Untersuchungen zum Vorkommen und zur gesundheitlichen ...

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• 2. Workshop – Actinomyceten-Exposition und toxische Effekte • Koordinierung des Projektes und der Erstellung des Abschlußberichtes RWTH Universitätsklinikum Aachen, Institut für Hygiene und Umweltmedizin – Klinikum, Aachen Prof. Dr. Guido Fischer • Isolierung und Differenzierung der Schimmelpilze in den Materialproben aus den 15 Wohnungen mit Feuchteschäden (Probe: 1-15) • Orientierende Untersuchungen über den Zusammenhang von vorliegenden Actinomyceten-Belastungen und gesundheitlichen Beschwerden Umweltmykologie Dr. Dill und Dr. Trautmann, Berlin Dr. Christoph Trautmann Dr. Ingrid Dill • Festlegung der morphologischen Merkmale, die zur Identifizierung der Actinomyceten genutzt werden sollen • Definition der Typen von Actinomyceten im Innenraumbereich • Optimierung der Nährmedien für die Isolierung der Actinomyceten • Optimierung der Nährmedien für die Differenzierung der Actinomyceten • Erarbeitung einer Vorlage zum Aufbau einer Arbeitsdokumentation für die Actinomyceten • Vergleich der Ergebnisse der morphologischen und molekularbiologischen Differenzierung • Untersuchung von Materialproben aus Wohnungen mit Feuchteschäden auf Actinomyceten (Isolierung der Actinomyceten, morphologische Beschreibung und Bilddokumentation der Proben: 5-7, 9, 12 a und b sowie 14) • Koordinierung und Erstellung einer Bilddokumentation der isolierten Actinomyceten Während der Bearbeitungszeit wurden 14 Arbeitsgruppenbesprechungen durchgeführt. Die verantwortliche Leitung des Projektes lag bei Herrn Dr. Gabrio, Regierungspräsidium Stuttgart, Landesgesundheitsamt. 9
Seitens des Umweltbundesamtes wurde das Projekt von Frau Dr. Szewzyk wissenschaftlich begleitet. 1.2 Actinomyceten/Actinobacteria Actinobacteria gehören innerhalb der Domäne Eubacteria zur phylogenetischen Gruppe der Gram-positiven Prokaryonten mit einem hohen Guanin-Cytosin-Gehalt (> 55%) im Genom (Madigan, 2001; Goodfellow, 1989, Ensign, 1992). Die Klasse Actinobacteria wurde 1997 von Stackebrandt et al. vorgeschlagen, um der großen morphologischen Diversität der bis zu diesem Zeitpunkt auch als „Actinomyceten“ bezeichneten Bakteriengruppe Rechnung zu tragen. In diesem Bericht wird der Begriff „Actinomyceten“ auf alle Bakterien angewendet, die der taxonomischen Klasse Actinobacteria angehören. Actinomyceten sind heterotrophe, überwiegend aerobe Bakterien, die in ihren morphologischen, physiologischen und cytochemischen Eigenschaften stark variieren. Zur Klasse der Actinobacteria werden die fünf morphologisch und physiologisch sehr heterogenen Ordnungen Acidimicrobiales, Rubrobacterales, Coriobacterales, Bifidobacteriales und Actinomycetales gezählt. Die Ordnung der Actinomycetales setzt sich bereits aus mehr als 150 verschiedenen Gattungen, wie Streptomyces, Nocardia und Mycobacterium zusammen (um nur wenige ausgewählte Beispiele zu nennen), die zum Teil sehr unterschiedliche Ausprägungen koloniemorphologischer Merkmale aufweisen. Innerhalb der Klasse der Actinobacteria reicht die morphologische Diversität von Kokken bzw. kokkoiden Zellen bis hin zu komplexen mycelialen Strukturen. Viele Actinomyceten sind in der Lage, ein Substratmycel auszubilden, dessen verzweigte Hyphen während des Wachstums die Agaroberfläche erreichen können und feste, ledrig erscheinende Kolonien bilden (Ensign, 1992, Madigan, 2001; Albrecht und Kämpfer, 2000; Jäckel und Kämpfer, 2003). Aufgrund der Ausbildung eines fädig verzweigten Geflechts von Filamenten bzw. Pseudohyphen (Mycel, Pseudomycel, Ø 0,5-2,0 µm, undefinierter Länge) entstand die frühere Bezeichnung „Strahlenpilze“. Diese wird auch heute noch fälschlicherweise genutzt und führt damit zur Verwechslung von mycelbildenden Actinomyceten mit Schimmelpilzen. Bei einigen Arten erheben sich freie Mycelstränge aus den Oberflächenkolonien in den Luftraum (Luftmycel), wodurch ihr häufig charakteristisches pulvriges bzw. samtiges koloniemorphologisches Bild in Erscheinung tritt. Viele Actinomyceten vermehren 10
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Seite 5 und 6: 1. Report No. UBA-FB 001229 4. Repo
Seite 7 und 8: Umweltmykologie GbR Berlin) 2.3.6.2
Seite 9 und 10: 3.3.3.1 Vorversuche zur Freisetzung
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Seite 15 und 16: Mikroorganismen, wie z.B. Saccharop
Seite 17 und 18: Weiterhin wurde im Staub einer Kind
Seite 19 und 20: eines gemeinsamen Trainings wurde s
Seite 21 und 22: auswählt. In der Vorphase (bis zur
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Seite 25 und 26: Die Auswahl der Parameter entsprich
Seite 27 und 28: 2.2 Beschreibung der Probenahmestel
