Biochemie und Biotechnologie in der Schule: Hubertus ... - ChidS

3 Biotechnologie
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Das Enzym wurde als erstes (I) aus Escherichia coli (Eco) aus dem
Bakterienstamm R isoliert.
3.2.3 Klonierung von DNA-Fragmenten in ein Plasmid
Die Klonierung von „Fremd-DNA“ mittels eines Plasmids enthält fünf
aufeinander folgende Arbeitsschritte.
Erster Schritt:
Die Plasmid-DNA des Vektors wird mit einem geeigneten Restriktionsenzym,
möglichst an nur einer Stelle geschnitten. Als Produkt erhält man ein
linearisiertes DNA-Molekül. Damit man ein geeignetes Restriktionsenzym
findet, kann man die „Plasmid-Karte“ zur Hilfe nehmen. Auf dieser Karte sind
alle möglichen Schnittstellen von verschiedenen Restriktionsenzymen
aufgelistet, so dass man ein geeignetes Enzym heraussuchen kann.
Zweiter Schritt:
Das zu klonierende DNA-Fragment wird mit denselben Enzymen bzw. mit
demselben Enzym geschnitten, so dass das DNA-Fragment und die Plasmid-
DNA die gleichen, und somit kompatiblen, Nucleotidenden besitzen.
Dritter Schritt:
Dieser Arbeitsschritt wird auch Ligation genannt. Beide DNA-Moleküle,
„Fremd-DNA“ und Plasmid-DNA, werden miteinander verbunden. Die
Reaktion wird von dem Enzym Ligase katalysiert, welches das 5´-Ende des
einen Moleküls mit dem 3´-Ende des anderen durch Ausbildung einer
Phosphatesterbindung verknüpft.
Vierter Schritt:
Der vierte Arbeitsschritt wird als Transformation bezeichnet. Hierbei wird der
modernisierte Plasmid-Vektor in eine kompetente Zelle eingebracht.
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