Untersuchungen zum Vorkommen und zur gesundheitlichen ...
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2.3.6.3 Konservierung in Glycerinmedium (LGA)<br />
Glycerin 99 % wurde im Verhältnis 1:1 mit Aqua dest. gemischt, sterilisiert <strong>und</strong> in<br />
sterile Mikrogefäße abgefüllt. Ein bewachsenes Stück Agar wurde ausgeschnitten, in<br />
dem Konservierungsmedium suspendiert <strong>und</strong> bei –80 °C konserviert.<br />
2.3.7 Bestimmung der koloniebildenden Einheiten der Schimmelpilze<br />
Von den Baumaterialien wurde im Regelfall 1 g in 10 ml NaCl-Tween-Lösung in<br />
Erlenmeyer-Kolben suspendiert <strong>und</strong> 30 min auf einem Schüttelinkubator geschüttelt.<br />
Bei voluminöseren Proben (Glaswolle, Styropor) wurde entsprechend mehr Lösung<br />
eingesetzt. Aus dieser Suspension wurde eine dezimale Verdünnungsreihe<br />
hergestellt (bis 10 -2 ) <strong>und</strong> aus jeder Verdünnungsstufe 3 Parallelen ausplattiert<br />
(Anlehnung an VDI 4253 Bl. 1). Von jeder Materialprobe wurde ein Doppelansatz<br />
angesetzt <strong>und</strong> entsprechend ausgewertet.<br />
2.4 Molekularbiologische Methoden<br />
Sowohl für die taxonomische Zuordnung von Isolaten als auch für die<br />
kultivierungsunabhängige Erfassung von Actinomyceten in den Materialproben<br />
wurden molekularbiologische Methoden eingesetzt.<br />
2.4.1 DNA – Extraktion<br />
Die Extraktion der DNA aus den Isolaten (2.4.1.1), aus einem Gemisch gewachsener<br />
Kolonien von den Agarplatten (2.4.1.3) oder direkt aus den Materialproben (2.4.1.2)<br />
war der erste Schritt aller molekularbiologischen <strong>Untersuchungen</strong>.<br />
2.4.1.1 DNA-Extraktion aus Reinkulturen<br />
Um die genomische DNA aus den gewonnenen Isolaten zu extrahieren, wurde ein<br />
kommerziell erhältliches Extraktionskit (GenElute Plant Genomic DNA Kit, Sigma)<br />
verwendet. Die Extraktion wurde weitestgehend nach Anleitung des Herstellers, wie<br />
folgt beschrieben, durchgeführt. Die verwendeten Lösungen waren im Extraktionskit<br />
enthalten.<br />
Für einen verbesserten Zellaufschluss wurde die Extraktion zu Beginn durch den<br />
Einsatz von Zirkoniumkugeln <strong>und</strong> einem einminütigen Aufschluss mit einer<br />
Schwingkugelmühle (Retsch, Haan) modifiziert. Dazu wurde ein Gramm steriler<br />
Zirkoniumkugeln (0,1 mm, Carl Roth GmbH+Co, Karlsruhe) in 2 ml Reaktionsgefäße<br />
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