Seite 29 und 30: Es sollten auch mittels Datenlogger
Seite 31 und 32: Farbe ist zum einen für die Gewinn
Seite 33 und 34: 2.3.2 Nährmedien zur Kultivierung
Seite 35 und 36: 2.3.4 Festlegung der Dominanz einze
Seite 37 und 38: 2.3.5.3 Gram-Färbung Die Gram-Fär
Seite 39 und 40: Die DC-Platte wurde anschließend i
Seite 41 und 42: Für die Analyse der Fettsäuren er
Seite 43 und 44: 2.3.6 Konservierung Die Konservieru
Seite 45 und 46: eingewogen und etwas Zellmateriall
Seite 47 und 48: 2.4.1.3 DNA-Extraktion aus Kolonien
Seite 49 und 50: Plasmid-Primer M13 Primer 616 V / 1
Seite 51 und 52: Universelle 16S rRNA Primer (EUB-Pr
Seite 53 und 54: 2.4.2.2 Agarosegelelektrophorese Di
Seite 55 und 56: gemischt. Das Gemisch wurde zwei mi
Seite 57 und 58: Alle Schritte der Silbernitratfärb
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Der MTT-Zellkulturtest zeichnet sic
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Probenmaterials sicher ausgeschloss
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Untersuchungsobjekte isoliert worde
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3 Ergebnisse 3.1 Kultivierungsabhä
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Tab. 9: Koloniebildende Einheiten (
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Tab. 10: Gattungszuordung der gewon
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3.1.2.2 Übersicht über die häufi
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In den Proben wurden jeweils 4 bzw.
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in den 24 untersuchten Proben (die
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In der Abb. 3 sind die Anteile der
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[Σ Gattungen] 25 20 15 10 5 0 WP 0
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Weiterhin bildeten einige Referenzi
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ähnliches Spektrum unterschiedlich
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Abb. 6: Referenzisolate der Gattung
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auf Hafermehl-, Gauze- und CASO-Aga
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Abb. 8: Koloniemorphologie der Refe
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3.1.2.5.2 Micromonospora Aus der Ga
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Abb. 15: Koloniemorphologien von 14
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3.1.2.5.5 Nocardiopsis Die Mehrzahl
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Abb. 25: 21 Tage alte Referenzisola
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Abb. 28: Abb. 29: Kleine Kulturen v
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Abb. 31: Kolonien (von unten aufgen
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Abb. 33: Abbildung der Luftmyzelien
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3.1.2.5.8 Saccharopolyspora Die Meh
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Abb. 39: Abb. 40: Streptomycetes-Ko
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Eine sichere Bestimmung auf der Pri
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3.1.4 Chemotaxonomische Untersuchun
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Die Identifizierung eines dieser 4
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Tab18: Chemotaxonomische Merkmale d
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Tab. 19: Chemotaxonomische Merkmale
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Tab. 20: Chemotaxonomische Merkmale
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Saccharothrix, Propionibacterium, P
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3.2.2 SSCP (Singel Strand Conformat
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Korrelation mit Hilfe einer Cluster
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Tab. 22: Referenzkonzentrationen vo
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angenommen (das gesamte Wachstum au
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Freisetzung von TNF-α in Abhängig
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ml. Dies deutet an, dass die Interl
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dieser Probe wurden nicht untersuch
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Erhöhung der TNF-alpha Freisetzung
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4 Diskussion 4.1 Ergebnisse und Sch
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Anzüchtung einzelner Isolate auf v
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molekularbiologischen Methoden für
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Nocardioidaceae detektiert werden.
