Analytik von Aminosäuren und biogenen Aminen in fermentierten ...

3 OPTIMIERUNG DER HPLC- UND GC-METHODEN 50
Tab. 3-3: Nachweisgrenzen (NG) der einzelnen AS für die Analyse mittels
OPA/MPA-FMOC-Cl
AS NG AS NG AS NG AS NG
[pmol]
[pmol]
[pmol]
[pmol]
Asp 1,25 Gly 1,04 Gaba 0,19 Phe 0,22
Glu 0,83 Thr 0,62 Tyr 0,30 Leu 0,35
Asn 0,16 Cit 0,15 Val 1,12 Orn 0,73
Ser 0,91 Arg 0,31 Met 0,18 Lys 1,20
Gln 0,10 Ala 0,73 Ile 0,95 Pro 1,31
His 0,38 Tau 0,06 Trp 0,37
3.3 Chirale OPA/IBL(D)C-Methode
BRÜCKNER et al. [165,166] demonstrierten unter Verwendung von OPA und
N-Isobutyryl-L/D-Cystein (IBL/DC) als chirales Derivatisierungsreagenz und Fluores-
zenzdetektor (FLD) eine gut reproduzierbare Trennung. Die Methode ermöglicht die
Trennung aller proteinogenen L-Aminosäuren und der entsprechenden
D-Aminosäuren sowie Glycin und dem internen Standard L-Abu mit Ausnahme von
Prolin und Cyst(e)in mittels HPLC an einer konventioneller RP-18-Phase unter Ver-
wendung eines einfachen linearen Gradienten innerhalb von 75 min in einem chro-
matographischen Lauf. Die Derivate der L-Enan-tiomere der einzelnen AS nach De-
rivatisierung mit OPA-IBLC eluieren hierbei ausnahmslos vor den Derivaten der
D-Enantiomere (Abb. 3-5).
Bei Verwendung von IBDC anstelle von IBLC ergibt sich eine Elutionsfolgenumkehr
(Abb. 3-5), welche eine Absicherung der Untersuchungsergebnisse sowohl in quali-
tativer als auch in quantitativer Hinsicht erlaubt. Die hohe Empfindlichkeit des Fluo-
reszenzdetektors ermöglicht bei dieser Methode Nachweisgrenzen bis in den oberen
Femtomolbereich. Der Linearitätsbereich für quantitative Bestimmungen reicht hier-
bei von 1 pmol bis 1 nmol [165,166], so daß bei Relativquantifizierungen der Nach-
weis von 0,1 % einer D-AS neben dem jeweiligen L-Enantiomer innerhalb einer De-
tektorverstärkungsstufe möglich ist. Bei den in den Proben vorliegenden, oft sehr
unterschiedlichen Konzentrationsverhältnissen - vor allem zwischen den D- und