetzt werden. Beide Methoden erlauben keine
Differenzierung zwischen D- und L-AS, die jedoch nach geeigneter
Derivatisierung mit GC oder HPLC möglich ist
Ninhydrin-Reaktion
Formolzahl nach Sörensen
Gasvolumetrisch nach Sylke
Umsetzung mit 1-Fluor-2,4-dinitrobenzol zu N-2,4-Dinitrophenyl-AS
Derivatisierung mit O-Phthalaldehyd
Entstehung von Hydrazinen beim Abbau von Proteinen nach Akabori
Bildung von Dansylderivaten
Reaktion mit Folin-Reagenz
Reaktion mit Trinitrobenzosulfonsäure

Peptid/Protein-Analytik
Hydrolyse (0,1n – 1n HCl)
Enzymatische Hydrolyse
Edman-Abbau
Arylierung mit Sanger-Reagenz
Western-Blot

Biologische Wertigkeit
Biologische Wertigkeit limitiert durch:
Lysin: Defizit in Getreide- und anderen Pflanzenproteine
Methionin: Defizit in Kuhmilch- und Fleischproteine
Threonin: Defizit bei Weizen und Roggen
Tryptophan: Defizit bei Casein, Mais und Roggen
Beispiele
Rice-Fortification (Japan, Thailand und Tunesien) Zusatz von L-
Lysin und L-Threonin
Supplementierung von Soja und Erdnuß mit Methionin in Japan
Bestandteile chemisch definierter Diäten (CDD) z.B. bei
Astronautenkost + Therapie von Maldigestions- und
Malabsorptionssyndromen.

Synthese von Aminosäuren
Chemisch synthetisierte AS und Derivate werden
eingesetzt:
Futtermittelindustrie (Zusatz zwischen 0,05 und 0,2%)
Nahrungsmittelindustrie (L-Glutaminsäure als
Geschmacksverstärker aber auch Methionin und Lysin)
Therapeutika im pharmazeutischen Bereich
Chemischen Industrie (Tenside, Polymere)
Die Produktion von AS lässt sich in 4 Bereiche einteilen
Chemische Synthese Problem: Enantiomerenbildung
Extraktion nat. AS aus Proteinhydrolysaten Problem: zahlreiche
NP durch Säure und Alkalibehandlung z.B. Bildung von
Dihydroalanin oder Enantiomeren
AS-Produktion durch Fermentation (mikrobiologisch
Mononatrium-L-glutamat)
Biotechnologie

Glutamat
Einsatz als „Geschmacksverstärker“
Im Zusammenhang mit Glutamat beschrieben werden:
MSG (Mono Sodium Glutamate)-Symptomkomplex besser bekannt
als „Chinarestaurant-Syndrom“
Übergewicht
Neurodegenerative Erkrankungen (Morbus Alzheimer; Morbus
Parkinson)
Toxikologische Bewertung von Glutamat als Zusatzstoff
John Olney (1960)
Studien zur möglichen Schädigung des Gehirns durch Glutamat
Subcutane Injektion (neugeborene Mäuse) Glutamatdosen von 0,5
g/kg bis 4 g/kg Körpergewicht Schädigungen des Gehirns der
Nagetiere
Durch die orale Gabe ähnlich hoher Glutamatdosen mit der Nahrung
wurde jedoch keine Schädigung des Gehirns der Mäuse erreicht

Sicherheitsbewertung von Glutamat
JECFA (Joint FAO/WHO Expert Committee on Food Additives) (1987)
LD 50 (Maus, Ratte) = 15 -18 g/kg KG
Nicht teratogen oder reproduktionstoxisch
aus technologisch und geschmacklich eingesetzten Mengen an
Glutamat im Lebensmittel resultiert keine Gefährdung für die Gesundheit
Kein ADI festgelegt
SCF (1991)
Kein ADI festgelegt
FASEB (Federation of American Societies for Experimental Biology) im
Auftrag von FDA (1995)
Studien zum MSG-Symptomkomplex keinen wissenschaftlichen
Beweis für nachteilige Effekte auf die meisten Menschen, die hohen
MNG ausgesetzt wurden
Aufnahme von Glutamat aus Lebensmitteln führt nicht zu
neurodegenerativen Erkrankungen

