Untersuchungen zum Vorkommen und zur gesundheitlichen ...
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37° C inkubiert. Am nächsten Tag wurden die mit den Klonen bewachsenen Platten<br />
nach kurzer Lagerung bei Raumtemperatur bis <strong>zum</strong> deutlichen Eintreten der<br />
Blaufärbung für zwei St<strong>und</strong>en bei 4° C gelagert.<br />
Anschließend konnten aufgr<strong>und</strong> der Blau-Weiß-Selektion die weißen Kolonien<br />
gepickt (nur erfolgreich ligierte Zellen erscheinen auf den X-Gal –Platten weiß) <strong>und</strong><br />
auf eine Masterplatte 4 übertragen werden. Hierzu wurde ein autoklavierter<br />
Zahnstocher verwendet, mit dem vorsichtig eine weiße Kolonie gepickt <strong>und</strong> dann<br />
fünfmal auf das vormarkierte Feld einer Masterplatte überführt wurde. Insgesamt<br />
wurden für jede Materialprobe 100 Kolonien gepickt.<br />
Zur Kontrolle der Ligation wurde pro Probe zunächst von 10 unterschiedlichen Klon-<br />
Kolonien Zellmaterial in PCR–Reaktionsgefäße überführt. Die anschließende PCR<br />
direkt aus dem Zellmaterial wurde mit M13-Primern durchgeführt. Diese Kontrolle<br />
wurde später auch für alle Klon-Kolonien durchgeführt, die kein positives Produkt mit<br />
Actinomyceten spezifischen Primern (siehe Abschnitt 2.4.2.1) zeigten.<br />
Die 16S rRNA-Gen-Inserts der jeweils 100 gepickten Klone wurden auf ihre<br />
Zugehörigkeit <strong>zur</strong> Klasse der Actinobacteria mit zwei, für Actinomyceten spezifischen<br />
Primersystemen (Com2xf / Ac1886r <strong>und</strong> S-C-Act-235-a-S-20/ S-C-Act-878-a-A-19,<br />
Stach et al. 2003) überprüft.<br />
Die Klon-Kolonien, die ein positives PCR-Produkt mit mindestens einem der beiden<br />
Primersysteme zeigten, wurden <strong>zur</strong> weiteren Bearbeitung in Glycerin eingefroren.<br />
2.4.4.2 Konservierung der Klon-Kolonien<br />
Zur längeren Aufbewahrung der Zellen wurde eine Stammsammlung angelegt.<br />
Hierzu wurden 700 µl einer Übernachtkultur einer Klon-Kolonie zu 300 µl einer<br />
sterilen 99 %igen Glycerinlösung (Riedel de Haën ® , Seelze) in ein 2 ml<br />
Reaktionsgefäß pipettiert, gemischt <strong>und</strong> bei – 80 °C gelagert.<br />
4 Masterplatten werden <strong>zur</strong> längeren Aufbewahrung der Klone angefertigt. Hierzu werden die Platten<br />
in kleine Kästchen/Bereiche unterteilt, wobei jeweils ein Klon auf einem dieser Kästchen mehrfach<br />
(3-5) aufgetragen wurde.<br />
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