Untersuchungen zum Vorkommen und zur gesundheitlichen ...

Analysen im Zusammenhang mit der Identifizierung unbekannter Isolate gibt. Da
DAP nur in der Zellwand vorkommt, können die beiden Isomere mit Hilfe einer
Gesamtzellhydrolyse und nachfolgender Papier- bzw. Dünnschichtchromatographie
relativ rasch nachgewiesen werden. Kann die DAP in unbekannten
Actinomycetenisolaten nicht nachgewiesen werden, ist eine andere Diaminosäure,
häufig L-Lysin, seltener L-Ornithin oder L-Diaminobuttersäure für die Vernetzung des
Peptidoglycans verantwortlich. Der Nachweis dieser diagnostischen Diaminosäuren
ist mit der aufwändigen Präparation reiner Zellwände verbunden, da diese
Aminosäuren auch in den Peptiden im Zytoplasma vorkommen.
Der DAP-Nachweis basiert auf einer modifizierten Methode nach Hasegawa. et al.
(1983). Mit einem sterilen Skalpell wurden ca. 10 bis 20 mg Reinkultur des
subkultivierten Actinomyceten-Isolats von der Nährbodenplatte so abgenommen,
dass sich möglichst nur die Kultur selbst und kein Nährmedium ablöste. Die so
gewonnene Probe wurde in ein Reaktionsgefäß überführt und mit 1 ml HCl (30%ig)
versetzt. Das verschlossene Reaktionsgefäß wurde 3 h auf 120 °C erhitzt.
Nach Abkühlung des erhaltenen Hydrolysats wurde dieses in einen 10 ml-
Spitzkolben überführt. Mittels eines Vakuumrotationsverdampfers (ca. 40 mbar bei
70 °C) wurde die salzsaure wässrige Lösung bis zur Trockne eingeengt. Der
verbleibende Rückstand wurde in 1 ml Aqua dest. aufgenommen und anschließend
nochmals mit dem Vakuumrotationsverdampfer bis zur Trockne eingeengt, um noch
vorhandene HCl vollständig zu entfernen.
Das so gereinigte Hydrolysat wurde in 20 µl Aqua dest. aufgenommen. 1 µl, 2 µl und
5 µl des Hydrolysats wurden in einem Abstand von 1,5 cm untereinander und 1 cm
vom unteren Rand der Dünnschichtplatte entfernt (DC Cellulose-Platten 20 x 20 cm)
mit einer 10 µl Hamilton-Spritze aufgetragen. Während des Auftragens der Proben
wurde mittels eines Föhns kalte Luft über die DC-Platte geblasen, um das
Verdampfen des Wassers beim Auftragen der Proben zu beschleunigen. Die
aufgetragene Probe soll auf der DC-Platte keine größere Ausdehnung als 5 mm
besitzen. Zusätzlich zu den Proben wurden auf die DC-Platte die Referenzlösungen
von LL-DAP (gewonnen aus dem Typusstamm Streptomyces griseus IMET 40235 T ),
von meso-DAP (gewonnen aus aus dem Typusstamm Rhodococcus rhodochrous
IMET 7374 T ) und eines DAP-Gemisches (Firma Sigma D 1377, 2 mg/ml)
aufgetragen.
35