Biotechnologische Synthese von Aminosäuren
-EMS-Syndrom-
Tryptophan – Anwendung als Schlafmittel
Rolle in der Regulation des Wach-Schlaf-Rhythmus
in USA ohne Rezept als Nahrungsergänzungsmittel und Sportlernahrung
1989 in der USA mehreren hundert Menschen nach Einnahme eines
Tryptophan- Präparates an EMS (Eosinophilie-Myalgie-Syndrom)
erkrankt
Eosinophilie, Sklerodermie, schwere Muskelschmerzen
weltweit über 1500 Fälle, 38 Todesfälle
Im Dezember 1988 führte Showa Denko einen neuen Stamm von B.
amyloliquefaciens (Stamm V) in den Produktionsprozess ein.
Gleichzeitig vereinfachte das Unternehmen das Reinigungsverfahren
zur Gewinnung von L-Tryptophan (Vorstufe Serotonin) aus den
Fermentationslösungen

Synthese von Aminosäuren
-EMS-Syndrom-
Ein Filtrationsschritt wurde zeitweise umgangen.
Die Menge eingesetzter Aktivkohle, die zur Entfernung
unerwünschter Nebenprodukte diente, wurde auf weniger als die
Hälfte der zuvor verwendeten Menge reduziert
Ein Stoff, der in Verdacht steht, EMS auszulösen, ist das so
genannte EBT (Ethylenbistryptophan), ein Reaktionsprodukt aus
Tryptophan und Acetaldehyd, einem Nebenprodukt der
Fermentation.
Für die Reaktion sind tiefe Temperaturen
erforderlich. Die verkürzte Tryptophan-
aufreinigung wurde mittels Kationen-
austauscher, welche im Freien standen
(Winter) durchgeführt
EBT

Bucherer-Methode (Methionin)
Aldehyde lassen sich mit Blausäure und
Ammoniumcarbonat in stabile kristallisierbare
Hydantoin-Derivate überführen
mit Alkali unter Druck und höherer Temperatur zu α-
Aminosäuren hydrolysierbar
Industriell modifizierte Strecker-Methode
Herstellung von Methionin aus Acrolein.
+ +
-Methylthioethylhydantoin

Peptide
-Allgemeines & Nomenklatur-
Peptide entstehen durch Verknüpfung von AS über Säureamidbindungen.
Hydrolyse von Peptiden führt zurück zu den AS.
Je nach Anzahl der AS-Reste unterscheidet man Di-, Tri-, und
Tetrapeptide und fasst diese bis ca. 10 Resten als Oligopeptide
zusammen
Höhere Peptide werden als Polypeptide bezeichnet, wobei der
Übergang zu den Proteinen fließend ist (Grenze MG = 10.000 Da, ca.
100 AS).
Peptide werden als acylierte AS aufgefasst (Alanyl-seryl-glycin = Ala-
Ser-Gly oder ASG). D-AS werden durch vorgesetztes D gekennzeichnet
Bindungen an denen funktionelle Gruppen der Seitenketten beteiligt
sind, werden durch senkrechte Bindestriche wiedergegeben
Glu
Cys Gly
Beispiel Tripeptid: Glutathion (γ-Glutamyl-cysteinyl-glycin)

Peptide
-physikalische & sensorische Eigenschaften-
Gegenüber den entsprechenden AS ist die Acidität der freien
Carboxylgruppe und die Basizität der freien Aminogruppe bei den
Peptiden geringer. Die Sequenz hat darauf Einfluss.
Während bei den AS eine Abhängigkeit der Geschmacksqualität von
der Konfiguration vorhanden ist Peptiden unabhängig
Die Intensität des Geschmacks hängt wie von der Hydrophobizität der
Seitenketten ab.
Bittergeschmack bei Käse als Folge von Fehlreifung.
Deswegen auch kein Einsatz proteolytischer Enzyme zur Modifizierung von
Nahrungsproteinen.
L-Aspartyl-L-phenylalaninmethylester (Aspartam) ist süß, wie einige
andere Dipeptidester der L-Aminomalonsäure. Bei ihnen haben die
Carboxylgruppe, Aminogruppe und die Seitenkette R die Anordnung für
den süßen Geschmack.

