Untersuchungen zum Vorkommen und zur gesundheitlichen ...

Die DNA-Extraktion der gewonnenen Isolate aus den Proben 5-16 wurden in
Auftragsarbeit von der SMOLBIO (Services in Molecular Biology, Berlin)
durchgeführt.
2.4.1.2 DNA-Extraktion aus Materialproben
Um die genomische DNA aus Baumaterialienproben zu extrahieren, wurde ebenfalls
ein kommerziell erhältliches Extraktionskit (Bio 101, FastDNA ® SPIN Kit for soil, MP
Biomedicals) verwendet. Die Extraktion erfolgte nach Anleitung des Herstellers wie
nachfolgend beschrieben.
Die Lysing Matrix E enthaltenden Reaktionsgefäße wurden mit 0,05 bis 0,5 g
frischem Probenmaterial gefüllt und mit Natriumphosphatpuffer (978 µl) und MT-
Puffer (122 µl) versetzt. Die Mikroorganismen wurden aufgeschlossen, indem die mit
den Proben beladenen Reaktionsgefäße in einer Schwingkugelmühle bei maximaler
Geschwindigkeit eine Minute horizontal geschüttelt wurden. Anschließend wurde die
Probe bei 13.870 x g bei 4 °C zentrifugiert. Der DNA-enthaltende Überstand wurde in
einem neuen Reaktionsgefäß mit 250 µl PPS-Reagenz (Protein Precipitation Sol´n
for Soil) versetzt und vorsichtig invertiert. Nach wiederholtem Zentrifugieren bei
13.870 x g für 5 min (4 °C) wurde der Überstand in einem 15 ml Blaudeckelröhrchen
mit 1 ml Binding Matrix Suspension gemischt. Nach sorgfältiger Resuspendierung
wurde ein Teil des Gemischs auf einen Spin Filter, der die DNA bindet, übertragen
und wiederum 2 min bei 13.870 x g (4 °C) zentrifugiert. Dieser Schritt wurde
wiederholt, bis das vollständige Gemisch auf den Spin Filter gegeben wurde.
Anschließend wurde der Filter mit 500 µl „SEWS-M-Lösung“ (Salt/Ethanol Wash
Solution) gewaschen und zwei min abzentrifugiert. Für die Elution der DNA aus dem
Filter wurde der Spin Filter in ein neues Reaktionsgefäß gesetzt. Die DNA wurde nun
mit 50 µl DES (DNase- und pyrogenfreies Wasser) durch zweiminütiges
Zentrifugieren aus dem Filter gelöst.
Bei jeder DNA-Extraktion wurde eine Negativkontrolle parallel aufgearbeitet. Hierzu
wurde das Lysing Matrix E Reaktionsgefäß bzw. das Reaktionsgefäß mit
Zirkoniumkugeln nur mit den zu Beginn eingesetzten Puffern (ohne Probe) in der
Schwingkugelmühle geschüttelt. Im weiteren Verlauf wurde die Kontrolle gleich
behandelt wie die Proben.
43