Untersuchungen zum Vorkommen und zur gesundheitlichen ...

2.5.1.2 Vorbereitung der Materialproben und Teststämme
Zur Herstellung der Rohextrakte wurden 2 g homogenisiertes Probenmaterial mit 40
ml Methanol über Nacht eingeweicht, am nächsten Tag zusätzlich mit je 40 ml
Chloroform und Methanol auf dem Schüttler extrahiert und filtriert. Zur Filtrierung
wurden Faltenfilter verwendet (Bezeichnung MN 615 ¼, für normale Laborarbeiten,
mittelschnell filtrierend, Durchmesser 185 mm).
Die ausgewählten Actinomyceten-Teststämme wurden von der Umweltmykolgie auf
CASO-Agar mit Cycloheximid beimpft und an Prof. Gareis geschickt. Als erstes
wurden diese auf CASO-Agar ohne Cycloheximid angezüchtet, um das Wachstum
möglichst zu fördern. Die Stämme wurden hierzu großflächig und gleichmäßig auf
den Kulturplatten ausgestrichen und 3 Wochen bei 25 °C bebrütet. Danach wurde
unter Einsatz des gesamten bewachsenen Agars mit Chloroform (2 x 25 ml)
extrahiert und die Extrakte mit Faltenfilter MN 615 ¼ gefiltert.
Nach dem Einengen am Rotationsverdampfer wurden die Rückstände in
entsprechende Probengefäße überführt, bei Bedarf aliquotiert, mit Stickstoff
eingeengt und in 1 ml Zellkulturmedium (MEM) mit 1,7% Ethanol und 0,3% DMSO
unter Schütteln auf einem Probenschüttler und Ultraschallbehandlung gelöst.
Die Probenverdünnungen (Verdünnungsschritte 1:2) wurden ebenfalls in diesem
Zellkulturmedium hergestellt.
2.5.1.3 Zellkultur
Verwendet wurde die adhärent wachsende, aneuploide SK-Zelllinie (Swine Kidney)
mit epitheloider Morphologie, die aus der Zellkultursammlung des Institutes für
Medizinische Mikrobiologie, Infektions- und Seuchenmedizin der Tierärztlichen
Fakultät der Ludwig-Maximilians-Universität München stammt. Die Anzucht,
Kultivierung und Einsaat der Zellen in 96-Lochmikrotiterplatten erfolgte nach
standardisierten Zellkulturverfahren (Friedrich, 1991; Hanelt et al., 1995).
2.5.1.4 Durchführung des MTT-Zytotoxizitätstests
Als höchste getestete Probenmenge wurde die Konzentration bzw.
Verdünnungsstufe verwendet, bei der eine zytotoxische Wirkung des
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