Einzelne Peptide
-Glutathion-
Es ist in tierischen Organismen, in Pflanzen und
Mikroorganismen weit verbreitet
Bindung der Glutaminsäure über die γ-Carboxylgruppe

Einzelne Peptide
-Glutathion & Lebensmitteltechnologie-
Bedeutende Getreideenzyme: Peroxidasen, Katalasen &
Glutathion-Dehydrogenasen
Durch Glutathion-Dehydrogenase wird die Oxidation von
Glutathion (mit Dehydroascorbinsäure als H-Akzeptor)
katalysiert
In Verbindung mit Ascorbinsäure Verbesserung
rheologischer Eigenschaften von Weizenteig:
Abbau von Disulfidbrücken, der zu Depolymerisation von
Kleberproteinen führt, wird gebremst
2 GSH
GSSG
Dehydroascorbinsäure
Glutathion-
Dehydrogenase
Ascorbinsäure
H 2 O
½ O 2

Einzelne Peptide
-Glutathion & biolog. Eigenschaften-
Glutathion spielt eine Schlüsselrolle bei der Entgiftung (Phase II
Reaktion)
Abfangen reaktiver Sauerstoffspezies (ROS)
Glutathiongehalt von Säugerzellen ~ 5 mM
Schützt die Zellen vor oxidativer Schädigung Sulfhydryl Puffer
Wirkung
Zyklus zwischen reduzierter Thiolform (GSH) und oxidierter Form
(GSSG)
GSSG wird reduziert durch Glutathion Reduktase:
Flavoprotein, welchem NADPH als Elektronenquelle dient
Die Umsetzung von GSH GSSG ist um ein 500 faches größer
2 GSH + RO-OH GSSG + H 2 O + ROH

Einzelne Peptide
-Glutathion-Peroxidase-
Glutathion-Peroxidase katalysiert folgende Reaktion
2 GSH + RO-OH GSSG + H 2 O + ROH
Enzym besitzt ein Selenocystein-Rest im
aktiven Zentrum
Die Selenolat-Form (E-Se - ) reduziert das
Peroxid zum Alkohol und geht dabei selbst in
die selenische Säure über (E-SeOH)
Unter Oxidation eines Glutathion entsteht ein
Selenosulfid Addukt (E-Se-S-G)
Ein weiteres Molekül Glutathion regeneriert
dann die aktive Form des Enzyms, unter
Bildung von GSSG
GSSG
+ H +
GSSG
+ H +
E-Se- E-Se- E-Se- Selenolat
GSH
ROOH
+ H +
ROOH
+ H +
E-Se-S-G
Selensulfid
ROH
E-SeOH
Selenische Säure
H H2O 2O 2O
GSH

Einzelne Peptide
-Carnosin, Anserin, Balenin-
Dipeptide der β-Alanins mit L-Histidin (Carnosin) bzw. 1-Methyl-L-Histidin (Anserin)
oder 3-Methyl-L-Histidin (Balenin)
Vorkommen: Muskeln von Wirbeltieren
Charakterisierung der Herkunft von Fleischextrakten:
Carnosin Rindermuskel
Anserin Hühnerfleisch
Balenin Walfleisch
Physiologische Rolle noch nicht völlig klar, Bedeutung haben:
Pufferung im pH-Bereich 6-8
Carnosin Anserin
Beteiligung an Wiederherstellung der Erregbarkeit und Kontraktionsfähigkeit
des ermüdeten Skelettmuskels
für Carnosin: Wirkung als Neurotransmitter des Geruchsnervs

Einzelne Peptide
-Nisin-
Wird von einigen Stämmen des Lactobacillus lactis gebildet
Enthält Dehydroalanin, Dehydro-β-methylalanin, Lanthionin
und β-Methyllanthionin über 5 Thioetherbrücken
In einigen Ländern als Zusatzstoff zugelassen:
E-Nummer: 234
Klasse: Konservierungsmittel
Verwendung zur Konservierung von:
Grieß- und Tapiokapudding und ähnlichen Erzeugnissen (max. 3
mg/kg)
Gereiftem Käse, Schmelzkäse (max. 12,5 mg/kg)
Clotted cream (max. 10 mg/kg)
Infolge der EU-Harmonisierung gehört Nisin zu den
zugelassenen Konservierungsstoffen

