Analytik von Aminosäuren und biogenen Aminen in fermentierten ...

3 OPTIMIERUNG DER HPLC- UND GC-METHODEN 66
3.5 GC-Methode
3.5.1 Eigenschaften der Trennphase und Derivatisierung für die
Analyse mittels GC/MS
Die von FRANK et al. [55] entwickelte Trennphase Chirasil-Val besteht aus einem
Polysiloxangrundgerüst, an das über einen Spacer optisch reines Valin-tert.-
butylamid als chiraler Selektor in der L- oder D-Konfiguration gebunden ist, so daß
sich zwei verschiedene Trennsäulen mit entgegengesetzter Selektivität ergeben
(Chirasil-L- bzw. D-Val). Die Chirasil-Val-Phasen ermöglichen die Trennung der mei-
sten proteinogenen Aminosäuren und ihrer D-Enantiomeren in Form ihrer N(O,S)-
Perfluoracyl-Aminosäure-alkylester, wobei die D-AS-Derivate zuerst eluieren [173-
176]. Hierbei sind die AS His, Trp, Cys und Arg unter den Standard-
Derivatisierungsbedingungen auf Quarz Kapillaren nicht bestimmbar. Die Aminosäu-
ren sind nur mit besonderem Aufwand, wie speziellen Derivatisierungen und desak-
tivierten Glaskapillaren bestimmbar. Cystein wird teilweise oxidiert, wodurch eine
reproduzierbare GC-Analyse erschwert wird. Die Aminosäuren Asn und Gln werden
bei den durchgeführten Derivatisierungsbedingungen aus der Säureamidform in die
jeweilige Säure überführt, so daß die gefundenen Mengen an Asp und Glu der
Summe aus Asp und Asn bzw. Glu und Gln entsprechen.
3.5.1.1 Veresterung der Carboxylgruppe
Im ersten Schritt der Derivatisierung wurden die AS mit 2-Propanol verestert. Hierzu
wurde die Probe (oder Standard) zunächst unter Stickstoffstrom bis zur Trockene
eingeengt. Nach Zugabe von 500 μl Veresterungsreagenz (AcCl : 2-Propanol = 1:4)
und 10 μl BHT-Lösung als Antioxidationsmittel wurde die Probe für eine Stunde bei
100 ° C im Heizblock im geschlossenen “Reacti-Vial“ erhitzt. Das Veresterungssche-
ma ist in Abbildung 3-10 dargestellt.