Untersuchungen zum Vorkommen und zur gesundheitlichen ...

Glasplatten gespritzt, dass keine Luftblasen entstanden. Anschließend wurde ein
„Vorkamm“ („Haifischkamm umgedreht“) am oberen Rand zwischen die beiden
Platten geschoben und zwei Klemmen zum Fixieren angebracht. Während des
Auspolymerisierens des Gels wurden die Glasplatten horizontal bei Raumtemperatur
für mindestens 2 h gelagert.
Bevor die Proben auf das Gel aufgetragen werden konnten, wurde der „Vorkamm“
gegen einen Haifischkamm ausgetauscht und das Gel in eine
Elektrophoresekammer (Protean ® IIxi Cell, Biorad, München), mit integrierter
Kühlapparatur (Cooling Modul, Biorad) eingebaut. Die Elektrophoresekammer wurde
an ein Netzgerät (2297 Macrodrive 5, Constant Power Supply, LKB Bromma,
Schweden) angeschlossen. Der obere und untere Elektrophoresetank wurde mit
1xTBE-Laufpuffer befüllt. Anschließend wurden die Haifischkammtaschen mit
1xTBE-Laufpuffer gespült, um Luftblasen und eventuelle Gelreste zu entfernen 1 .
Jetzt erfolgte der Probenauftrag. Hierfür wurden 6 µl der jeweiligen Probe und 2-2,5
µl des Standardgemisches in die Geltaschen pipettiert. Die Einstellungen der
physikalischen Parameter der Elektrophorese sind in Tab. 8 dargestellt.
Tab. 8: Parameter und Zeit der elektrophoretischen Bedingungen in Abhängigkeit
von den zu trennenden PCR-Produkten
Parameter Actinomyceten-Primer
Geltemperatur 19,5 °C / 14,0 °C
Zeit (h) 12-14
elektrische Leistung (Watt) 50
elektrische Spannung (Volt) 450
elektrische Stromstärke
(Milliampere)
8
Zur Kontrolle des mittels λ-Exonuclease erfolgten Verdaues wurde je eine Probe
verdaut und unverdaut auf das Polyacrylamidgel aufgetragen.
Zur Visualisierung der einzelsträngigen DNA-Banden im Gel wurde eine
Silbernitratfärbung durchgeführt. Der Vorteil dieser Methode liegt in ihrer Sensitivität
(bis zu 0,03 ng/mm 2 sind möglich) und in der Möglichkeit der dauerhaften
Dokumentation, da die Färbung nicht verschwindet (Mülhardt, 2002; Qu, 2005).
1 Ein Vorlauf von ca. zwanzig min mit SSCP-Ladepuffer beladenen Geltaschen war nötig, um die
Auftrennung in den einzelnen Taschen zu kontrollieren. Die Kühlung der Apparatur sollte bereits eine
halbe Stunde vor dem Lauf angestellt sein.
53