Einzelne Peptide
-Nisin-
Wirkung:
Tötet gram-positive Bakterien (Bacillus, Clostridium, Listeria): Der
Angriff erfolgt durch Porenbildung in der Cytoplasmamembran
unmittelbar nach dem Auskeimen der Sporen
Gram-negative Bakterien (Escherichia coli, Salmonella,
Campylobacter, Yersinia) werden nicht abgetötet.
Sicherheit:
keine schädlichen Wirkungen für Menschen bekannt
wird im menschlichen Verdauungstrakt schnell abgebaut
Kommt natürlicherweise in Milch und Käse vor, auch in der
humanen Darmflora kann Nisin durch Streptokokken gebildet
werden
ADI-Wert: 0-13 mg/kg

Aspartam (Dipeptid,Süßstoff)
relative Süßkraft 100-200
Einzelne Peptide
-Aspartam-
durch Kochen, lange Lagerung und Metabolisierung wird Phenylalanin
freigesetzt
O
O
bedenklich für Phenylketonuriekranke
verliert an Süßkraft durch
hydrolytische Spaltung
zum Kochen ungeeignet
C
H 2
H
C
O
+
NH 3
O OMe
N
H
CH
CH 2
Aspartam
(L-Aspartylphenylalaninmethylester)

-
OOC
NH 3
Phenylalanin
H
- OOC
H
O O
COO
-
Abbauweg für Phenylalanin
Tetrahydrobiopterin Dihydrobiopterin
O
O 2
H 2
Phenylalanin-Hydroxylase
COO
-
4- Fumarylacetoacetat
O
H 2
H
H COO
-
+ +
+
Fumarylacetoacetase
C
H 3
O
Fumarat Acetoacetat
Maleylacetoacetat-
Isomerase
COO
-
H
H
HO
COO -
O O
Tyrosin
NH 3
alpha-Ketoglutarat Glutamat
COO
-
COO
-
4 - Maleylacetoacetat
Aminotransferase
HO
p-Hydroxyphenylpyruvat-
Dioxygenase
O 2
Homogentisat-Dioxygenase
O
COO
-
p-Hydroxyphenylpyruvat
OH
OH
Homogentisat
Ascorbat + O 2
Dihydroascorbat +
O
H 2
+
COO -
Phenylketonurie
angeborene Intoleranzreaktion durch Defizit an
Phenylalaninhydroxylase
Tyrosin ↓
Phenylalanin im Blut ↑
Brenztraubensäure im Harn ↑
schwere geistige Schäden
CO 2

körpereigene psychoaktive
Peptide (Endorphine,
Enkephaline, Dynorphine)
In Gluten und Casein (Weizenund
Milchprodukte)
Abbauprodukte bei Käsereifung
Rufen Effekte hervor, die denen
des Morphins ähneln und durch
bekannte Morphin-Antagonisten
reversibel sind
Beeinflussen über spezifische
Rezeptoren (Opioidrezeptoren)
die Schmerzleitung und -
verarbeitung
Lange Eliminationszeiten,
physische Abhängigkeit
Opioide Peptide

Opioide Proteine
- -Casomorphine-
kurzkettige Peptide aus β-Casein der Kuhmilch
zeigen opiatartige Wirkung
wirken bei Kleinkindern reduzierend auf die
Darmbewegung
β-Casomorphine-7
Heptapeptide
alternierende Prolinreste in der Sequenz bedingen hohe Resistenz
gegenüber Proteasen (im Gegensatz zu eigenen Endorphinen)
entstehen im Gastrointestinaltrakt beim Abbau des Caseins und
werden dort vom Enzymsystem kaum angegriffen
Modifizierung von Casomorphinen
Einbau von D- statt L-AS kann zum Aktivitätsanstieg führen