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4.3.1 Molekularbiologische Identifi
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In der vorliegenden Studie wurden n
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Eine weitere Gattung, deren Vertret
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Actinomycetales besitzen L-Lysin, L
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PII PIM, PI, (PG), PE, DPG PIII (PI
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Pseudonocardia Pseudonocardiaceae m
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durchgeführt. Auch wenn mit beiden
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4.5 Diskussion der toxikologischen
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Nocardiopsis. Dies zeigt, dass man
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4.5.3 Diskussion - Gesundheitliche
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4.6 Zusammenfassung Diversität: Di
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Allein anhand koloniemorphologische
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4.6 Summary Diversity The results o
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cell wall, these methods are time-c
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Verzeichnis der Abbildungen Abb. 1:
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Verzeichnis der Tabellen Tab. 1: De
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Ensign, J.C. (1992): Introduction t
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Kutzner, H. J, Kempf, A. (1996): Vo
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Rintala, H., Pitkäranta, M., Toivo
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Anhang: Probendatenblätter Probend
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Objektbeschreibung Probendatenblatt
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Seite 199 und 200:
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Objekt 05 (Bad) Ergebnisse Feuchtig
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Probe 09 02-07/02 1 Filter 09.03.06
Seite 209 und 210:
Ergebnisse Feuchtigkeits- und Tempe
Seite 211 und 212:
pH-Wert Probe Nr. Material elektron
Seite 213 und 214:
Probe 12 06-07/02 (je 80 g) LGA 18.
Seite 215 und 216:
Ergebnisse Feuchtigkeits- und Tempe
Seite 217 und 218:
Versand an Probe 14 08-07/01 22.08.
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Versand an Probe 15 08-07/01 22.08.
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Probenahme Nr. Material Datum/Bearb
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Mikroskopie Zellform Stäb.-Kokken-
Seite 225 und 226:
7 Agar 15,0 g 8 Aqua dest. 1000 ml
Seite 227 und 228:
Glucose-Yeast-Malt-Agar (GYM STREPT
Seite 229 und 230:
Tab. A 1: API-ZYM-Test Isolat Agar
Seite 231 und 232:
Agrococcus ca. 1200 bp 0.01 53 228
Seite 233 und 234:
Arthrobacter, ca. 1260 bp, outgroup
Seite 235 und 236:
Brevibacterium ca. 1330 bp 0.01 84
Seite 237 und 238:
Corynebacterium Teil des phylogenet
Seite 239 und 240:
Janibacter ca. 1400 bp outgroup Orn
Seite 241 und 242:
Kocuria, ca. 1330 bp, outgroup Arth
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Kytococcus, ca. 1340 bp outgroup Br
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Leucobacter ca. 1360 bp 0.005 64 93
Seite 247 und 248:
Micrococcus, ca. 1350 bp, outgroup
Seite 249 und 250:
Micromonospora, ca. 1320 bp, outgro
Seite 251 und 252:
Nocardia, ca. 1280 bp, outgroup Mic
Seite 253 und 254:
Nocardiopsis, ca1300 bp, outgroup A
Seite 255 und 256:
Ornithinimicrobium /Arsenicicoccus,
Seite 257 und 258:
Promicomonospora, 1230 bp (14 Isola
Seite 259 und 260:
Rhodococcus, ca. 1230 bp, outgroup
Seite 261 und 262:
Tsukamurella, ca. 1400 bp, outgroup
Seite 263 und 264:
Nährmedium Dominanzklasse Putzprob
Seite 265 und 266:
Nährmedium Dominanz Styroporprobe
Seite 267 und 268:
Nährmedium Dominanzklasse Lehmputz
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Stammnummer KBE/g bzw. m 3 DAP Iden
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