Untersuchungen zum Vorkommen und zur gesundheitlichen ...

Ziel der PCR innerhalb dieser Arbeit war einerseits die Amplifikation des gesamten
16S rRNA-Gens verschiedener Mikroorganismen und andererseits die
Vervielfältigung von 16S rRNA-Gen-Fragmenten von Actinomyceten unter
Verwendung spezifischer Primersysteme. In der Arbeit wurden verschiedene
Primersysteme angewendet, die hauptsächlich innerhalb des 16S rRNA-Gens binden
(Ausnahme: Primer 118r, bindet an die 23S und die Plasmidprimer M13). Für die
Klonierungsanalysen der Proben 2 und 3 wurde eine Nested-PCR unter Verwendung
der Primerpaare 616V/118 r und EUB9f/EUB 1492r durchgeführt.
2.4.2.1 Ansetzen der PCR
Zum Ansetzen des Mastermixes einer PCR wurde an einer Sicherheitswerkbank
gearbeitet. Hierfür wurden die verschiedenen Komponenten des Mastermixes nach
unten stehendem Pipettierschemata (Tab. 3) in ein steriles 1,5 ml Reaktionsgefäß
pipettiert.
Tab. 3: Zusammensetzung der Reaktionsansätze (Mastermix) für die verschiedenen
Primersysteme und deren Endkonzentration im Ansatz
16S rRNA-Gen- Actinomyceten- Actinomyceten-
Primer
Primer
Primer
(EUB9f/EUB 1492r) Com2xf / Ac1186 Stach et al. (2003)
Reagenz,
Konzentration
Volumen
(µl)
Endkonz.im Volu-
Reaktions- men
gefäß (µl)
Endkonz.im VoluReaktionsmengefäß
(µl)
Endkonz.im
Reaktionsgefäß
RNase, DNase
freies Wasser
16,7 16,4 16,35
10x Puffer 2,5 1x 2,5 1x 2,5 1x
25 mM MgCl2 2,0 2,0 mM 2,0 2 mM 2,5 2,5 mM
2 mM dNTP´s 2,5 0,2 mM 2,5 0,2 mM 2,5 0,2 mM
25 pmol µl -1
Primer 1, forward
0,5 0,1 mM 0,5 0,5 mM 0,5 0,5 mM
25 pmol µl -1
Primer 2, reverse
0,5 0,1 mM 0,5 0,5 mM 0,5 0,5 mM
20 mg ml -1 BSA 0,2 4 mg ml -1 0,2 2 mg ml -1
5 Unit µl -1
Taq-Polymerase
0,1 0,02 U µl -1 0,1 0,01 U µl -1 0,15 0,015 U µl -1
Reaktionsvolumen 25 µl 25 µl 25 µl
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